一种基于吲哚酚衍生物、2‑(苯并噻唑‑2′‑基)苯酚衍生物的糖苷的合成方法

摘要

本发明公开了一种基于吲哚酚衍生物、2‑(苯并噻唑‑2'‑基)苯酚衍生物的糖苷的合成方法。其合成方程通式如下所示：所述的Ar‑OH表示芳香酚或其酮式化合物，作为糖苷化反应中的糖基受体；G‑X表示卤代糖，作为糖苷化反应中的糖基供体。本发明选用1‑乙酰基吲哚啉‑3‑酮衍生物作为中间体，研究并发展了新型的合成方法来制备基于吲哚酚衍生物的糖苷，并应用该方法合成了新型的基于BTP衍生物的糖苷酶荧光探针，同时考察了它们的应用效果。基于吲哚酚衍生物、2‑(苯并噻唑‑2'‑基)苯酚衍生物的糖苷可作为糖苷酶底物，用于对相应糖苷酶和以其为特征靶标的微生物等的定位分析检测、筛分。

说明书

技术领域

本发明属于化学合成领域，具体涉及一种基于吲哚酚衍生物、2-(苯并噻唑-2′-基)苯酚衍生物的糖苷的合成方法。

背景技术

糖苷酶，亦称O-糖苷水解酶，是一组负责催化水解碳水化合物和糖缀合物分子中O-糖苷键的、自然界中广泛分布的酶。这类酶是自然界中发现的最高效酶之一；相对于非催化反应，其催化水解糖苷键的速率高达10¹⁷倍。除了一些古生菌和一些单细胞的寄生生物外，糖苷酶存在于其他所有生命体中，并发挥着各种各样的作用。在原核生物体中，糖苷酶既存在于细胞内，也存在于细胞外，主要参与营养采集。在高等生物体中，糖苷酶存在于内质网和高尔基体里，并参与N-连接糖蛋白的加工过程。根据催化机理、底物特异性、催化水解的糖苷键位点和氨基酸序列等，糖苷酶可被划分各种不同的种类。基于氨基酸序列的相似性，糖苷酶可被分成超过120个家族。由于糖苷酶与许多重要的生命过程密切相关，并可作为致病微生物、人类疾病状况、转基因工程中报告基因等的重要指示物，也在工业生产上有所应用(Expert>

当需要对糖苷酶进行定位分析检测和筛分时，由于如基于硝基苯酚、伞形酮、试卤灵、荧光素等分子的非沉淀型显色/荧光底物，被酶解后信号产物具有扩散性而难以适用，此时就需要沉淀型显色/荧光底物来解决(J.Microbiol.Methods,2009,79,139-155；Curr.Opin.Chem.Biol.,2011,15,752-759；)。在沉淀型显色底物中，吲哚酚显色底物是应用特别广泛的一类，在组织染色、微生物检测、转基因工程上报告基因的表达分析等方面至今仍一直应用。它们是由产色原吲哚酚或其取代物与酶底物间接缩合而成，当它受目标酶水解作用时会释放出吲哚酚或其取代物并在空气中的氧气氧化下发生两分子偶合成不溶于水、热稳定性高、显色的二聚体染料(即靛蓝)。不同的吲哚酚取代物，其显色结果也不一样，常见的如吲哚酚产蓝色、5-溴-4-氯-3-吲哚酚产蓝至蓝绿色、5-溴-6-氯-3-吲哚酚产紫红色、6-氯-3-吲哚酚产橙红色、N-甲基吲哚酚产绿色和5-碘-3-吲哚酚产紫色，其中在微生物学上应用最多的是5-溴-4-氯-3-吲哚酚、5-溴-6-氯-3-吲哚酚、6-氯-3-吲哚酚，特别是5-溴-4-氯-3-吲哚酚(Biotech.Histochem.,2007,82,73-103；化学通报,2013,76,580-589；Trends Carbohydr.Res.,2014,6,1-10；Chem.Commun.,2015,51,10576-10588.)。除了这种被酶解后释放的色原经氧化而产色的吲哚酚显色底物之外，还有研究报道过，被酶解后色原经螯合介质中金属离子如铁离子、锌离子、铝离子等产生水溶性差、特定颜色色料的沉淀型显色底物，它们常是由基于茜素、七叶亭、3,4-环己基七叶亭、8-羟基喹啉等色原而发展出来的。不过由于它们被酶解后色原可能未能及时螯合金属离子而扩散，导致显色定位检测效果不好，另外由于色原螯合不同金属离子后色料颜色不一样，在微生物学检测上还存在有的螯合物色料对革兰氏阳性菌具有毒性现象，这些都导致了螯合产色类沉淀型显色底物的应用特别是微生物学检测应用上受限(J.Appl.Microbiol.,2007,103, 2046-2055；J.Microbiol.Methods,2009,79,139-155.)。与沉淀型显色底物相比，沉淀型荧光底物被研究和报道得很少，特别是在微生物学上。基于2-(2'-羟基苯基)-4(3H)-喹唑酮衍生物[2-(2'-hydroxyphenyl)-4(3H)-quinazolinones(HPQs)]的糖苷如β-D-半乳糖苷、β-D-葡萄糖醛酸苷等的合成和应用研究曾有过报道，不过它们的合成都采用Koenigs-Knorr糖苷化法，反应和纯化比较困难(Tetrahedron Lett.,1994,35,8569-8572；US Patent5443986,1995；J.Biochem.Biophys.Methods,1996,33,197-205；Tetrahedron,1997,53,7159-7164.)，之后也难以看到更多的相关糖苷合成和应用研究被报道，或许是合成上的困难阻滞了进一步的相关研究。近年来，基于2-(苯并噻唑-2'-基)苯酚衍生物[2-(benzothiazol-2'-yl)phenols(BTPs)]或2-(2'-羟基苯基)苯并噻唑[2-(2′-hydroxylphenyl)benzothiazoles(HBTs)]的β-纤维寡糖苷、β-半乳糖苷和唾液酸苷的合成和应用研究陆续被报道，其合成过程中的关键步骤糖苷化包括Koenigs-Knorr法和NaH/THF-DMF法，不过前种方法耗时长达好几天，并且产率也不高，而后种方法虽然耗时短些(近1d)，但强碱条件对易发生消除反应的糖基供体如乙酰溴代葡萄糖等难以适用(J.Microbiol.Methods,2009,76,295-300；Bioorg.Med.Chem.Lett.,2013,23,2245-2249；PloS one,2014,9,e81941.)。而更多基于BTP衍生物的糖苷合成与应用也还没被报道，可能也与合成上的困难有关。

