甘蓝醛酮还原酶基因对小菜蛾为害的响应及其转基因植株的构建

摘要

植物醛酮还原酶是植物体中重要的解毒酶，在植物防御非生物胁迫中起关键作用。本实验室发现正常和机械损伤的甘蓝释放苯甲醛，而小菜蛾为害后甘蓝释放的挥发性物质中没有苯甲醛而有苯甲醇，因此醛酮还原酶可能在植物应对害虫为害中发挥作用。
　　本研究利用 qRT-PCR技术分析甘蓝受小菜蛾胁迫后甘蓝醛酮还原酶基因表达量的变化，结果发现甘蓝在受到小菜蛾取食2 h后，BoAKR1、BoAKR2这2条基因表达量都显著提高，且都在小菜蛾取食10 h后迅速增加，并达到最大值，表明BoAKR1、BoAKR2基因与小菜蛾取食胁迫相关；在受机械损伤后，BoAKR1、BoAKR2基因表达量立即显著上升，且BoAKR2基因表达量在受机械损伤0 h表达量最高，而BoAKR1则是在受机械损伤4 h后达到最大值，这表明BoAKR1、BoAKR2基因与甘蓝对机械损伤的应急反应相关，且BoAKR2基因的相关性更密切；BoAKR3、BoAKR4基因表达量在甘蓝受机械损伤后无显著变化，但在受小菜蛾取食10 h后这2条基因表达量显著提高，表明BoAKR3、BoAKR4基因与甘蓝受机械损伤无关，但与小菜蛾取食胁迫相关；无论甘蓝是受小菜蛾取食还是受机械损伤，BoAKR5基因表达量都无显著变化，表明BoAKR5基因与小菜蛾取食胁迫以及机械损伤胁迫无关。
　　同时，本研究将BoAKR1转入含有CaMV35S启动子的pCAMBIA1301载体中，构建了pCAMBIA1301+BoAKR1植物过表达载体，并成功将该植物表达载体导入甘蓝植株中；将BoAKR1正反向基因序列与pJM007克隆载体相连，构建重组质粒 pJM007+RNAi（BoAKR1），再将含有启动子+BoAKR1(-)+intron+BoAKR1(+)+终止子元件从pJM007+RNAi(BoAKR1)重组质粒中切下，并与植物表达载体 pCAMBIA1301连接，形成 pCAMBIA1301+RNAi(BoAKR1)植物RNAi抑制表达载体；设计针对BoAKR1基因的gRNA靶点序列，构建CRISPR/Cas9植物表达载体。
　　比较5种的NaClO消毒浓度下甘蓝种子污染率，结果显示种子污染率大小为4％NaClO>6%NaClO>8%NaClO>10%NaClO=12%NaClO，确定甘蓝种子消毒最佳NaClO浓度为10%；对比6种愈伤诱导培养基，配方为MS+3.0 mg/L6-BA+0.45 mg/L NAA+3%蔗糖+0.7%琼脂粉中的甘蓝外植体第7d开始形成愈伤组织，在第20d，40个外植体中共有26个形成愈伤组织，这在6种愈伤组织诱导培养基中表现最好。
　　本研究为进一步研究甘蓝醛酮还原酶基因在甘蓝与小菜蛾互作中的作用提供基础。

目录

封面

声明

目录

中文摘要

英文摘要

1 前言

1.1 抗虫基因研究

1.1.1 源于植物的抗虫基因

1.1.2 源于微生物的抗虫基因

1.1.3 源于动物的抗虫基因

1.2 醛酮还原酶

1.3 本研究的目的和意义

2 材料和方法

2.1 材料和仪器

2.1.1 供试蔬菜

2.1.2 菌种和载体

2.1.3 试剂与酶类

2.1.4 试剂及溶液

2.1.5 主要仪器

2.2 不同处理条件下甘蓝醛酮还原酶表达量的检测

2.2.1 甘蓝总RNA提取

2.2.2 甘蓝总RNA第一链cDNA的合成

2.2.3 甘蓝醛酮还原酶表达量检测

2.3 植物表达载体构建及农杆菌转化

2.3.1 克隆载体构建

2.3.2 农杆菌转化

2.4 甘蓝再生系统的建立

2.4.1 甘蓝种子消毒

2.4.2 培养基

2.4.3 外植体的选择及培养

2.4.4 甘蓝遗传转化及转化植株的获得

2.5 转基因植株的鉴定

3 结果与分析

3.1 BoAKR1~BoAKR5基因序列特征

3.2 小菜蛾取食对甘蓝醛酮还原酶表达量的影响

3.3 植物表达载体构建

3.3.1 BoAKR1过表达载体构建

3.3.2 BoAKR1抑制表达载体构建

3.3.3 CRISPR/Cas9植物表达载体构建

3.4 转基因甘蓝

3.4.1 甘蓝组培配方筛选

3.4.2 转基因甘蓝植株构建与鉴定

4 讨论

参考文献

附录

致谢