一种黄鳝醛酮还原酶基因及其体外表达方法

摘要

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种黄鳝醛酮还原酶基因，其核苷酸和氨基酸序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。本发明采用分子生物学和基因工程的方法，构建了黄鳝Eakr基因的重组表达载体，诱导表达，亲和层析获得纯化的重组表达蛋白。黄鳝Eakr重组蛋白能够催化丙酮醛、丙酮、黄体酮和甲睾酮等不同底物，对醛酮还原酶的工业化应用具有理论指导意义和应用参考价值。另外，本发明还提供一种黄鳝醛酮还原酶基因体外表达方法。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体的说，涉及一种黄鳝醛酮还原酶基因及其体外表达方法。

背景技术

醛酮还原酶(Aldo-keto reductase，AKR)广泛存在于生物界，是一类依赖于NAD(P)H的分子量为34kDa-37kDa的单体还原酶蛋白。

现报道的AKR超家族成员有16个亚家族共190多个成员，包括醛糖还原酶、酮还原酶、羟化类固醇脱氢酶、2，5-二酮基-D-葡萄糖酸还原酶、多元醇脱氢酶、二氢二醇脱氢酶等多种能够代谢机体羰基化合物的酶类。

在结构上，AKR超家族都包含一个(α/β)₈的桶状结构、相似的辅酶结合结构域和一个高度保守的Asp，Tyr，Lys，His催化四分体。在功能上，AKR不仅在生物体应对外源性或内源性羰基化合物解毒过程中具有重要作用，还参与了生物体内氧化应激、致癌化合物的降解、糖尿病并发症及肿瘤发生等过程。

通过辅酶NAD(P)H提供还原力，AKR可以将醛酮类化合物通过加氢的方式还原成相对应的醇类化合物，从而降低毒害作用。其底物包括脂肪类醛酮化合物、芳香类化合物、醛糖、儿茶酚胺、甾类、视黄醛、前列腺素、黄曲霉素等。研究发现，AKR除了参与机体的疾病发生过程，还作为重要的防御酶存在。AKR抑制剂在癌症及糖尿病并发症临床治疗等方面具有重要的意义，目前已成为研究的热点。

相比哺乳动物，对于鱼类AKR的研究报道较少。国外有学者研究了苯并芘(BaP)处理罗非鱼后其肝组织AKR1A1基因的表达情况，认为罗非鱼的AKR1A1可能在BaP解毒过程中具有重要的作用。除此之外，其它鱼类的AKR基因及其功能的研究国内外尚无报道。

从黄鳝(Monopterus albus)中克隆到醛酮还原酶(Eakr)基因，对其进行体外表达，对于进一步探索鱼类醛酮还原酶基因的功能具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种其能表达出大量高质量的黄鳝Eakr蛋白的黄鳝醛酮还原酶基因及其体外表达方法。

一种黄鳝的醛酮还原酶基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1。

一种如上所述的黄鳝的醛酮还原酶基因所编码的氨基酸序列，其序列编号为SEQ ID NO：2。

一种黄鳝Eakr基因的体外表达方法，包括以下步骤：

步骤(1)黄鳝Eakr基因的克隆：

按照Trizol试剂说明书提取黄鳝总RNA，用M-MLV反转录酶合成cDNA第一链，于-80℃保存；根据GenBank数据库中已报道的AKR基因序列，设计第一对特异性引物，进行PCR扩增，获得黄鳝Eakr基因cDNA片段；根据Smart RACE试剂盒说明书，进行5’RACE-PCR和3’RACE-PCR扩增，获得黄鳝Eakr基因cDNA片段的5’末端和3’末端，拼接获得黄鳝Eakr基因全长cDNA序列；黄鳝Eakr基因的核苷酸和氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；

步骤(2)黄鳝Eakr基因原核表达载体的构建：

根据黄鳝Eakr基因全长cDNA序列，设计第二对特异性引物re-ex-F和re-ex-R，分别在上、下游引物添加了EcoR I和Hind III酶切位点；以黄鳝cDNA为模板，re-ex-F和re-ex-R为引物，进行PCR扩增；将PCR产物和pET-28a(+)表达载体进行双酶切，回收纯化，连接转化大肠杆菌DH5α，获得原核表达载体pET-Eakr；

步骤(3)黄鳝Eakr重组蛋白的诱导表达和纯化：

将步骤(2)得到的原核表达载体pET-Eakr转化大肠杆菌BL21(DE3)，在含有50mg/L卡那霉素的LB培养液中培养至OD值为0.6时，加入IPTG进行诱导；离心收集菌体，超声破碎，然后加入5×上样缓冲液进行12％SDS-PAGE电泳检测目标蛋白的表达情况；以1％的接种量将能表达重组蛋白的BL21添加到含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，大量培养，诱导表达；将诱导好的菌液离心，收集菌体超声波破碎，再离心收集沉淀；将沉淀用平衡缓冲液溶解，收集上清，上样、结合、洗脱、透析，获得纯化的黄鳝Eakr重组蛋白；用BCA法测蛋白浓度，SDS-PAGE电泳检测纯化的黄鳝Eakr重组蛋白。

