一种猪伪狂犬病病毒变异株XF‑1株及制备方法和应用

摘要

本发明涉及猪伪狂犬病毒技术领域，一种猪伪狂犬病病毒变异株XF‑1株及制备方法和应用，所述的变异株的保藏编号为:CCTCC NO V201654。本申请采用猪伪狂犬病病毒变异株（XF‑1株）制备成灭活疫苗进行安全性和免疫保护性试验，结果表明，猪伪狂犬病病毒变异株（XF‑1株）灭活疫苗安全性好，免疫保护效率也明显高于其它免疫组，证明该病毒株具有较好免疫原性，可用于该病的疫苗研究与开发，具有很好的疫苗开发前景。

说明书

技术领域

本发明主要涉及猪伪狂犬病灭活疫苗技术领域，特别涉及一种猪伪狂犬病病毒变异株XF-1株及制备方法和应用。

背景技术

伪狂犬病是由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的包括多种家畜和野生动物共患的一种急性传染病。猪是本病病毒的天然宿主和贮存者，本病以发热、奇痒、脑脊髓炎和严重的繁殖障碍为主要特征，从2011年以来全国多省份使用了gE基因缺失活疫苗免疫的规模化猪场母猪出现产弱仔猪、死胎、木乃伊、流产；后备母猪和空怀母猪常出现返情、屡配不孕或不发情的情况；公猪感染后常出现睾丸萎缩，性功能下降失去种用能力；新仔猪出现神经症状及死亡等疑似伪狂犬病的临床症状；育肥猪表现为呼吸道症状和增重滞缓，给养猪业造成较大的经济损失。因此，更多怀疑当前伪狂犬流行毒株是否发生变异，从而导致疫苗保护失效。这种猜测随后也被得到证实。华中农大、中国农大、南京农大、中国动物疫病控制中心等通过多项实验研究表明，新发生伪狂犬病是由新的毒株引起的。华中农业大学动物疫病诊断中心将全国各省份发病猪病料中分离的伪狂犬野毒进行基因测序，结果表明，当前分离的流行毒株在TK、gB、gE、gC等基因发生了多个碱基的标志性突变和连续性缺失，这些突变和缺失有可能是导致当前猪伪狂犬再次流行的一个重要原因。目前商品化疫苗免疫产生的抗体对目前流行毒株的中和能力要差。变异毒株的出现使得成年猪也表现出与仔猪相似的严重症状，猪场母猪、仔猪、育肥猪大量死亡，给该病的防控提出新的难题，给当今的养猪业也造成严重的经济损失。

预防该疾病最行之有效的办法是接种疫苗。目前，市售的猪伪狂犬病疫苗绝大多数为猪伪狂犬病常规灭活疫苗和弱毒疫苗。但由于流行毒株不断发生变异，与市售疫苗在免疫原性方面存在差异，导致传统毒株制备的疫苗不能很好的防控当今流行的猪伪狂犬病。因此，需要研究开发针对目前变异伪狂犬病毒的疫苗，是解决目前流行猪伪狂犬病的最佳途径。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种猪伪狂犬病病毒变异株XF-1株，该毒株已于2016年10月19日送至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCC NO:V201654，分类命名：猪伪狂犬病病毒XF-1株。地址：中国武汉武汉大学。

本发明的另一个目的在于提供了一种猪伪狂犬病病毒变异株XF-1株的制备方法，方法简单，易行，适用于大规模生产。

本发明的最后一个目的在于提供了一种猪伪狂犬病病毒变异株XF-1株的应用。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种猪伪狂犬病病毒变异株XF-1株，申请人从河南新乡市封丘县某猪场发病猪脑组织分离,获得一株野毒亲本株,命名为:XF株，通过基因测序分析，结果显示该毒株在gE/gC/gB等基因发生了多个碱基的标志性突变和连续性缺失，这些突变和缺失导致毒株的毒力和抗原发生改变。申请人采用同源重组的方法将野毒亲本株XF株的gE基因部分缺失，然后通过噬斑筛选纯化结合PCR扩增得到gE基因缺失的重组病毒。将纯化的重组病毒液直接免疫gB-ELISA和gE-ELISA抗体均为阴性仔猪，在免疫28天后，检测gE-ELISA抗体仍然为阴性。从而，进一步证实获得了纯净的gE基因缺失株，申请人将变异猪伪狂犬病野毒株XF株的gE基因缺失后的毒株命名为猪伪狂犬病病毒XF-1株(本发明或称为PRV XF-1株)。所述毒株已于2016年10月19日送至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCC NO:V201654，分类命名：猪伪狂犬病病毒XF-1株。地址：中国武汉武汉大学。