显色底物与荧光底物各有优点，前者产生的色料可直接在可见光下用肉眼观察到，而后者产生的荧光物虽需要借助紫外光照射才能观察到，但是其信号却更加灵敏。在对糖苷酶的定位检测中，如果将沉淀型显色底物与沉淀型荧光底物混合使用，例如基于吲哚酚衍生物的糖苷与基于BTP衍生物的糖苷，则效果又会如何呢？目前这尚未有研究报道过。而关于基于吲哚酚衍生物的糖苷与基于BTP衍生物的糖苷的合成，目前也尚未有一种通用的方法被报道 过。关于基于吲哚酚衍生物的糖苷合成研究较多，常用中间体包括：1-乙酰基吲哚啉-3-酮衍生物(见结构式1a)、乙酸吲哚-3-基酯衍生物(见结构式1b)和3-羟基吲哚-2-羧酸酯衍生物(见结构式1c)(化学通报,2013,76,580-589；Trends Carbohydr.Res.,2014,6,1-10.)。使用1a时，糖苷化反应常在NaOH或KOH水溶液/丙酮/0℃条件下进行，产率特别是制备葡萄糖苷衍生物的相当低；有时用Koenigs-Knorr法(三氟甲烷磺酸银等作催化剂)，但所用的糖基供体却不易制备，应用极少(Trends Carbohydr.Res.,2014,6,1-10；USPatent 7323488,2008.)；有报道称相转移催化法曾被尝试用于研究1-乙酰基-5-溴吲哚啉-3-酮与乙酰溴代半乳糖的糖苷化反应，但因反应混合物复杂且产率很低而被别的方法替代(Mol.Imaging,2008,7,187-197)，由此，相转移催化法甚至被认为是不可行的(TrendsCarbohydr.Res.,2014,6,1-10.)。使用1b时，糖苷化反应需严格无氧而不易操作，有色杂质多，产率低，另外因以甲醇为溶剂，对一些糖基供体(如多糖供体)溶解度不好而不利于糖苷化反应(US Patent 7323488,2008.)。使用1c时，反应路线冗长，纯化工作相对更加繁重，且R为Me时的脱羧产率大都低于50％，而R为Allyl时的脱羧产率虽高些，但脱羧前处理则更加麻烦(Org.Lett.,2013,15,3766-3769；Eur.J.Org.Chem.,2014,564-574.)。对比而言，其中1-乙酰基吲哚啉-3-酮衍生物最易获得，近来Gandy等又发展了新型、高效、便捷的合成路线(Org.Biomol.Chem.,2015,13,905-908.)。基于吲哚酚衍生物的糖苷合成常用到的中间体，如式1a、1b、1c所示，其中X和Y代表不同的卤原子；R＝Me or Allyl

发明内容

本发明的目的是提供一种新的、更容易操作的、更加高效、产率相对较高的方法合成糖苷。

本发明的基于吲哚酚衍生物、2-(苯并噻唑-2'-基)苯酚衍生物的糖苷，是通过以下方法制备的，其合成方程通式如下所示：

所述的Ar-OH表示芳香酚或其酮式化合物，作为糖苷化反应中的糖基受体，例如可以为1-乙酰基吲哚啉-3-酮衍生物，其结构如式1a所示或BTP衍生物，其结构如式1d所示：

其中X和Y表示不同的卤原子，R表示H或卤原子；

G-X表示卤代糖，作为糖苷化反应中的糖基供体，例如乙酰溴代葡萄糖、乙酰溴代半乳糖等。

所述的固-液相转移催化糖苷化反应：所用相转移催化剂(PTC)可为四正丁基硫酸氢铵(TBAHS)、四正丁基溴化铵(TBAB)、四正丁基溴化膦(TPAB)等，其中优选TBAHS和TBAB；所用PTC量不必为糖基受体或糖基供体的等摩尔当量，而仅催化量即可，如糖基受体的0.20摩尔当量；所用碱可为K₃PO₄、K₂CO₃、Cs₂CO₃、NaOH、KOH等，其中优选K₃PO₄、KOH；所用碱量相对于糖基受体过量并不必超过6.0摩尔当量，其中优选5.0摩尔当量；所>

所述的脱保护反应步骤中，采用KOH催化甲醇醇解法。对于合成糖苷过程中脱乙酰保护基反应，常用甲醇钠作碱催化醇解。但是由于甲醇钠、甲醇钾不仅对氧气敏感而易被氧化成甲酸钠、甲酸钾，而且对二氧化碳也比KOH敏感，然而KOH对氧气不敏感，碱性比NaOH大，在甲醇、乙醇中的溶解度也比NaOH大，反应后更容易被去除掉，因此本发明采用KOH作碱催化。

本发明选用1-乙酰基吲哚啉-3-酮衍生物作为中间体，研究并发展了新型的合成方法来制备基于吲哚酚衍生物的糖苷，并应用该方法合成了新型的基于BTP衍生物的糖苷酶荧光探针，同时考察了它们的应用效果。基于吲哚酚衍生物、2-(苯并噻唑-2'-基)苯酚衍生物的糖苷可作为糖苷酶底物，用于对相应糖苷酶和以其为特征靶标的微生物等的定位分析检测、筛分。主要在于对非变性蛋白凝胶电泳后的特异性活性染色、对微生物更高特异性和准确性地分析检测和筛分研究方面。

附图说明：

图1是37℃和有氧条件下孵育90min时分别于可见光下(上)和365nm紫外光下(下)观察X-Glu(甲A、B)、BTP-Glu(乙A、B)和BTP3-Glu(丙A、B)分别对有活性的β-葡萄糖 苷酶(A)和失活的β-葡萄糖苷酶(B)的检测结果；