本发明与现有技术相比具有如下有益效果：

1)本发明采用分子生物学的方法，首次分离鉴定了黄鳝醛酮还原酶基因；

2)利用基因工程技术，构建了黄鳝Eakr基因原核表达载体，并纯化了其表达蛋白，为进一步制备抗体奠定基础；

3)黄鳝Eakr重组蛋白能够催化丙酮醛、丙酮、黄体酮和甲睾酮等不同底物，对醛酮还原酶的工业化应用具有理论指导意义和应用参考价值。

附图说明

图1为菌液PCR扩增和双酶切验证重组质粒的琼脂糖凝胶电泳检测图；

图2为黄鳝Eakr基因小量表达和重组蛋白纯化后的常规SDS-PAGE电泳检测图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

为本发明实施方式提供一种黄鳝的醛酮还原酶基因的体外表达方法，其包括以下步骤：

步骤1黄鳝Eakr基因的克隆：

按照Trizol试剂说明书提取黄鳝总RNA，利用M-MLV反转录酶合成cDNA，cDNA第一链的合成根据Smart RACE试剂盒说明书进行，于﹣80℃低温保存。根据GenBank数据库已报道的AKR基因序列进行同源比对，设计特异性引物AKR-F(5’-ACATCCAGACCAGCGACCTGCA-3’)和引物oligod(T)(5’-TGCCGAATCTTTTTTTTTTTTTAGC-3’)。以黄鳝cDNA第一链为模板，进行PCR扩增，获得黄鳝Eakr基因cDNA片段；特异性引物AKR-F与oligod(T)的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。

PCR反应体系(25μL)

组成体积(μL)ddH₂O16.210×buffer2.5dNTP2AKR-F1oligod(T)1DNA2TaqE0.3

PCR反应程序：

根据所得黄鳝Eakr基因cDNA片段，设计特异性引物AKR-GSP5(5’-GTATCTCTTGTCGCTATAGTCCCACCAGTG-3’)和AKR-GSP3(5’-TGTGGGCTGCAGGCTAGGTGTCGC-3’)，特异性引物AKR-GSP5与AKR-GSP3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。

按照Smart RACE试剂盒说明书进行5’RACE和3’RACE扩增，获得黄鳝Eakr基因cDNA片段的5’末端和3’末端。将黄鳝Eakr基因的5’末端和3’末端进行拼接，获得其cDNA全长序列。黄鳝Eakr基因的核苷酸和氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

5’RACE-PCR扩增的反应体系为(50μL)：

组成体积(μL)PCR-grade water3510×BD Advantage buffer 2PCR buffer5dNTP Mix(10mM)1μPM5GSP15’-RACE-Ready cDNA2150×BD Advantage 2Polymerase Mix1

3’RACE-PCR扩增的反应体系为(50μL)：

反应条件为：

步骤2黄鳝Eakr基因原核表达载体的构建：

根据黄鳝Eakr基因的cDNA序列，设计特异性引物re-ex-F(5’-GCCGAATTCATGCCTGTGGTTCCCAAAG-3’)和re-ex-R(5’-CCGAAGCTTTTAGCTCCTGTACTCATCGC-3’)，分别在上、下游引物添加了EcoR I和Hind III酶切位点。以黄鳝cDNA为模板，采用引物re-ex-F和re-ex-R扩增黄鳝Eakr基因的成熟肽片段。特异性引物re-ex-F与re-ex-R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。

PCR反应体系(25μL)：

反应条件为：

将PCR产物与原核表达载体pET-28a同时进行EcoR I和Hind III双酶切，分别用DNA凝胶回收试剂盒纯化酶切产物，经T4DNA连接酶连接后转化大肠杆菌DH5α，在含有卡那霉素(50μg/mL)的平板上进行抗性筛选。挑取阳性克隆接种到LB液体培养基中进行培养，37℃、220r/m，培养8h后用质粒提取试剂盒提取质粒，采用质粒PCR和双酶切的方法验证重组质粒。验证结果如图1所示，已成功构建原核表达载体，命名为pET-Eakr；其中M为DNA分子量标准；1为PCR扩增结果；2为双酶切结果。