一种猪伪狂犬病病毒变异株XF-1株病毒液的制备方法，包括：

将XF-1株(病毒滴度≥10^8.0TCID50/ml)接种于BHK-21细胞悬液。病毒接种量为1.0％～3％(v/v)，控制培养温度36℃～37℃，pH6.0～7.0，搅拌转速80rpm～100rpm，溶解氧浓度40％～60％，至细胞病变达到85％时便获得猪伪狂犬病毒液。将培养好的XF-1株通过0.65μm中空纤维去除细胞碎片，然后再通过洗脱、浓缩，最后通过凝胶层析柱纯化即得到纯化的伪狂犬病毒抗原，即纯化的XF-1株病毒原液。

以上所述方法，优选的，BHK-21细胞悬液的制备方法包括：

将1000ml浓度为4.0-6.0×10⁶个/ml的BHK-21细胞悬液，接种于10L生物反应器中，加入含1％～3％(v/v)新生牛血清的BHK培养基8L，控制细胞培养温度36℃～37℃，pH>6个/ml，以便获得BHK-21细胞悬液。将上述获得BHK-21细胞悬液，接种于100L生物反应器中，加入含1％～3％(v/v)新生牛血清的BHK培养基80L，控制细胞培养温度36℃～37℃，pH>6个/ml，以便获得BHK-21细胞悬浮液。

一种猪伪狂犬病病毒变异株XF-1株的应用，包括利用本领域的常规方式将XF-1株制备成猪伪狂犬病病毒灭活疫苗；或是将XF-1株与其他毒株联合，制备成多联疫苗。

以上所述方法中，优选的，疫苗佐剂为兽医学可接受的水性佐剂，包括但不限于铝盐系列佐剂、Montanide IMS系列佐剂或Montanide GEL系列佐剂，蜂胶，免疫刺激复合物，细胞因子类佐剂，核酸及其衍生物类佐剂，卵磷脂类佐剂。所述Montanide IMS系列佐剂包括1313VG、251C VG、2215VG；所述Montanide GEL系列佐剂为GEL 01PR或Montanide PET GEL A；所述水包油性系列佐剂包括MF59、Montanide ISA15A VG等；所述细胞因子类佐剂包括白介素(IL-1、IL-2、IL-4、IL-12)，干扰素(IFN-γ、IFN-α、IFN-β)等；所述核酸及其衍生物类佐剂包括免疫刺激序列DNA(CpG DNA)或CpG寡聚脱氧核苷酸等。

以上所述方案中，优选的，所述疫苗为水包油性灭活疫苗，疫苗所用佐剂为IMS 1313VG。

本发明的二联灭活疫苗佐剂优选方式涉及为IMS1313N VG、IMS2215VG、Gel01、卡波姆、氢氧化铝胶的一种或几种的组合物。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)采用纯化后的猪伪狂犬病病毒变异株(XF-1株)制备成水包油型灭活疫苗，与鄂A株灭活疫苗、Bartha-K61活疫苗、HB-98株活疫苗进行猪体免疫保护试验，结果表明，猪伪狂犬病病毒变异株灭活疫苗(XF-1株)，不仅安全性好，而且免疫效力试验中保护效率明显高于其它免疫组。证明该病毒株具有较好免疫原性，可用于该病的疫苗研究与开发。

(2)采用法国进口MONTANIDE IMS 1313VG佐剂结合本发明的毒株制备成猪伪狂犬病灭活疫苗，对猪注射免疫过程中，猪体的应激反应小，因此，本发明的疫苗组合物安全性更佳，可以避免多次接种免疫出现的不良反应。该水性佐剂配制的疫苗具有独特的稳定性，在4℃、25℃和37℃放置都比其他疫苗要稳定；该水性佐剂配制的疫苗无副反应，注射部位无肉芽肿或炎症反应；该水性佐剂配制的疫苗免疫保护周期较长而且抗体水平较其他佐剂配制的疫苗高；