图2是37℃和有氧条件下孵育90min后于室温下再放置10.5h时分别于可见光下(左)和365nm紫外光下(右)观察X-Glu(甲A、B)、BTP-Glu(乙A、B)和BTP3-Glu(丙A、B)分别对有活性的β-葡萄糖苷酶(A)和失活的β-葡萄糖苷酶(B)的检测结果；

图3是非变性蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳后β-葡萄糖苷酶的特异性活性染色结果；

图4是将阳性菌肺炎克雷伯氏菌CMCC(B)46117和阴性菌鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028一起接种至含BTP-Glu的琼脂平板上并于37℃和有氧条件下培养24h后，分别于可见光下(左)和365nm紫外光下(右)的观察结果；

图5是将阳性菌肺炎克雷伯氏菌CMCC(B)46117和阴性菌鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028一起接种至含BTP3-Glu的琼脂平板上并于37℃和有氧条件下培养24h后，分别于可见光下(左)和365nm紫外光下(右)的观察结果；

图6是将阳性菌肺炎克雷伯氏菌CMCC(B)46117和阴性菌鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028一起接种至含X-Glu的琼脂平板上并于37℃和有氧条件下培养24h后，分别于可见光下(左)和365nm紫外光下(右)的观察结果；

图7是将阳性菌肺炎克雷伯氏菌CMCC(B)46117和阴性菌鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028一起接种至同时含有X-Glu和Magenta-Gal的琼脂平板上并于37℃和有氧条件下培养24h后，分别于可见光下(左)和365nm紫外光下(右)的观察结果；

图8是将阳性菌肺炎克雷伯氏菌CMCC(B)46117和阴性菌鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028一起接种至同时含有X-Gal和BTP3-Glu的琼脂平板上并于37℃和有氧条件下培养24h后，分别于可见光下(左)和365nm紫外光下(右)的观察结果；

图9是将阳性菌肺炎克雷伯氏菌CMCC(B)46117和阴性菌鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028一起接种至同时含有Magenta-Gal和BTP3-Glu的琼脂平板上并于37℃和有氧条件下培养24h后，分别于可见光下(左)和365nm紫外光下(右)的观察结果；

图10是对粪链球菌ATCC 29212的检测效果(左为可见光下，右为365nm紫外光下)；

图11是对蜡样芽胞杆菌CMCC 63301的检测效果(左为可见光下，右为365nm紫外光下)；

图12是蜡样芽胞杆菌CMCC 63301的显微成像(a为暗场下的荧光成像图，b为眀场下的可见光成像图，c为a与b的合并图)；

图13是粪链球菌ATCC 29212的显微成像(a为暗场下的荧光成像图，b为眀场下的可见光成像图，c为a与b的合并图)；

图14是肺炎克雷伯氏菌CMCC(B)46117的显微成像(a为暗场下的荧光成像图，b为眀场下的可见光成像图，c为a与b的合并图)；

图15是肺炎克雷伯氏菌CMCC(B)46117的显微成像(a为暗场下的荧光成像图，b为眀场下的可见光成像图，c为a与b的合并图)。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

(一)糖苷的合成

实施例1：(5-溴-4-氯吲哚-3-基)β-D-葡萄糖苷(X-Glu)的合成

Horwitz等曾报道在制备该糖苷时，用乙酸(5-溴-4-氯吲哚-3-基)酯衍生物作为中间体(见式1b)，在用金属钠新制的甲醇钠甲醇溶液中与严格的无氧、无水和0℃条件下先脱除3位乙酰基，再加入含乙酰溴代-α-D-葡萄糖的甲醇溶液进行反应18h，期间一直要保持无氧、 无水和0℃条件，该法将糖苷化与脱保护反应于“一锅”下完成，产率为25％(J.Med.Chem.,1964,7,574-575)。等曾报道用3-羟基吲哚-2-羧酸酯衍生物(见式1c)作为中间体合成该糖苷(Eur.J.Org.Chem.,2014,564-574.)。

而本发明的制备方法如下：

(1)糖苷化反应

向氩气保护下含1-乙酰基-5-溴-4-氯吲哚啉-3-酮(289mg,1.00mmol)、TBAHS(68mg,0.20mmol)[或TBAB(65mg,0.20mmol)]和K₃PO₄(1062mg,5.00mmol)的圆底烧瓶中依次加入H₂O[53.1μL,5％(w/w)]和CH₂Cl₂(10mL)，室温下搅拌约10min，然后一次性地加入乙酰溴代-α-D-葡萄糖(1028mg,2.50mmol)，搅拌反应10h后结束(或者加热回流下搅拌反应4h后结束)。分液，将所得有机相用无水硫酸钠干燥，接着浓缩，过硅胶柱分离，再用乙醇重结晶，真空干燥后得无色针状晶体目标物(285mg,产率为46％)。其结构式2a。

或者，向氩气保护下含1-乙酰基-5-溴-4-氯吲哚啉-3-酮(289mg,1.00mmol)、TBAHS(68mg,0.20mmol)和KOH(281mg,5.00mmol)的圆底烧瓶中加入CH₂Cl₂(10mL)，室温下搅拌约10min，然后一次性地加入乙酰溴代-α-D-葡萄糖(1028mg,2.50mmol)，室温下搅拌反应3h后结束。分液，将所得有机相用无水硫酸钠干燥，接着浓缩，过硅胶柱分离，再用乙醇重结晶，真空干燥后得无色晶体目标物(284mg,产率为46％。其结构式2a)。

2a((1-乙酰基-5-溴-4-氯吲哚-3-基)2,3,4,6-四乙酰基-β-D-葡萄糖苷)

