抑制SOX2基因表达的双链p‑siRNA分子和p‑siRNA重组质粒及其应用

摘要

本发明公开了一种抑制SOX2基因表达的双链p‑siRNA分子和p‑siRNA重组质粒及其应用，所述p‑siRNA为以下双链RNA分子中的任意一种：正义链5’‑CCCCGCGCGGCCGGCGGCGCGGGA‑3’反义链5’‑UCCCGCGCCGCCGGCCGCGCGGGG‑3’；或正义链：5′‑CCCCGCGCGGCCGGCGGCGCGGGAtt‑3′反义链：5′‑UCCCGCGCCGCCGGCCGCGCGGGGtt‑3′。本发明提供了一种新的高效靶向SOX2基因的广谱双链p‑siRNA和p‑siRNA重组质粒，同时还公开了其在试剂盒和制备抗肿瘤药物中的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种抑制SOX2基因表达的双链p-siRNA分子和p-siRNA重组质粒及其应用。

背景技术

恶性肿瘤已成为威胁人民健康与生命的一大杀手，全国每年新发病例1000多万，死亡病例250多万，每7-8人中就有一人死于恶性肿瘤。当前，肿瘤的主要治疗手段是使用手术切除病灶及通过放疗和化疗杀灭肿瘤细胞。但是，手术难以切除微小播散病灶。传统的放疗与化疗则缺乏特异性，在杀死肿瘤细胞的同时，也使体内的正常细胞受到严重的创伤。一些化疗药物还会促进肿瘤转移或使普通肿瘤细胞向肿瘤干细胞转变。因此，研发新的肿瘤治疗策略是全球临床及科研工作者所面临的重大问题。

针对肿瘤细胞中的重要致癌分子进行靶向治疗，可以精准高效的阻断肿瘤的发生发展，既提高疗效，又减少药物的用量，是肿瘤治疗中一个极有前景的新方向。

靶向治疗的目标包括：癌细胞的特殊抗原、生长因子受体、肿瘤血管生长相关因子、癌细胞特殊信号传递途径中的分子、促癌的核转录因子等。尤其是促癌的核转录因子，它们居于基因表达调控的上游位置，控制着下游一系列癌基因、抑癌基因的表达，对肿瘤细胞的增殖、浸润、转移、耐药等恶性行为起到关键作用。发现肿瘤中关键的促癌核转录因子并抑制它们的活动，有望“瀑布式”的阻断下游多个癌基因的表达，对肿瘤治疗起到良好效果。

转录因子SOX2是SRY-related HMG-box家族的一个重要成员，依靠其HMG结构域与DNA特定序列结合，激活或抑制下游基因的转录，受其直接调节的靶基因超过90个。最新的研究显示，SOX2在肺癌、肝癌、结肠癌宫颈癌、卵巢癌等多种肿瘤中均发生广泛的过表达，并直接激活肿瘤细胞中WT1、HDAC4、HDAC9、IGF1R、c-MYC、WNT1a等重要原癌基因的转录，对于肿瘤细胞的增殖、浸润转移、肿瘤干细胞自我更新能力的维持等都具有重要作用。因此，SOX2是肿瘤靶向治疗中一个新的理想靶标。

SOX2蛋白的空间构象比较特殊，缺乏与小分子化合物结合的口袋结构域，很难开发出抑制SOX2蛋白活性的小分子药物。用针对SOX2mRNA的小干扰RNA虽然可以抑制SOX2的翻译，但是其脱靶现象非常严重，会降低家族中其他成员，尤其是发挥抑癌作用的成员的表达。

靶向基因启动子区的小分子干扰RNA(p-siRNA)是一种新发现的小RNA，它们可以干扰特定基因启动子区转录起始复合物的组装，从而在转录水平上直接抑制该基因的表达，具有效率高、特异性强的优点，是针对特定关键致癌基因进行靶向治疗的有力新式武器。