(3)本发明提供的二联灭活疫苗证实XF-1株可与其他本研究领域所熟知抗原制备成两种或两种以上疾病的联合疫苗。主要其方便、多效、低成本成为目前疫苗研究的方向。与单一疫苗相比，联合疫苗可以减少人工成本、减少疫苗的接种次数，降低猪因疫苗免疫产生的应激反应。

(4)本发明提供的二联疫苗改变了人们对猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒同时感染时的认识偏见，首次将猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒抗原按照合适的比例联合使用取得良好效果。

(5)猪伪狂犬病病毒变异株(XF-1株)改变以前传统培养工艺。全部采用悬浮培养工艺，通过悬浮培养高浓度抗原后再通过0.65μm孔径的中空纤维过滤去除细胞碎片，然后再洗脱、浓缩，最后通过凝胶柱层析纯化，得到高含量纯化抗原。

(6)本发明的猪伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型抗原组合物及使用该组合物制备的疫苗，预防和治疗猪伪狂犬病和猪圆环病毒病的感染，在预防和治疗猪圆环病毒2型疾病及猪圆环病毒2型亚临床感染的应用，可以有效防止猪圆环病毒2型亚临床感染向猪圆环病毒2型临床感染的转变，遏制病情的蔓延。

(7)本次发明采用水性佐剂组合物配制的疫苗，在免疫后产生的特异性抗体较快而且高，并且可以同时诱导体液免疫和细胞免疫。

(8)猪伪狂犬病与猪圆环病毒2型二联灭活疫苗制备方法简单，疫苗效价含量高，免疫方便快捷，与现有技术中的多次免疫，至少需要打2针或3针才能防治以上二种疾病的疫苗及其免疫方法相比，本发明仅免疫1次就能够预防猪伪狂犬病和猪圆环病毒病感染。二联灭活疫苗降低了免疫成本，减少了免疫程序同时减少猪因免疫造成的应激。

附图说明

图1为实施例2攻毒对照仔猪攻毒后死亡猪肉眼病变观察结果；

其中，a为肺脏；b为脑；c为肝脏；d为脾脏；e为肾脏。

图2为实施例3不同猪伪狂犬疫苗免疫后gB-ELISA平均抗体变化规律示意图。

图3为实施例7不同猪伪狂犬病病毒疫苗gB-ELISA平均抗体变化规律。

图4为实施例9不同猪圆环病毒疫苗平均抗体变化规律。

具体实施方式

本发明所述“每头份”或“/头份”是指每头猪每次所用疫苗剂量。未作特别说明之处，在本发明的实施方式中所述“每头份”或“/头份”均为2ml。

本发明所述技术方案中，如未特别说明，均为本领域的常规技术；所述试剂或材料，如未特别说明，均购自商业渠道。

乳化机：德国，型号：IKA公司RW20D型号

MONTANIDE IMS 1313VG佐剂购自法国SIPPEC公司，用0.22微米滤器过滤备用。

实施例1：

猪伪狂犬病病毒(XF-1株)液及疫苗的制备：

1、用生物反应器悬浮培养BHK-21细胞：

取液氮保存的BHK-21种子细胞5ml，37℃水浴迅速融化，1000rpm离心5分钟，弃去上清液，用含2％(v/v)低血清的BHK培养基100ml重悬，转移至250ml摇瓶中，于37℃恒温培养摇床培养、转速为80～100rpm/min下进行悬浮培养2天，至细胞密度达到2.0～4.0×10⁶个/ml时，按照1：4的比例，于37℃温度，80～100rpm转速下进行转种培养2～3天，将细胞扩增至1000ml体积，使细胞密度达到4.0～6.0×10⁶个/ml，以便获得BHK-21细胞悬液。

将上述获得的1000ml BHK-21细胞悬液，接种于10L生物反应器中，加入含2％(v/v)新生牛血清的BHK培养基8L，控制细胞培养温度36.5℃，pH 7.2，搅拌转速80rpm，溶解氧浓度45％，进行悬浮培养4天，至细胞密度达到3.4×10⁶个/ml，以便获得BHK-21细胞悬液。将上述获得BHK-21细胞悬液，接种于100L生物反应器中，加入含2％(v/v)新生牛血清的BHK培养基80L，控制细胞培养温度36.5℃，pH7.15，搅拌转速100rpm，溶解氧浓度45％，进行悬浮培养3天，至细胞密度达到4.5×10⁶个/ml，以便获得BHK-21细胞悬液。其中，所采用的BHK培养基购自北京天信和生物科技有限公司。