步骤3黄鳝Eakr重组蛋白的表达和纯化：

黄鳝Eakr重组蛋白的诱导表达：取1ng原核表达载体pET-Eakr转化大肠杆菌BL21(DE3)，涂布于含50μg/mL的卡那霉素平板上进行抗性筛选，培养温度为37℃，培养时间为过夜培养。筛选结束后转至LB培养基(含卡那霉素50μg/mL)中培养，培养条件为37℃，200r/min。菌体进入指数生长期后加添加IPTG至终浓度0.1mmol/L，进行IPTG诱导培养3小时后离心收集菌体沉淀，超声波破碎，加入5×上样缓冲液进行12％常规SDS-PAGE电泳检测重组蛋白的表达情况。常规SDS-PAGE电泳检测重组蛋白的表达结果如图2所示，重组蛋白分子量为37.7kDa。

黄鳝Eakr重组蛋白的纯化：将上述经过IPTG诱导的菌液按照1：100的比例接种到500mL LB培养基(含卡那霉素50μg/mL)中进行扩大培养，培养条件为37℃，200r/min培养时间为过夜培养。培养结束后，离心收集菌体沉淀，用50mmol/L的PBS(pH 8.0)悬浮菌液，进行超声波破碎并收集沉淀部分，用裂解缓冲液(6mol/L盐酸胍，10mmol/L咪唑，50mmol/L PBS pH＝8.0)洗涤3次。加入适量裂解缓冲液溶解，对上清液进行过滤；滤液用1mL的亲和层析镍柱His-Binding-Resin进行纯化；纯化后的蛋白用不同浓度的盐酸胍缓冲液进行透析复性，盐酸胍缓冲液浓度为6、3、1.5、0.5、0.1mol/L，用透析袋浓缩透析液；将收集到的黄鳝Eakr蛋白用BCA法测蛋白浓度，并用常规SDS-PAGE法，检测重组蛋白的条带大小，检测结果如图2所示。结果表明，黄鳝Eakr重组蛋白为单一条带，分子量为37.7kDa；其中M为DNA分子量标准；CK1为阴性对照；CK2为阳性对照；1为重组质粒pET-Eakr小量诱导产物；2为纯化的黄鳝Eakr蛋白。`

步骤4黄鳝Eakr重组蛋白活性的测定：

醛酮还原酶的酶活单位定义：在一定条件下,在37℃下，1min消耗1μmol NADH/NADPH称为一个酶活单位(U)。酶比活力是指每毫克质量的蛋白质中所含酶的催化活力。

U(酶活力)＝ΔA*V/6.22

U/mg(酶比活力)＝ΔA*V/(6.22*M)

ΔA为1min内340nm处吸光度的变化，V为反应液体系(mL)，M为酶液中蛋白质的质量(mg)，6.22为摩尔吸收系数(L/mL/cm)

酶活测定的方法：先加好PBS、底物和甲醇，37℃水浴5min，再加入Eakr重组蛋白和辅酶，340nm处检测吸光度随时间的变化值。体系为：1000μL PH7.4 100mMPBS,850μL底物，80μL甲醇，50μL酶液(约0.014mg),20μL辅酶(10mg/mL)。

对不同底物的酶活测定结果如表1所示，黄鳝Eakr重组蛋白对丙酮醛、丙酮、黄体酮等的酶比活力较高，而对十二酸甲睾酮和葡萄糖则没有活力。本实施方式中，所述底物为丙酮醛、丙酮、黄体酮和甲睾酮中的至少一种。

表1黄鳝Eakr重组蛋白对不同底物的酶比活力

本发明与现有技术相比具有如下有益效果：

1)本发明采用分子生物学的方法，首次分离鉴定了黄鳝醛酮还原酶基因；

2)利用基因工程技术，构建了黄鳝Eakr基因原核表达载体，并纯化了其表达蛋白，为进一步制备抗体奠定基础；

3)黄鳝Eakr重组蛋白能够催化丙酮醛、丙酮、黄体酮和甲睾酮等不同底物，对醛酮还原酶的工业化应用具有理论指导意义和应用参考价值。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

<110> 长江大学

<120> 一种黄鳝醛酮还原酶基因及其体外表达方法

<160> 8

<210> 1

<211> 1320

<212> DNA

<213> 黄鳝（Monopterus albus）

<400> 1

acgttagtct gctgctgttg gttcgagcac agcttgtaag gaggacaaac ttctttccca 60

gcccttgtag caggatgcct gtggttccca aagtgacact gcctgggggt ctggagatct 120

gtcgggtcct gaatgggatg tggcaggtgt ctggtaagca cggggcagtg gatcgagcca 180

aagcagttga ggccatgcag gcctatgtag atgctggtct gaccacattc gacatggcag 240

acatttatgg gcctgcagag gaaatatttg ggcagttcaa cagcaagctg aagtcctctg 300

gagatgctgc accagctgtg cagagtctga ccaaatacgt tccacaacca ggaccaatgg 360

accgcaaggt ggtggagaag gcaatacagc tctccatgac tcggatgcag gtggacagtc 420

tggactgtgt tcagtttcac tggtgggact atagcgacaa gagatacctg gaggcactgg 480

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acacacagag actggaggag atcagcaaca gaggcatccg catttccagc aaccaggttc 600