发明内容

本发明的目的是提供一种抑制SOX2基因表达的双链p-siRNA分子和p-siRNA重组质粒及其应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种抑制SOX2基因表达的双链p-siRNA分子，所述p-siRNA为以下双链RNA分子中的任意一种：

正义链5’-CCCCGCGCGGCCGGCGGCGCGGGA-3’

反义链5’-UCCCGCGCCGCCGGCCGCGCGGGG-3’；

或

正义链：5′-CCCCGCGCGGCCGGCGGCGCGGGAtt-3′

反义链：5′-UCCCGCGCCGCCGC℃CGCGCGGGGtt-3′。

本发明还提供了一种p-siRNA重组质粒，所述的p-siRNA重组质粒包含前面所述的任意一种双链p-siRNA分子的序列。利用这样的重组质粒转染肿瘤细胞，能够有效的沉默SOX2基因，抑制肿瘤细胞增殖，从而能够有效的治疗肿瘤。进一步，该p-siRNA分子与p-siRNA重组质粒能够有效的用于抗肿瘤药物的制备，从而利用制备的抗肿瘤药物对患者进行给药，达到有效的治疗。

本发明还提供了一种SOX2基因沉默试剂盒，所述试剂盒包含前面所述的任意一种双链p-siRNA分子或p-siRNA重组质粒。利用本发明的试剂盒能够有效的对肿瘤细胞进行SOX2基因沉默，从而能够有效的治疗肿瘤。

本发明的p-siRNA分子可以作为抗肿瘤药物的有效成分，肿瘤疾病包括肺癌、肝癌、结肠癌、宫颈癌等。

本发明还提供了一种抗肿瘤药物，该药物含有有效量的p-siRNA分子或p-siRNA重组质粒，该抗肿瘤药物可以采用常规方法制备成相应制剂，如可被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。针剂、溶液等宜在无菌条件下制造。

本发明具有以下有益效果：

靶向于SOX2基因转录起始位点上游141bp至118bp的序列，通过干扰转录起始复合物的组装，直接有力抑制SOX2的转录，高效、特异的命中靶标。

附图说明

图1是化学合成的p-siRNA转染人肺癌细胞H446、肝癌细胞HepG2、结肠癌细胞HT29和宫颈癌细胞Hela后，实时荧光定量PCR检测SOX2mRNA表达量的结果。

图中：纵坐标表示相对于阴性对照组(NC)的SOX2mRNA相对表达量；横坐标表示五个处理组，分别为NC组，转染20nmol/L、40nmol/L、80nmol/L和120nmol/L p-siRNA组。

图2是WesternBlot检测p-siRNA转染四种癌细胞后，SOX2蛋白表达量，NC指阴性对照序列组，p-siRNA指转染80nmol/L p-siRNA组。

图3是化学合成的p-siRNA转染人肺癌细胞H446、肝癌细胞HepG2、结肠癌细胞HT29和宫颈癌细胞Hela后，MTT法检测p-siRNA对肿瘤细胞增殖能力的影响。

图中：纵坐标表示相对于阴性对照组的相对增值率；横坐标表示转染p-siRNA的浓度。

图4是80nmol/L p-siRNA转染人肺癌细胞H446、肝癌细胞HepG2、结肠癌细胞HT29和宫颈癌细胞Hela后，对肿瘤细胞克隆形成率的影响。

具体实施方式

为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：p-siRNA抑制SOX mRNA表达

步骤一、试剂及其试剂准备，以下实施例中，所使用的

仪器：荧光定量PCR仪(ABI 7500)；PCR仪(Biometra，T1 Thermobycler)；细胞培养箱(Thermo)等。

材料和试剂：RNAiMate(genepharma)，RPMI 1640培养基(Gibco)，Trizol(天根)，反转录试剂盒(DRR014A PrimeScript^TM，TaKaRa)，SYBR>

PCR引物：

SOX2正向引物：5’-TACAGCATGTCCTACTCGCAG-3’

SOX2反向引物：5’-GAGGAAGAGGTAACCACAGGG-3’

