Bartha-k61株疫苗对猪伪狂犬病病毒变异株的免疫保护及变异株生物学特性的初步研究

摘要

伪狂犬病是由伪狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV)引起的一种重要传染病，PRV属于疱疹病毒科，α-疱疹病毒亚科，其学名为猪疱疹病毒1型(suid herpesvirus1，SuHV-1)，又名奥耶斯基氏病病毒(Aujeszky's Disease virus，ADV)，目前该病毒仅有一个血清型。众所周知，疫苗免疫是预防和控制该病的重要手段。
　　包括欧洲在内的一些国家已经从家猪中成功净化PRV，近年仍有在已经净化国家的野猪中发生PR的报道。
　　在中国，从2011年开始，猪伪狂犬病再次在Bartha-k61株疫苗免疫的猪场发生，感染后的主要临床症状有高热、呼吸衰竭、腹泻、精神沉郁、厌食、神经症状等，造成新生仔猪50％及以上的死亡率，保育和育肥猪亦可见10-30％的死亡。发病猪场血清学检测结果显示，发病猪场猪伪狂犬病病毒gE抗体阳性率超过50％。该病在中国多地发生，给中国养猪业带来严重的损失。对分离的猪伪狂犬病病毒进行分析，结果显示该病毒较之前的分离株发生抗原变异且对小鼠和不同日龄的猪均有较高的毒力。
　　目前对变异株毒力增强的机制还不清楚，本研究以本室分离的变异株为研究对象，对病毒的生物学特性、全基因组序列以及感染PK-15细胞的转录组学进行研究，为了解变异株毒力增强机制提供参考，同时也对中国猪伪狂病的防控具有实际意义。
　　1、猪伪狂犬病病毒的分离及鉴定
　　2014-2016年间，从江苏和上海地区的疑似发病猪的病料中共分离和鉴定出5株猪伪狂犬病病毒变异株，分别命名为X J5、CM、NT、HA和TX，通过PCR、IFA和电镜观察等对病毒进行了鉴定。通过对5个毒株的5个糖蛋白基因gE、gC、gI、gD、gB和毒力基因TK的全序列分析，显示5个分离株的序列同源性较高。依据gE基因和gC基因构建遗传进化树，结果表明5个分离株与HeN1、JS-2012等毒株遗传进化距离较近，属于同一分支。5株病毒对小鼠的LD50测定结果显示，XJ5、CM、NT、HA和TX的LD50分别为102、1025、102、1049和1039TCID50，表明尽管5个分离株在遗传进化距离相似，但不同毒株对小鼠的毒力存在差异，预示分离毒株的毒力存在多样性。
　　2、Bartha-k61株疫苗对猪伪狂犬病病毒变异株和经典株的免疫保护试验
　　2011年以来，猪伪狂犬病在中国许多大型养殖场重新爆发，给中国的的养猪业带来严重经济损失。已有研究表明，造成本次大规模爆发的重要原因是出现了猪伪狂犬病病毒变异株，且变异株出现了抗原变异和毒力的增强。因此，采取有效的措施进行现行猪伪狂犬病的防控成为关注的热点。尽管该病在许多规模化猪场爆发，但仍有部分猪场未见发病。为解决免疫用疫苗的问题，在实验室进行了Bartha-k61株疫苗对生长猪的免疫攻毒试验，比较了一次免疫和两次免疫对PRV变异株(XJ5)和经典株(Ra)的交叉免疫保护效果。通过检测免疫后的血清抗体以及攻毒后各组猪的临床症状、存活率、增重变化、排毒、大体病理学和组织病理学研究等，综合评价了弱毒疫苗B artha-k61株在不同免疫程序下的免疫保护效果。结果表明，弱毒疫苗B artha-k61株无论是一次免疫还是两次免疫，对变异株和经典株均有良好的保护。仅在增重上，两次免疫较一次免疫有显著差异(p＜0.01)。由此，认为，在基于当前变异株的疫苗上市前，B artha-k61株疫苗仍然是控制当前猪伪狂犬病的理想选择。
　　3、不同猪伪狂犬病病毒感染小鼠的组织分布及致病性比较
　　前期的研究结果表明，尽管不同PRV变异株遗传进化距离相近，但不同毒株表现出不同的毒力。本研究首先对8个猪伪狂犬病病毒变异株、经典株进行BamHⅠ酶酶切的限制性片段长度多态性分析以及gE基因和gC基因遗传进化关系分析，结果显示8个毒株存在基因组的差异，而且遗传进化上属于不同的分支，其中变异株X J5、CM、NT、HA和TX遗传进化较近，属于同一分支，经典株JSZ和Ra遗传进化相近，属于同一小分支，Su株（前苏联毒株）与国外分离株相近。通过比较8个病毒在PK-15细胞上的一步生长曲线，结果显示8株病毒在PK-15细胞上的生长动力学相似。为探讨不同PRV分离株毒力差异是否与在组织中的定殖和分布有关，模拟自然感染的方式，用上述毒株鼻腔接种Balb/c小鼠，通过临床症状观察、小鼠存活率、平均存活时间以及不同组织中病毒核酸拷贝数比较不同毒株之间的差异。结果显示，病毒主要在小鼠的肺脏和脑部定殖，其次是心脏和肝脏，脾脏和肾脏含量最少;另外HA株对小鼠毒力最弱，且其在脑、肺脏、肝脏、心脏组织中的病毒载量也明显低于其他受试毒株，提示毒力弱的PRV毒株其在动物体内的定殖能力亦较弱。
　　4、猪伪狂犬病病毒变异株(XJ5)和经典株(Ra)的全基因组测序