R_f＝0.16(PE/AcOEt＝2/1)；(c＝0.20,MeCN)；m.p.:162–163℃；¹H-NMR(300MHz,CDCl₃):δ＝8.21(d,J＝8.9Hz,1H,CHarom),7.53(d,J＝8.9Hz,1H,CH_arom),7.28(s,1H,＝CH-N),5.37(m,1H,2-H),5.30(t,J＝9.0Hz,1H,3-H),5.19(t,J＝9.3Hz,1H,4-H),5.00(d,J_1,2＝7.3Hz,1H,1-H),4.40(dd,J_6a,6b＝12.3,J_5,6a＝2.1Hz,1H,6a-H),4.18(dd,J_6a,6b＝12.4,J_5,6b＝5.0Hz,1H,6b-H),3.85(ddd,J_4,5＝9.8,J_5,6b＝4.8,J_5,6a＝2.2Hz,1H,5-H),2.61(s,3H,NCOCH₃),2.10,2.10,2.06,2.05(4×s,4×3H,4×OCOCH₃)ppm.¹³C-NMR(75MHz,CDCl₃):δ＝170.52(NCO),170.21,169.43,169.26,168.17(4×OCO),139.59,133.17,130.36,124.86,122.36,118.30,116.05,112.65(8×C_arom),100.44(C-1),72.48,72.48,70.63,68.29,61.90(C-2,C-3,C-4,C-5,C-6),23.86(NCOCH₃),20.81,20.77,20.62,20.61(4×OCOCH₃)ppm.HRMS(ESI):m/z[M+Na]⁺calcd.for>24H₂₅BrClNNaO₁₁:640.0192；found>

(2)脱保护反应

向含(1-乙酰基-5-溴-4-氯吲哚-3-基)2,3,4,6-四乙酰基-β-D-葡萄糖苷(2000mg,3.23mmol)的甲醇悬浊液(60mL)中加入KOH甲醇溶液(1mol/L,485μL,0.15e.q.)，室温下搅拌1h后结束。抽滤并收集沉淀，滤液经浓缩后，再合并抽滤，用适量二氯甲烷搅拌洗涤数次以去除靛蓝色料，真空干燥后得白色粉末目标物(1175mg,产率为89％。其结构式3a，(5-溴-4-氯吲哚-3-基)β-D-葡萄糖苷(X-Glu))。

R_f＝0.38(CHCl₃/MeOH＝5/1)；(c＝0.25,50％DMF)；m.p.:235–237℃(decomp.)； ¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ＝11.09(d,J＝2.4Hz,1H,NH),7.31(d,J＝8.7Hz,1H,H_arom),7.25–7.19(m,2H,2×H_arom),5.13(d,J＝5.2Hz,1H,OH),5.07(d,J＝4.6Hz,1H,OH),5.02(d,J＝5.2Hz,1H,OH),4.65(d,J_1,2＝7.4Hz,1H,1-H),4.62(t,J＝5.9Hz,1H,6-OH),3.73(ddd,J＝11.7,5.4,1.8Hz,1H,6a-H),3.53–3.41(m,1H,6b-H),3.33–3.20(m,3H,2-H,3-H,5-H),3.20–3.10(m,1H,4-H)ppm.¹³C-NMR(75MHz,DMSO-d₆):δ＝136.62,133.02,125.37,123.07,117.53,112.86,112.19,111.47(8×C_arom),103.52(C-1),77.14,76.80,73.41,69.96,60.88(C-2,C-3,C-4,C-5,C-6)ppm.HRMS(ESI):m/z[M+Na]⁺calcd.forC₁₄H₁₅BrClNNaO₆:429.9663；found>

上述两步反应总产率为：46％×89％≈41％。

实施例2：(5-溴-4-氯吲哚-3-基)β-D-半乳糖苷(X-Gal)的合成

Horwitz等曾报道该糖苷的合成，但是没说明采用什么方法及其产率情况(J.Med.Chem.,1964,7,574-575)。等曾报道用3-羟基吲哚-2-羧酸酯衍生物(见式1c)作为中间体合成该糖苷(Eur.J.Org.Chem.,2014,564-574.)。而本发明的制备方法如下：

(1)糖苷化反应

向氩气保护下含1-乙酰基-5-溴-4-氯吲哚啉-3-酮(289mg,1.00mmol)、TBAHS(68mg,0.20mmol)和K₃PO₄(1062mg,5.00mmol)的圆底烧瓶中依次加入H₂O[53.1μL,5％(w/w)]>2Cl₂(10mL)，室温下搅拌约10min，然后一次性地加入乙酰溴代-α-D-半乳糖(1028mg,2.50mmol)，搅拌反应4h后结束。分液，将所得有机相用无水硫酸钠干燥，接着浓缩，过硅胶柱分离，再用乙醇重结晶，真空干燥后得白色晶体目标物(353mg,产率为57％)。其结构如式2b所示，其为1-乙酰基-5-溴-4-氯吲哚-3-基)2,3,4,6-四乙酰基-β-D-半乳糖苷)。

R_f＝0.19(PE/AcOEt＝2/1)；(c＝0.30,MeCN)；m.p.:184–185℃；¹H-NMR(500MHz,DMSO-d₆):δ＝8.21(d,J＝8.9Hz,1H,CH_arom),7.66(d,J＝8.9Hz,1H,CH_arom),7.54(s,1H,C＝CH-N),5.37(m,2H,1-H,4-H),5.35(dd,J_2,3＝10.0,J_1,2＝8.0Hz,1H,2-H),5.28(dd,J_2,3＝10.0,J_2,3＝3.5Hz,1H,3-H),4.49(dd,J_5,6b＝6.5,J_5,6a＝5.5Hz,1H,5-H),4.21(dd,J_6a,6b＝11.5,J_5,6a＝5.0Hz,1H,6a-H),4.13(dd,J_6a,6b＝11.3,J_5,6b＝7.3Hz,1H,6b-H),2.63(s,3H,NCOCH₃),2.17,2.06,2.04,1.97(4×s,4×3H,4×OCOCH₃)ppm.¹³C-NMR(126MHz,DMSO-d₆):δ＝170.49(NCO),170.47,170.00,169.52,169.52(4×OCO),139.24,133.14,130.49,124.08,122.02,117.57,116.63,112.47(8×C_arom),100.00(C-1),71.33,70.53,68.40,67.81,62.24(C-2,C-3,C-4,C-5,C-6),24.28(NCOCH₃),21.01,21.01,20.88,20.81(4×OCOCH₃)ppm.HRMS(ESI):m/z[M+Na]⁺calcd.for>24H₂₅BrClNNaO₁₁:640.0192；found>