2、猪伪狂犬病病毒(XF-1株)的培养

将XF-1株(病毒滴度≥10^8.0TCID50/ml)接种于生物反应器中，病毒接种量为2.0％(v/v)，控制培养温度37℃，pH>

3、猪伪狂犬病病毒(XF-1株)的纯化

将培养好的猪伪狂犬病病毒(XF-1株)通过0.65μm中空纤维去除细胞碎片，然后再通过洗脱、浓缩，最后凝胶层析柱纯化即得到纯化的抗原。使纯化后的抗原毒价在10^7.5TCID50/ml以上，再加入终浓度为0.4％的甲醛溶液37℃灭活48h后，按现行《中国兽药典》附录进行检验合格后，4℃存放备用。

4、猪伪狂犬病灭活疫苗(XF-1株)的制备

将步骤3获得的猪伪狂犬病病毒(XF-1株)与IMS 1313VG佐剂按照质量比5:1进行乳化混匀30min，在乳化完成后分装、检验。检验按照《中国兽药典》附录进行，经检验合格后4℃保存备用，即得猪伪狂犬病灭活疫苗(XF-1株)，最终每2ml产品中猪伪狂犬病病毒的有效病毒含量为10^7.5TCID₅₀，每头猪每次免疫2ml。用于以下实施例。

实施例2：

猪伪狂犬病灭活疫苗(XF-1株)的免疫原性试验

1、材料与方法

1.1试验动物市场购买武汉某猪场21-25日龄的仔猪，对主要病原和相关抗体进行检测，选用对猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒病原为阴性和猪伪狂犬中和抗体阴性(PRV中和抗体效价不高于1:2)的仔猪，共计30头。

1.2攻毒毒株猪伪狂犬病毒野毒株(XF株)来源于武汉科前生物股份有限公司。

1.3方法将试验猪随机分成6组，每组5头，各组情况如下：

第1组为猪伪狂犬病灭活疫苗(XF-1株)，即选用实施例1制备的疫苗；

第2组为进口活疫苗(Bartha-K61株)，批号：77BN，市场购买西班牙海博莱生物大药厂；

第3组为猪伪狂犬病灭活疫苗(鄂A株)，批号：150601；

第4组为猪伪狂犬病活疫苗(HB98株)，批号：150612；

第5组为攻毒对照组；

第6组为空白对照组。

其中，第3组和第4组疫苗均为武汉科前生物股份有限公司提供。所有仔猪均按照1头份/头进行免疫。在免疫21天后，进行二免。在二免14天后采血，分离血清，进行中和指数测定。并对所有仔猪进行滴鼻攻毒，攻毒剂量1ml/头，攻毒毒株为猪伪狂犬病毒野毒株(XF株)，病毒毒价为10^7.0TCID50/ml。攻毒后隔离饲养，自由采食。每天观察实验猪发病症状(如精神萎靡，食欲不振，发热，神经症状，呼吸道症状与死亡等)，对死亡猪系统解剖后采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、淋巴结与脑组织。观察14天并记录体温、呼吸系统、消化系统、神经系统的临床反应。根据仔猪发病判断标准得出攻毒结果。

1.4攻毒后仔猪发病判断标准

⑴呼吸或消化系统临床症状打喷嚏、鼻有分泌物、呼吸困难；拉稀、呕吐。

⑵体温反应体温≥40.5℃，至少持续2天。

⑶神经系统临床症状痉挛、流涎、倒地划水、极度烦躁等典型临床症状

⑷死亡

符合以上第(3)、第(4)项或同时符合第(1)第(2)项，即可判断发病。

2、试验结果

2.1免疫后抗体水平测定由表1可知，在二免后猪伪狂犬病毒变异株(XF-1株)gB抗体和中和抗体明显高于其他免疫组，而gE抗体所有免疫组都为阴性。非免疫组gB、gE、中和抗体都为阴性。