　　猪体攻毒试验结果表明，PRV变异株(XJ5)与经典株(Ra)的毒力存在较大差异。为了探究2株病毒毒力差异在基因组水平的机制，采用高通量测序手段对2株病毒的基因组全序列进行测定。利用Illumina HiSeq2500进行测序，通过组装和拼接获得没有Gap的全长序列，其中X J5株基因组全长为141.955kb，GC含量为73.79％;Ra株基因组全长为143.227kb，GC含量为73.66％。通过基因预测软件分析，XJ5的基因组共预测到76个基因，编码基因的总长度为106185bp，Ra的基因组共预测到83个基因，编码基因长度为105489bp，即2个毒株均存在40kb左右的非编码序列。通过重复序列检测软件分析，发现2个毒株的基因组中存在大量重复序列，既有散在重复序列，又有串联重复序列，占整个基因组的10％左右。同时，用Sanger测序法对2个病毒的6个基因的全序列进行验证，结果表明高通量测序结果可靠。比较已有毒株之间的全基因组序列相似度，结果显示J5株与HeN1株的序列相似度最高，为99.5％，而与Ra株的序列相似度为98.81％。通过对编码基因的分析发现，XJ5株与Ra株相比，主要的变异发生在US1、UL36和IE180区域。基于病毒的全基因组序列，构建遗传进化发生树，结果显示J5株的遗传进化关系与Ea株最相近;而Ra株的遗传进化关系与HLJ8株最接近。全基因组的遗传进化结果表明，中国当前流行的PRV变异毒株具有多样性。
　　5、猪伪狂犬病病毒变异株X J5感染PK-15细胞的转录组学
　　为了解PRV变异株XJ5感染宿主细胞过程中与宿主细胞之间的相互作用，本研究用分离的变异株J5感染PK-15细胞，起始感染复数MOI=5，分别提取感染后6h和感染后12h以及未感染组的细胞总RNA，利用Illumina HiSeq2500进行转录组测序。测序结果显示，感染后6h与未感染组相比，共筛选到1576个差异表达基因，其中上调基因944个，下调基因632个;感染后12h与未感染组相比，共筛选出84个差异基因，其中上调基因78个，下调基因6个。通过KEGG通路分析，感染后6h与未感染对照组相比差异表达基因被富集到258条信号通路上，富集基因数量较多的通路有新陈代谢通路(Metabolic pathways)、肿瘤坏死因子信号通路(TNF signaling pathway)、氧化磷酸化通路(Ox1dative phosphorylation)、黏着连接(Adherens junction)通路、帕金森病(Parkinson's disease)通路等;感染后12h与未感染对照组相比差异表达基因共富集到89条信号通路上，富集基因数量较多的通路有新陈代谢通路(Metabolic pathways)、氧化磷酸化通路(Oxidative phosphorylation)、帕金森病(Parkinson's disease)通路、阿尔兹海默症(Alzheimer's disease)通路、心肌收缩(Cardiac muscle contraction)通路等。为了验证RNA-seq数据的准确性，选择感染后6h与未感染对照组相比上调表达的10个基因进行qRT-PCR验证，结果显示，RNA-seq的结果与qRT-PCR具有良好的一致性。为今后研究变异株的毒力增强机制及宿主细胞应答的机理提供参考。

目录

摘要

符号说明

综述一 猪伪狂犬病研究进展

1 流行病学

2 病原学

3 PRV的致病性

4 临床症状及病理学变化

5 伪狂犬病的诊断

6 伪狂犬病的免疫防控

参考文献

综述二 高通量测序技术在伪狂犬病病毒研究中的应用

1 二代测序技术简介

2 高通量测序技术在兽医学中的应用

3 二代测序技术在伪狂犬病病毒研究中的应用

参考文献

第一章 猪伪狂犬病病毒变异株的分离及鉴定

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

第二章 Bartha-k61 株疫苗对猪伪狂犬病病毒变异株和经典株的免疫保护试验

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

第三章 不同猪伪狂犬病病毒感染小鼠的组织分布及致病性比较

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

第四章 猪伪狂犬病病毒变异株XJ5和经典株Ra的全基因组测序

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

第五章 猪伪狂犬病病毒变异株XJ5感染PK-15细胞的转录组学

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

全文小结

附录

致谢

攻读博士期间发表的学术论文

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