(2)脱保护反应

向含(1-乙酰基-5-溴-4-氯吲哚-3-基)2,3,4,6-四乙酰基-β-D-半乳糖苷(300mg,0.485 mmol)的无水甲醇悬浊液(9mL)中加入KOH甲醇溶液(1mol/L,72.7μL,0.15e.q.)，室温下搅拌1h后结束。抽滤并收集沉淀，滤液经浓缩后，再合并抽滤，用适量二氯甲烷搅拌洗涤数次以去除靛蓝色料，真空干燥后得白色粉末目标物(171mg,产率为86％。其结构如式3b所示，5-溴-4-氯吲哚-3-基)β-D-半乳糖苷(X-Gal))。

R_f＝0.31(CHCl₃/MeOH＝5/1)；(c＝0.21,50％DMF)；m.p.:178–179℃(decomp.)；¹H-NMR(500MHz,DMSO-d₆):δ＝11.06(d,J＝2.0Hz,1H,NH),7.30(d,J＝8.6Hz,1H,H_arom),7.21(d,J＝8.6Hz,1H,H_arom),7.19(d,J＝2.5Hz,1H,H_arom),4.93(s,1H,OH),4.81(s,1H,OH),4.66(s,1H,OH),4.62(d,J_1,2＝8.0Hz,1H,1-H),4.51(s,1H,OH),3.69(d,J_4,5＝3.0Hz,1H,4-H),3.62(t,J_1,2＝8.5Hz,1H,2-H),3.56(m,2H,6a-H,6b-H),3.51(t,J＝6.0Hz,1H,3-H),3.38(dd,J_5,6a＝9.0,J_4,5＝3.0Hz,1H,5-H)ppm.¹³C-NMR(126MHz,DMSO):δ＝137.17,133.54,125.84,123.60,118.08,113.17,112.68,111.94(8×C_arom),104.61(C-1),76.14,73.97,70.91,68.73,61.02(C-2,C-3,C-4,C-5,C-6)ppm.HRMS(ESI):m/z[M+Na]⁺calcd.for>14H₁₅BrClNNaO₆:429.9663；found>

上述两步反应总产率为：57％×86％≈49％。

实施例3：(5-溴-6-氯吲哚-3-基)β-D-半乳糖苷(Magenta-Gal)的合成

Horwitz等曾报道在制备该糖苷时，用1-乙酰基-5-溴-6-氯吲哚啉-3-酮与乙酰溴代-α-D-半乳糖在NaOH水溶液/丙酮/0℃/N₂保护的条件下反应16h，糖苷化反应产率为49％；脱保>等曾报道用3-羟基吲哚-2-羧酸酯衍生物(见式1c)作为中间体合成该糖苷(Eur.J.Org.Chem.,2014,564-574.)。

而本发明的制备方法如下：

(1)糖苷化反应

向氩气保护下含1-乙酰基-5-溴-6-氯吲哚啉-3-酮(289mg,1.00mmol)、TBAHS(68mg,0.20mmol)和K₃PO₄(1062mg,5.00mmol)的圆底烧瓶中依次加入H₂O[53.1μL,5％(w/w)]和CH₂Cl₂(10mL)，室温下搅拌约10min，然后一次性地加入乙酰溴代-α-D-半乳糖(1028mg,2.50mmol)，搅拌反应3h后结束。分液，将所得有机相用无水硫酸钠干燥，接着浓缩，过硅胶柱分离，再用乙醇重结晶，真空干燥后得无色晶体目标物(400mg,产率为65％)。其结构式见式2c，1-乙酰基-5-溴-6-氯吲哚-3-基)2,3,4,6-四乙酰基-β-D-半乳糖苷)。

R_f＝0.17(PE/AcOEt＝2/1)；(c＝0.30,MeCN)；m.p.:189–191℃.¹H-NMR(500MHz,DMSO-d₆):δ＝8.47(s,1H,H_arom),7.71(s,1H,H_arom),7.62(s,1H,H_arom),5.42(d,J_1,2＝7.5Hz,1H,1-H),5.38(d,J_3,4＝3.0Hz,1H,4-H),5.30(dd,J_2,3＝10.3,J_3,4＝3.5Hz,1H,3-H),5.26(dd,J_2,3＝10.5,J_1,2＝7.5Hz,1H,2-H),4.43(t,J＝6.2Hz,1H,5-H),4.16(dd,J_6a,6b＝11.4,J_5,6a＝5.2Hz,1H,6a-H),4.11(dd,J_6a,6b＝11.4,J_5,6b＝7.0Hz,1H,6b-H),2.61(s,3H,NCOCH₃),2.17,2.09,>3)ppm.¹³C-NMR(126MHz,DMSO-d₆):δ＝170.44(NCO),170.41,170.00,169.81,169.77(4×OCO),139.10,132.33,130.38,124.24,122.18,117.91,116.38,113.24(8×C_arom),100.51(C-1),71.23,70.41,68.79,67.67,62.01(C-2,C-3,C-4,C-5,C-6),24.08(NCOCH₃),20.97,20.97,20.87,20.81(4×OCOCH₃)ppm.HRMS(ESI):m/z[M+Na]⁺calcd.for>24H₂₅BrClNNaO₁₁:640.0192；found640.0205.