2.2攻毒后临床症状由表1可知，在攻毒后第5组全部发病，其中死亡4头，而免疫组中除第1组外其他各组都有发病表现。其中，第2组2头、第3组2头、第4组1头实验猪出现发热(体温≥40.5℃)，精神沉郁，咳嗽，呼吸困难，神经症状与死亡等临床表现，而第1组实验猪精神状态良好，未见任何异常现象，攻毒保护率达100％。

2.3攻毒后死亡猪解剖症状(见图1)

表1不同毒株免疫后攻毒保护试验结果

注：*表示各疫苗株在攻毒后体温达到或超过40.5℃天数的百分比

从试验结果可以看出猪伪狂犬病毒变异株XF-1株中和抗体最高，其次是进口Bartha-K61株弱毒疫苗。从攻毒保护率看，猪伪狂犬病毒变异株XF-1株也是最高。因此，可以说明猪伪狂犬病毒变异株XF-1株更能有效抵抗针对目前猪场爆发变异猪伪狂犬病。

实施例3：

几种不同猪伪狂犬病疫苗抗体消长规律对比试验

1、试验材料与方法

1.1试验动物市场购买武汉某猪场21-25日龄的仔猪，对主要病原和相关抗体进行检测，选用对猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒病原为阴性和猪伪狂犬中和抗体阴性(PRV中和抗体效价不高于1:2)的仔猪，共计25头。

1.2猪伪狂犬病特异性阳性血清中和效价为1:256，由武汉科前生物股份有限公司提供。

1.3试验方法将试验猪随机分成5组，每组5头，分组情况如下：

第一组为猪伪狂犬病灭活疫苗(XF-1株)选用实施例1制备的疫苗；

第二组为进口活疫苗(Bartha-K61株)，批号：77BN市场购买西班牙海博莱生物大药厂；

第三组为猪伪狂犬病灭活疫苗(鄂A株)，批号：150601；

第四组为猪伪狂犬活疫苗(HB98株)，批号：150612；

第5组为空白对照组。

所有仔猪均按照1头份/头进行免疫。在免疫21天后，进行二免。免疫后，分别14天、28天、42天、56天、90天采血，分离血清。检测伪狂犬gB抗体和检测猪伪狂犬病中和抗体效价，计算转阳率，同时检测各免疫组在不同免疫时间平均中和抗体。

2、试验结果

2.1、猪伪狂犬病疫苗抗体消长规律对比试验结果(表2和图2)

表2猪伪狂犬病疫苗抗体消长规律对比试验结果

从表2上可以看出各组疫苗在免疫28天后，空白对照组抗体仍然为阴性，其它免疫组都可以产生较高的抗体水平。

试验结果可以说明：从抗体水平来看，无论是实施例1制备的疫苗，还是市场商品苗都可以产生较高的抗体水平。

2.2各免疫组免疫后不同时间中和抗体检测试验(见表3)

表3疫苗免疫后不同时间中和抗体检测试验结果

从表3结果可以看出，实施例1制备的疫苗和其它商品疫苗转阳率都是合格的，并没有明显差异。各组疫苗在免疫14天后转阳率已达到50％。在免疫28天后，各免疫组平均中和抗体基本无差异，转阳率100％。

实施例4：

猪伪狂犬病疫苗(XF-1株)安全性试验

1、试验材料与方法

1.1试验动物市场购买武汉某猪场21-25日龄的仔猪，对进行主要病原和相关抗体检测，选用对猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒病原为阴性和猪伪狂犬中和抗体阴性(PRV中和抗体效价不高于1:2)仔猪，共计20头。

1.2方法将试验猪随机分为4组，每组5头仔猪。其中组1为实施例1所制备的猪伪狂犬病灭活疫苗；组2为猪伪狂犬病灭活疫苗(鄂A株)，批号：150401；组3为猪伪狂犬病活疫苗(98株)，批号：150540；组4为空白对照。其中，组2、组3为武汉科前生物股份有限公司提供。组1和组2每头猪颈部肌肉注射2头份，组3按照说明书每头猪颈部肌肉注射10头份。观察14天并记录试验结果。