GAPDH正向引物；5’-TGTCCCCACTGCCAACGTGTCA-3’

GAPDH反向引物：5’-GCGTCAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3’

步骤二、化学合成p-siRNA

根据SOX2启动子转录起始位点上游141bp至118bp的序列，设计p-siRNA：

正义链：5’-CCCCGCGCGGCCGGCGGCGCGGGAtt-3’

反义链：5’-UCCCGCGCCGCCGGCCGCGCGGGGtt-3’

将该序列在人类基因组数据库中比对，确定没有与它相同的其它序列。siRNA由上海吉玛生物科技有限公司合成。

步骤三、荧光定量PCR检测SOX2基因mRNA水平

S31、细胞培养：人肺癌细胞H446、肝癌细胞HepG2、结肠癌细胞HT29和宫颈癌细胞Hela培养于含10％FBS的RPMI 1640培养基中，37℃、5％CO₂培养箱培养。

S32、细胞铺板并转染：将四种癌细胞以3.5×10⁴个/孔接种到24孔培养板中，每种细胞均设置阴性对照组、20nmol/L>2培养箱培养过夜，无双抗无血清的培养基中，按siRNA-Mate^TM说明书中的步骤，将合成的p-siRNA按相应的剂量转染四种细胞。

S33、转染48h后收集细胞，Trizol提取总RNA，TaKaRa Primer Script RT反转录试剂盒进行反转录。荧光定量PCR检测样本中SOX2mRNA表达水平，以GAPDH作为内参，采用法计算每个基因的相对mRNA表达量，每组实验做3个平行，每个实验重复三次，反应体系20μl，反应条件：95℃预变性5min，95℃变性10sec，60℃退火30sec，循环40次。

S34、结果分析：p-siRNA能够显著抑制SOX2基因的mRNA表达，具有一定的浓度依赖性。在p-siRNA为80nmol/L时，抑制效率即可达到75％以上。

实施例2：WesternBlot检测p-siRNA对SOX2蛋白表达的抑制情况

将人肺癌细胞H446、肝癌细胞HepG2、结肠癌细胞HT29和宫颈癌细胞Hela分别以1.5×10⁵个/孔接种到6孔细胞培养板中。在37℃、5％CO₂培养箱细胞培养24h，按siRNA-Mate^TM说明书中的步骤转染，设阴性对照组和80nmol/L>

结果分析：p-siRNA显著抑制SOX2的蛋白表达(图2)。

实施例3：p-siRNA抑制肿瘤细胞增殖

将人肺癌细胞H446、肝癌细胞HepG2、结肠癌细胞HT29和宫颈癌细胞Hela以5×10³个/孔分别接种到96孔细胞培养板中。在37℃、5％CO₂培养箱细胞培养24小时，按siRNA-Mate^TM说明书中的步骤转染p-siRNA，设阴性对照组、20nmol/L>

结果分析：p-siRNA能够显著抑制四种肿瘤细胞的增殖，并呈现浓度依赖性(图3)。

实施例4：p-siRNA抑制四种癌细胞的克隆形成率

将四种癌细胞以3.5×10⁴个/孔接种到24孔培养板中，按siRNA-Mate^TM说明书中的步骤，将合成的p-siRNA转染四种细胞，每种细胞均设阴性对照组和80nmol/L>2培养箱培养过夜。转染后24h，收集细胞，以1000个/孔的密度接种于6孔板，轻轻转动，使细胞分散均匀。置37℃、5％CO₂培养箱培养培养1周。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加1∶3醋酸/甲醇3mL，固定15分钟。结晶紫染液染10分钟，流水缓慢洗去染色液，空气干燥。在显微镜(低倍镜)下计大于40个细胞的克隆数，最后计算克隆形成率，克隆形成率＝(克隆数/接种细胞数)×100％。

结果分析：p-siRNA能够显著抑制四种肿瘤细胞的克隆形成能力(图4)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。