(2)脱保护反应

向含(1-乙酰基-5-溴-6-氯吲哚-3-基)2,3,4,6-四乙酰基-β-D-半乳糖苷(300mg,0.485mmol)的无水甲醇悬浊液(9mL)中加入KOH甲醇溶液(1mol/L,72.7μL,0.15e.q.)，室温下搅拌1h后结束。35℃水浴下旋蒸去除溶剂，用乙酸乙酯重结晶，真空干燥后得白色粉末目标物(196mg,产率为99％。其结构式见式3c，(5-溴-6-氯吲哚-3-基)β-D-半乳糖苷(Magenta-Gal))。

R_f＝0.30(CHCl₃/MeOH＝5/1)；(c＝0.17,50％DMF)；m.p.:137–138℃.¹H-NMR(500MHz,DMSO-d₆):δ＝7.97(s,1H,H_arom),7.56(s,1H,H_arom),7.18(s,1H,H_arom),4.49(d,J_1,2＝7.7Hz,1H,1-H),3.68(d,J_4,5＝3.0Hz,1H,4-H),3.61–3.53(m,3H,2-H,6a-H,6b-H),3.46(t,J＝6.1Hz,1H,5-H),3.37(dd,J_2,3＝9.5,J₃₄＝3.5Hz,1H,3-H)ppm.¹³C-NMR(126MHz,DMSO-d₆):δ＝136.77,132.92,125.68,122.44,120.78,114.74,113.54,110.79(8×C_arom),105.57(C-1),76.10,73.58,70.93,68.60,60.92(C-2,C-3,C-4,C-5,C-6)ppm.HRMS(ESI):m/z[M+Na]⁺calcd.for>14H₁₅BrClNNaO₆:429.9663；found>

上述两步反应总产率为：65％×99％≈64％。

实施例4：2-(苯并噻唑-2'-基)苯基-β-D-葡萄糖苷(BTP-Glu)的合成

未见到有文献报道该底物被合成和应用过。

(1)糖苷化反应

向氩气保护下含2-(苯并噻唑-2'-基)苯酚(1135mg,5.00mmol)、TBAHS(400mg,1.00mmol)和K₃PO₄(5307mg,25.00mmol)的圆底烧瓶中依次加入H₂O[265μL,5％(w/w)]和CH₂Cl₂(50mL)，室温下搅拌约10min，然后一次性地加入乙酰溴代-α-D-葡萄糖(5140mg,12.50mmol)，加热回流下搅拌反应7h后结束。分液，将所得有机相用无水硫酸钠干燥，接着浓缩，过硅胶柱分离，再用乙醇重结晶，真空干燥后得白色粉末目标物(2064mg,产率为74％)。其结构式见式2d，[2-(苯并噻唑-2'-基)苯基]2,3,4,6-四乙酰基-β-D-葡萄糖苷)。

R_f＝0.32(PE/AcOEt＝2/1)；(c＝0.40,MeCN)；m.p.173–175℃；¹H-NMR(500MHz,DMSO-d₆):δ＝8.42(dd,J＝7.8,1.6Hz,1H,H_arom),8.08(d,J＝8.0Hz,1H,H_arom),8.03(d,J＝7.5Hz,1H,H_arom),7.63–7.60(m,1H,H_arom),7.57–7.54(m,1H,H_arom),7.49–7.45(m,1H,H_arom),7.38(d,J＝8.0Hz,1H,H_arom),7.31–7.28(m,1H,H_arom),5.98(d,J_1,2＝7.5Hz,1H,1-H),>2,3＝9.5Hz,1H,2-H),5.36(dd,J_3,4＝9.5,J_4,5＝8.0Hz,1H,4-H),5.10(t,J_2,3＝9.7Hz,1H,3-H),4.37(ddd,J_4,5＝8.0,J_5,6a＝5.5,J_5,6b＝2.5Hz,1H,5-H),4.22(dd,J_6a,6b＝12.4,J_5,6a＝5.6Hz,1H,6a-H),4.12(dd,J_6a,6b＝12.3,J_5,6b＝2.2Hz,1H,6b-H),2.04,1.99,1.98,1.86(4×s,4×3H,4×OCOCH₃)ppm.¹³C-NMR(126MHz,DMSO-d₆):δ＝170.40,170.15,169.80,169.54(4×OCO),162.07,154.09,152.02,135.85,132.82,129.71,126.89,125.82,123.65,123.19,122.48,121.91,115.72(13×C_arom),97.09(C-1),72.97,71.52,71.30,68.21,62.00(C-2,C-3,C-4,C-5,C-6),20.92,20.88,20.86,20.77(4×OCOCH₃)ppm.HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺calcd.for>27H₂₈NO₁₀S:558.1428；found>

(2)脱保护反应

向含[2-(苯并噻唑-2'-基)苯基]2,3,4,6-四乙酰基-β-D-葡萄糖苷(2000mg,3.587mmol)的无水甲醇/四氢呋喃＝1/1的溶液(60mL)中加入KOH甲醇溶液(1mol/L,538μL,0.15e.q.)，室温下搅拌1h后结束。35℃水浴下旋蒸去除溶剂，先用二氯甲烷洗涤，再用少量水洗涤，真空干燥后得白色粉末目标物(1521mg,产率为99％。其结构式见式3d，其为2-(苯并噻唑-2'-基)苯基-β-D-葡萄糖苷(BTP-Glu))。

R_f＝0.75(CHCl₃/MeOH＝5/1)；(c＝0.30,50％DMF)；m.p.232–234℃；¹H-NMR(500MHz,DMSO-d₆):δ＝8.44(d,J＝7.5Hz,1H),8.10(d,J＝7.5Hz,1H),8.06(d,J＝8.0Hz,>1,2＝7.7Hz,1H,1-H),5.25(s,1H,OH),5.13(s,1H,OH),4.62(s,1H,OH),3.72(d,J＝11.0Hz,1H),3.62(t,J＝7.8Hz,1H),3.51–3.45(m,2H),3.37(m,1H),3.26(t,J＝7.5Hz,1H)ppm.¹³C-NMR(126MHz,DMSO-d₆):δ＝162.98,155.23,152.01,136.30,132.63,129.20,126.62,125.37,122.90,122.45,122.20,122.12,115.33(13×C_arom),100.62(C-1),77.68,77.41,73.69,70.07,61.06(C-2,C-3,C-4,C-5,C-6)ppm.HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺calcd.for>19H₂₀NO₆S:390.1006；found>