2结果所有免疫组无局部反应且全部健活。结果见表4。

表5疫苗安全性试验结果

从表5结果可以看出，各组全部5/5无不良反应，各疫苗均具有良好的安全性。

实施例5：

猪伪狂犬病病毒变异株XF-1株的应用：

猪圆环病毒2型-WH株疫苗的制备：

1、将长满单层的PK-15细胞(购自ATCC)，倒去细胞培养液，将PCV2毒种按0.1～0.2％的接种量接种于PK-15细胞上，种毒毒价为10^8.0TCID50/ml，37℃吸附30分钟，加入细胞维持液，置37℃旋转培养。每日观察1～2次，细胞生长良好，36～37℃培养4～7日后收获细胞培养物，冻融2-3次后，测定毒价结果为10^7.5TCID50/ml，将抗原置于-20℃以下保存。将培养好的病毒液通过中空纤维0.2μm滤柱过滤，除去细胞碎片再经洗脱、浓缩，最后再通过离子交换即可得到纯化的抗原。纯化后抗原毒价结果为10^7.5TCID50/ml以上，再加入终浓度为0.4％的甲醛溶液37℃灭活24h，按现行《中国兽药典》附录进行检验合格后，4℃存放备用。

2、将纯化后的猪圆环病毒2型抗原与IMS 1313VG佐剂按照质量比5:1进行乳化混匀30min，在乳化完后分装、检验。检验按照《中国兽药典》附录进行，经检验合格后4℃保存备用，即得猪圆环病毒2型灭活疫苗，最终每2ml产品中有效病毒含量为10^7.0TCID₅₀，每头猪每次免疫2ml。

猪伪狂犬病病毒与猪圆环病毒2型二联灭活疫苗的制备：

将灭活的猪伪狂犬病毒液(XF-1株)和猪圆环病毒2型-WH株(CCTCC NO：V201333)病毒液，按照毒价要求混合均匀，然后再和进口佐剂IMS1313N VG按照质量比5：1进行乳化30分钟。即可得到猪伪狂犬病与猪圆环病毒2型二联灭活疫苗(以下简称为二联疫苗)，最终使得每2ml成品苗中猪伪狂犬病毒抗原含量为10^7.5TCID50，猪圆环病毒2型抗原含量为10^7.0TCID50，每头猪每次免疫2ml。

实施例6：

猪伪狂犬病与猪圆环病毒2型二联灭活疫苗免疫效力验证：

1试验材料

1.1试验动物市场购买武汉某猪场21-25日龄的仔猪，对主要病原和相关抗体进行检测，选用对猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒病原为阴性和猪伪狂犬中和抗体阴性(PRV中和抗体效价不高于1:2)的仔猪，共计42头。

1.2试验用疫苗：

组A为实施例5所制备的二联疫苗；

组B为实施例1所制备的猪伪狂犬病病毒灭活疫苗(XF-1株)；

组C为实施例5所制备的猪圆环病毒2型灭活疫苗。

1.3攻毒用毒株猪伪狂犬病毒野毒株(XF株)；猪圆环病毒攻毒用毒株为猪圆环病毒2型-WH株，CCTCC NO：V201333。均来源于武汉科前生物股份有限公司。

2试验方法

2.1试验分组将试验猪随机分为6组，分组情况如下：

组A为实施例5所制备的二联灭活疫苗疫苗，共12头仔猪；

组B为实施例1所制备的猪伪狂犬病灭活疫苗(XF-1株)，共6头仔猪；

组C为实施例5所制备的猪圆环病毒2型灭活疫苗，共6头仔猪；

组D为猪伪狂犬病毒攻毒对照组，共6头猪；

组E为猪圆环病毒2型攻毒对照组，共6头仔猪。

组F为非免疫空白对照组，共6头仔猪。作为阴性对照，需要隔离饲养。

2.1.1猪伪狂犬病毒攻毒部分

(1)将二联灭活疫苗和猪伪狂犬病灭活疫苗(XF-1株)，分别每头猪颈部肌肉免疫1头份。免疫28天后攻毒。其中，从组A免疫组12头中，随机挑选6头攻猪伪狂犬病毒，组B6头全部攻猪伪狂犬病毒。每头仔猪滴鼻攻毒猪伪狂犬病毒野毒株(XF株)病毒液1.0ml，病毒液的毒价为10^7.0TCID50/ml，观察14天。观察并记录呼吸系统、消化系统、神经系统的临床反应，并测体温14天。根据仔猪发病判断标准得出攻毒结果。