agtactctgt gattgaccag cgacctgcag tgaagatgga acagttctgt ctggccaatg 660

acatccagct cctcacttat ggcactctgg ctggcggtct gctcacagag cgctatctgg 720

gcaaggcgga gccaaactcc aaggcggagc tctatactgc ctccctctca agctacaaga 780

agatgatcga cacttggggt ggctggagcc ttttccagga cctacttgtt actttggagg 840

ctgttgccag gagacacaac tgccccatgg cctgtgtcgc aacgcgttac gtgctggacc 900

gccctgcagt gggcggggtc attgtgggct gcaggctagg tgtcgcaaat gcggggcagc 960

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ctgctatcaa agctgtgaca cagcgctcca gggacctcat ggtgtggatt ggggactgcg 1080

gcgatgagta caggagctaa aggcagaagg ggtgaggaat agaggcagag taaagggaaa 1140

catgcagcag tcacacatgc aacagaataa aatgcagctg ctgctgaaaa tcatttcaat 1200

cctccatttc atttttaatt gaatcaaatt agtttttgca taaagtctgt agctgttcct 1260

ctgttacaca ctataaagaa ccaacagcaa attgtaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1320

<210> 2

<211> 341

<212> PRT

<213>黄鳝（Monopterus albus）

<400> 2

Met Pro Val Val Pro Lys Val Thr Leu Pro Gly Gly Leu Glu Ile Cys

1 5 1015

Arg Val Leu Asn Gly Met Trp Gln Val Ser Gly Lys His Gly Ala Val

202530

Asp Arg Ala Lys Ala Val Glu Ala Met Gln Ala Tyr Val Asp Ala Gly

354045

Leu Thr Thr Phe Asp Met Ala Asp Ile Tyr Gly Pro Ala Glu Glu Ile

505560

Phe Gly Gln Phe Asn Ser Lys Leu Lys Ser Ser Gly Asp Ala Ala Pro

65707580

Ala Val Gln Ser Leu Thr Lys Tyr Val Pro Gln Pro Gly Pro Met Asp

859095

Arg Lys Val Val Glu Lys Ala Ile Gln Leu Ser Met Thr Arg Met Gln

100 105 110

Val Asp Ser Leu Asp Cys Val Gln Phe His Trp Trp Asp Tyr Ser Asp

115 120 125

Lys Arg Tyr Leu Glu Ala Leu Gly His Leu Phe Asp Met Gln Gln Glu

130 135 140

Gly Leu Ile Arg Glu Leu Ser Leu Thr Asn Phe Asp Thr Gln Arg Leu

145 150 155 160

Glu Glu Ile Ser Asn Arg Gly Ile Arg Ile Ser Ser Asn Gln Val Gln

165 170 175

Tyr Ser Val Ile Asp Gln Arg Pro Ala Val Lys Met Glu Gln Phe Cys

180 185 190

Leu Ala Asn Asp Ile Gln Leu Leu Thr Tyr Gly Thr Leu Ala Gly Gly

195 200 205

Leu Leu Thr Glu Arg Tyr Leu Gly Lys Ala Glu Pro Asn Ser Lys Ala

210 215 220

Glu Leu Tyr Thr Ala Ser Leu Ser Ser Tyr Lys Lys Met Ile Asp Thr

225 230 235 240

Trp Gly Gly Trp Ser Leu Phe Gln Asp Leu Leu Val Thr Leu Glu Ala

245 250 255

Val Ala Arg Arg His Asn Cys Pro Met Ala Cys Val Ala Thr Arg Tyr

260 265 270

Val Leu Asp Arg Pro Ala Val Gly Gly Val Ile Val Gly Cys Arg Leu

275 280 285

Gly Val Ala Asn Ala Gly Gln His Ile Gly Asp Ser Leu His Ser Cys

290 295 300

Ser Pro Asp Leu Arg Leu Thr Ala Glu Asp Leu Ala Ala Ile Lys Ala

305 310 315 320

Val Thr Gln Arg Ser Arg Asp Leu Met Val Trp Ile Gly Asp Cys Gly

325 330 335

Asp Glu Tyr Arg Ser

340

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

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acatccagac cagcgacctg ca22

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgccgaatct tttttttttt ttagc 25

<210> 5

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<212> DNA

<213> 人工序列

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gtatctcttg tcgctatagt cccaccagtg30

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<212> DNA

<213> 人工序列

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tgtgggctgc aggctaggtg tcgc24

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<212> DNA

<213> 人工序列

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gccgaattca tgcctgtggt tcccaaag28

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ccgaagcttt tagctcctgt actcatcgc 29