上述两步反应总产率为：74％×99％≈73％。

实施例5：2-(苯并噻唑-2'-基)-4-溴苯基-β-D-葡萄糖苷(BTP3-Glu)的合成

未见到有文献报道该底物被合成和应用过。

(1)糖苷化反应

向氩气保护下含2-(苯并噻唑-2'-基)-4-溴苯酚(2450mg,8.00mmol)、TBAHS(544mg,1.60mmol)和K₃PO₄(8491mg,40.00mmol)的圆底烧瓶中依次加入H₂O[425μL,5％(w/w)]和CH₂Cl₂(80mL)，室温下搅拌约10min，然后一次性地加入乙酰溴代-α-D-葡萄糖(8224mg,20.00mmol)，加热回流下搅拌反应7h后结束。分液，将所得有机相用无水硫酸钠干燥，接着浓缩，过硅胶柱分离，再用乙醇重结晶，真空干燥后得白色针状晶体目标物(4582mg,产率为90％)。其结构式见式2e)。

2e([2-(苯并噻唑-2'-基)-4-溴苯基]2,3,4,6-四乙酰基-β-D-葡萄糖苷)

R_f＝0.40(PE/AcOEt＝2/1)；(c＝0.40,MeCN)；m.p.224.5–226.5℃；¹H-NMR(500MHz,DMSO-d₆):δ＝8.52(d,J＝2.5Hz,1H,H_arom),8.11(d,J＝8.0Hz,1H,H_arom),8.05(d,J＝8.0Hz,1H,H_arom),7.81(dd,J＝9.0,2.5Hz,1H,H_arom),7.60–7.56(m,1H,H_arom),7.51–7.48(m,1H,H_arom),7.35(d,J＝9.0Hz,1H,H_arom),5.99(d,J_1,2＝8.0Hz,1H),5.43(t,J_4,5＝9.5Hz,1H,4-H),5.36(dd,J_2,3＝9.5,J_1,2＝8.0Hz,1H,2-H),5.10(t,J_2,3＝9.5Hz,1H,3-H),4.35(ddd,J_4,5＝10.0,J_5,6a＝5.5,J_5,6b＝2.5Hz,1H,5-H),4.21(dd,J_6a,6b＝12.5,J_5,6a＝5.5Hz,1H,6a-H),4.11(dd,J_6a,6b＝12.4,J_5,6b＝2.3Hz,1H,6b-H),2.03,1.99,1.98,1.88(4×s,4×3H,4×OCOCH₃)ppm.¹³C-NMR(126MHz,DMSO-d₆):δ＝170.42,170.14,169.79,169.54(4×OCO),160.44,153.20,151.80,135.97,135.05,131.51,127.13,126.20,124.41,123.43,122.02,118.17,115.43(13×C_arom),97.18(C-1),72.87,71.64,71.20,68.11,61.94(C-2,C-3,C-4,C-5,C-6),20.93,20.88,20.85,20.76(4×OCOCH₃)ppm.HRMS(ESI):m/z[M+Na]⁺calcd.for>27H₂₆BrNNaO₁₀S:658.0353；found658.0358.

(2)脱保护反应

向含[2-(苯并噻唑-2'-基)-4-溴苯基]2,3,4,6-四乙酰基-β-D-葡萄糖苷(2000mg,3.142mmol)的无水甲醇/四氢呋喃＝1/1的溶液(60mL)中加入KOH甲醇溶液(1mol/L,471μL,0.15e.q.)，室温下搅拌1h后结束。35℃水浴下旋蒸去除溶剂，先用二氯甲烷洗涤，再用少 量水洗涤，真空干燥后得白色粉末目标物(1603mg,产率为99％。其结构式见式3e，2-(苯并噻唑-2'-基)-4-溴苯基-β-D-葡萄糖苷(BTP3-Glu))。

R_f＝0.76(CHCl₃/MeOH＝5/1)；(c＝0.30,50％DMF)；m.p.231–233℃；¹H-NMR(500MHz,DMSO-d₆):δ＝8.55(d,J＝2.5Hz,1H,H_arom),8.11(dd,J＝12.3,8.0Hz,2H,2×H_arom),7.70(dd,J＝9.0,3.0Hz,1H,H_arom),7.58–7.54(m,1H,H_arom),7.49–7.45(m,1H,H_arom),7.36(d,J＝9.5Hz,1H,H_arom),5.42(d,J＝5.5Hz,1H,OH),5.29(d,J_1,2＝7.5Hz,1H,1-H),5.26(s,1H,OH),5.13(d,J＝3.5Hz,1H,OH),4.62(t,J＝5.3Hz,1H,OH),3.71(dd,J＝10.5,5.5Hz,1H),3.62(dd,J_6a,6b＝13.7,J_5,6a,＝8.2Hz,1H,6a-H),3.53–3.45(m,2H),3.37(d,J＝9.5Hz,1H),3.26(dt,J_6a,6b＝13.2,J_5,6b＝6.7Hz,1H,6b-H)ppm.¹³C-NMR(126MHz,DMSO-d₆):δ＝161.31,154.34,151.81,136.44,134.79,130.95,126.86,125.76,124.04,123.17,122.32,117.88,114.10(13×C_arom),100.71(C-1),77.72,77.31,73.63,69.98,61.01(C-2,C-3,C-4,C-5,C-6)ppm.HRMS(ESI):m/z[M+Na]⁺calcd.for>19H₁₈BrNNaO₆S:489.9930；found>

上述两步反应总产率为：90％×99％≈89％。

(二)糖苷的应用

(1)β-葡萄糖苷酶活性的溶液分析检测

取干净的6支试管等分成甲、乙、丙三组，各组中的两支试管分别标记A和B；均加入等体积的乙酸-乙酸钠缓冲液(0.2mol/L，pH 5.0，1974μL)，并分别均加入相同浓度、等体积的含底物的二甲亚砜溶液(0.01mol/L，16μL；甲：X-Glu；乙：BTP-Glu；丙：BTP3-Glu)，接着每组中的A试管均加入相同浓度、等量的被煮沸过的β-葡萄糖苷酶液(2μg/μL，10μL)作为空白对照，而B试管也均加入相同浓度、等量的保持活力的β-葡萄糖苷酶液(2μg/μL，10μL)，然后将所有试管置于37℃和有氧条件下孵育一定时间后观察。(注：此β-葡萄糖苷酶为购买的纯商品，来自苦杏仁，品牌为Fluka。底物最终浓度均为80μmol/L，共溶剂DMSO含量均为0.8％。)实验结果如图1和图2所示：