(2)攻毒后仔猪发病判断标准

⑸呼吸或消化系统临床症状打喷嚏、鼻有分泌物、呼吸困难；拉稀、呕吐。

⑹体温反应体温≥40.5℃，至少持续2天。

⑺神经系统临床症状痉挛、流涎、倒地划水、极度烦躁等典型临床症状

⑻死亡

符合以上第(3)、第(4)项或同时符合第(1)第(2)项，即可判断发病。

2.1.2猪圆环病毒攻毒部分

(1)将二联灭活疫苗和猪圆环病毒2型灭活疫苗，分别每头猪颈部肌肉注射免疫1头份。免疫28天后攻毒。对猪圆环病毒免疫组和攻毒对照组，各组同时进行PCV2病毒WH株(病毒含量为10^7.0TCID₅₀/ml，CCTCC>

(2)攻毒后仔猪发病判断标准，符合以下三项中的两项，即可判定发病。

A体温症状：仔猪体温升高(≥40℃)，应至少持续3天；

B体重标准：相对增重率下降应不低于5.0％，攻毒仔猪的平均日增重应小于非攻毒对照组仔猪的平均日增重。于攻毒当日分别逐头称量所有试验仔猪体重，攻毒后28日再次称量所有试验仔猪体重；其中，“B体重标准”中相对增重率的计算按如下公式进行：

相对增重率(％)＝非攻毒对照组仔猪平均日增重-攻毒组仔猪平均日增重/攻毒对照组仔猪平均日增重×100

C病毒抗原检测：用免疫组化技术检测淋巴结组织，检测到PCV2病毒。

3试验结果

3.1二联灭活疫苗和猪伪狂犬病灭活疫苗(XF-1株)的攻毒保护对比试验结果(见表6)

3.2二联灭活疫苗和猪圆环病毒2型灭活疫苗的攻毒保护对比试验结果(见表6)

表6各疫苗组效力检验结果

猪伪狂犬病毒攻毒试验部分：免疫A组和免疫B组仔猪攻毒后观察均未发现临床症状。而攻毒对照组D有4头，均出现体温升高、精神萎靡、食欲减退、呼吸困难等症状。在发病的4头仔猪中，有3头死亡。

猪圆环病毒攻毒试验部分：免疫A组和免疫C组仔猪攻毒后观察均未发现临床症状。而攻毒对照组E6头仔猪都有不同程度发病。

试验结果表明，(见表6)，各疫苗均有免疫保护效果，可以抵抗PRV的攻击和PCV2的攻击。同时，二联灭活疫苗与单苗的免疫试验比较我们不难发现，二联疫苗的免疫效果与各自单苗的免疫效果基本相当。从而进一步证实，两种病毒抗原同时免疫接种动物时，二者特异性抗体的产生没有相互干扰作用。进一步的攻毒试验证实，二联灭活疫苗具有与各自单苗相同的抵抗强毒攻击的效力。

实施例7：

几种不同猪伪狂犬病疫苗抗体检测对比试验

2、试验材料

1.1试验动物市场购买武汉某猪场21-25日龄的仔猪，对主要病原和相关抗体进行检测，选用对猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒病原为阴性和猪伪狂犬中和抗体阴性(PRV中和抗体效价不高于1:2)的仔猪，共计25头。

1.2猪伪狂犬病特异性阳性血清中和效价为1:256，由武汉科前生物股份有限公司制备

1.3试验用疫苗实施例5制备的二联疫苗；实施例1制备的猪伪狂犬病灭活疫苗(XF-1株)；猪伪狂犬病活疫苗(98株)，批号：150540，由武汉科前股份有限公司提供；进口Bartha-K61株活疫苗，批号：77BN市场购买西班牙海博莱生物大药厂

2、试验方法

将试验猪随机分为5组，每组5头仔猪。分组情况如下：

组1为实施例5制备的二联疫苗；

组2为实施例1制备的猪伪狂犬病单苗(XF-1株)；

组3为猪伪狂犬活疫苗(98株)活疫苗，批号：150540；

组4为进口Bartha-K61株活疫苗，批号：77BN；

组5为空白对照。

各免疫组每头猪颈部肌肉免疫1头份。免疫后，分别14天、28天、42天、56天、90天采血分离血清。检测猪伪狂犬抗体和检测猪伪狂犬病毒中和抗体效价，计算转阳率，同时检测各免疫组在不同免疫时间平均中和抗体。