从图1和图2可以看出，对于含合成底物的缓冲液，被煮沸过的酶失去了活性而对它们均呈阴性，而保持活力的酶则对它们均呈阳性，这表明合成底物可用于对酶活性的分析。另外，也可看出X-Glu在pH 5.0这样的酸性条件下，被酶解后自动氧化为靛蓝色料的速率比较慢。在此，本发明虽然只是考察了合成底物对酶活性的定性分析，但是在相同底物浓度、相同孵育条件下，活酶量与颜色或荧光信号强度是成正比关系的，因此本发明涉及到这些合成底物也可以用于定量分析。

(2)对非变性电泳后凝胶上β-葡萄糖苷酶的定位染色检测

①电泳胶的配制及电泳条件：

8.5％分离胶(5mL)：2.15mL H₂O+1.42mL>

4％浓缩胶(2mL)：1.2mL H₂O+268uL>

电泳缓冲液：100mL 10×Tris-Glycine Gel Runing(pH 8.8)稀释至1L。

上样缓冲液：5x Protein Loading Buffer(No Deturation Buffer)。

上样酶量：1μgβ-葡萄糖苷酶。

电压条件：浓缩胶阶段恒压100V，分离胶阶段恒压160V。

②非变性电泳后操作：

切掉浓缩胶，小心将分离胶置于含10mL乙酸-乙酸钠缓冲液(0.2mol/L，pH 5.0)的培养皿中浸泡10min，然后转移至装有12mL含BTP3-Glu底物浓度为80umol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液(0.2M，pH 5.0)的培养皿中，并于37℃培养箱或烘箱中孵育1.5h。

365nm紫外光下观察结果(见图3)：

从上述结果可以看出，新型荧光底物BTP3-Glu染色时信号强度较高，定位效果好。另外，由于是活性染色，并且荧光物不与酶牢固结合，可以通过离心去除掉沉淀型的荧光物，因此，与变性电泳及共价染色处理如Westen-Blot相比，非变性电泳及合成底物的活性染色可使酶的结构信息尽可能的完好无损，由此推想可知能从后续的生物质谱分析、三维结构分析等获得更加直接、不容易失真的信息。

(3)对食源性致病菌的琼脂平板法检测

含底物琼脂平板的制备：称取一定量的哥伦比亚琼脂培养基置于干净的三角瓶中，加入定量的蒸馏水，加热预溶解，再分别加入定量的不同底物DMSO溶液，使合成底物的浓度均为100umol/L，含X-Gal或Magenta-Gal的培养基均再添加0.06g/L的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，适当振摇后，密封并于115℃下高压蒸汽灭菌15min，然后待培养基温度降至45℃左右时，摇匀并在无菌条件下迅速倒平板，水平放置使培养基凝固一段时间后待用。

1)对肺炎克雷伯氏菌的检测：以常见的条件致病菌和医源性感染菌及食源性致病菌的肺炎克雷伯氏菌CMCC(B)46117为检测目标菌，即阳性菌(同时含有β-葡萄糖苷酶和β-半乳糖苷酶)，另一致病菌鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028为对照阴性菌(既不含有β-葡萄糖苷酶，也不含有β-半乳糖苷酶)，经营养肉汤复壮后，将它们适当稀释，然后取适量菌液分别涂布接种于上述含不同底物的哥伦比亚琼脂培养基上，于37℃下培养24h。不同的底物呈现的结果(分别于可见光和365nm紫外光下观察)见图4至图9。

从图4-图9的结果对比中，可以看出：①所有底物只对阳性菌肺炎克雷伯氏菌CMCC46117呈现阳性反应，即表现显色反应，而对阴性菌鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028均无显色反应，即呈阴性反应；②BTP3-Glu能给出比BTP-Glu更强的荧光，这也说明BTP分子上的芳环被适宜的原子或基团取代后，其荧光强度会变强；③对于欲同时检测一种菌的两种酶的情况，采用两种显色底物时，目标菌落颜色呈现混合色，但其与采用单一显色底物时许多目标菌落的颜色没有形成很大的反差，甚至反差不明显，致使同时检测一种菌的两种酶的效果大打折扣；而采用显色底物与荧光底物混合时，由于它们各自的信号无明显相互干扰作用，都容易被辨别，因此能很好地同时检测一种菌的两种酶，这样也能使检测目标菌的特异性和准确性大大增强，也为同时检测多种微生物的应用提供了技术基础。

2)对粪链球菌和蜡样芽胞杆菌的检测

以粪链球菌ATCC 29212和蜡样芽胞杆菌CMCC 63301作为检测研究对象，哥伦比亚琼脂培养基中均同时含有针对同一种酶β-葡萄糖苷酶的X-Glu和BTP3-Glu，其结果分别见图10和11。

从图10和图11结果可以看出，采用显色底物与荧光底物混合时，它们各自的信号无明 显相互干扰作用，同时也增大了检测到β-葡萄糖苷酶的概率，从而增加检测的准确性。

(4)对食源性致病菌的显微成像应用研究

由琼脂平板上目标菌菌落周围没有显色的晕圈现象可知上述菌的β-葡萄糖苷酶为胞内酶。由此，上述使用到的合成底物只有进入菌体内并被胞内的β-葡萄糖苷酶水解才能发生显色反应。这样的显色反应使菌落染色，那对菌体是不是也都能给出如此清晰易辨别的染色结果呢？于是，本发明进行了显微成像应用研究，如下：

从上述琼脂平板中选择较大的目标菌落，用枪头小心地挑取适量的菌置于100μL无菌的生理盐水中搅匀，然后取菌液滴加于大的盖玻片或激光共聚焦显微镜专用的载玻片上，再用小一些的盖玻片小心盖上，要避免气泡，置于无菌操作台中晾干后用蔡司LSM 700激光共聚焦显微镜40倍油物镜(激发光波长为405nm，荧光检测模块采用DAPI)观察。各菌及成像结果见图12至15。

从上述显微成像结果(图12至15)对比可以看出，荧光底物也能使菌体染上清晰易辨别的荧光色，而显色底物对菌体的染色能力却远不如荧光底物强。