3、试验结果

3.1、猪伪狂犬病疫苗抗体消长规律对比试验结果(表7和图3)

表7猪伪狂犬病疫苗抗体消长规律对比试验结果

从表7可以看出，本发明制备的二联灭活疫苗和猪伪狂犬病灭活疫苗(XF-1株)，在免疫抗体水平上没有明显差异。从表7上可以看出各组疫苗在免疫28天后，空白对照组仍然为阴性，其它免疫组都可以产生较高的抗体水平。

试验结果可以说明：从抗体水平来看，无论是二联疫苗还是猪伪狂犬病单苗(XF-1株)，还是市场购买的商品苗都可以产生较高的抗体水平。

3.2各免疫组在不同免疫时间中和抗体检测试验(见表8)

表8疫苗免疫不同时间中和抗体检测试验结果

从表8结果可以看出，所有疫苗转阳率都是合格的，并没有明显差异。各组疫苗在免疫14天后转阳率已达到50％。在免疫28天后，各免疫组平均中和抗体基本无差异，转阳率100％。总体来说，本发明制备的二联苗是有效的。

实施例8：

二联苗对猪圆环病毒2型有效性的验证

猪圆环病毒2型疫苗抗体消长规律对比试验

1、材料与方法

1.1试验动物 市场购买武汉某猪场21-25日龄的仔猪，对主要病原和相关抗体进行检测，选用对猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒病原为阴性和猪伪狂犬中和抗体阴性(PRV中和抗体效价不高于1:2)的仔猪，共计30头。

1.2方法 将购回30头抗体为阴性的猪，随机分为6组，每组5头，分组情况如下：

组1为实施例5制备的二联灭活疫苗；

组2为实施例5制备的猪圆环病毒2型灭活疫苗；

组3为武汉科前提供商品化的猪圆环病毒2型灭活疫苗；

组4为市场购买进口商品苗；

组5为市场购买国产商品苗；

组6为空白对照组(即非免疫组)。

按照说明书每头猪免疫1头份，组1—组5经颈部肌肉免疫1头份疫苗。免疫后，观察临床表现，并按照要求定期采血检测抗体。

1.3检测试剂盒 猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒由武汉科前生物股份有限公司诊断试剂部提供。

2、试验方法

2.1所有试验猪免疫前和免疫后第7天、第14天、第28天、第60天、第90天、120天对每组仔猪采血，分离血清用ELISA方法检测抗体水平。

2.2抗体检测方法

严格按照猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒使用说明书进行检测。

2.3判定标准

在酶标仪上测定各孔OD_630nm值。试验成立条件为阳性对照孔OD_630nm值应≥1.0，阴性对照孔OD_630nm值应≤0.25。样品孔OD_630nm值≥0.40时，判定为阳性；样品孔OD_630nm值≤0.40时，判定为阴性。

3、试验结果 抗体检测结果(详见表9和图4)

表9不同猪圆环病毒疫苗免疫后抗体检测结果

从表9结果可以看出，二联疫苗和实施例5制备的猪圆环病毒2型疫苗疫苗，在免疫后检测的抗体和市场购买的商品苗检测的抗体水平没有显著差异。并在免疫14天后，抗体全部转阳。在免疫42天到56天时，抗体水平达到最高。各疫苗组在免疫4个月后出个别猪外抗体仍为阳性。总体来说，二联疫苗具有很好的免疫效果。

实施例9：

猪伪狂犬病毒与猪圆环病毒2型二联灭活疫苗安全性试验

1材料与方法

1.1试验动物 市场购买武汉某猪场21-25日龄的仔猪，对进行主要病原和相关抗体检测，选用对猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒病原为阴性和猪伪狂犬中和抗体阴性(PRV中和抗体效价不高于1:2)仔猪，共计20头。

1.2方法

将试验猪随机分4组，5头/组。取实施例5制备的二联灭活疫苗、PCV2苗和实施例1制备的PRV苗和生理盐水对照组各颈部肌肉注射，2头份/头，观察14天。

2结果 所有试验猪均无局部反且全部健活。检验结果见表10.

表10疫苗安全性试验结果

从表10结果可以看出，二联灭活疫苗和实施例1制备XF-1株单疫苗在接种仔猪后，全部5/5无不良反应，各疫苗均具有良好的安全性。