一种外源添加龙胆二糖缓解三七自毒伤害的方法

摘要

本发明涉及一种外源添加龙胆二糖缓解三七自毒伤害的方法，属植物保护技术领域。本发明方法的具体技术方案是：利用浓度为1.0～50.0mg/L的龙胆二糖溶液对三七种子进行浸种处理；或将龙胆二糖溶解于种衣剂适乐时中配制成含有浓度为5.0～500.0mg/L龙胆二糖的种衣剂，然后按照药种质量比1:50对三七种子进行包衣处理；或利用浓度为1.0～50.0mg/L的龙胆二糖溶液对种苗进行浸根处理。本发明的有益效果在于：通过外源抗氧化剂的添加，增强了三七的抗性，降低了三七生长过程中由于自毒物质导致细胞的伤害从而加大根腐病菌危害的机率，减少了农药的使用量，是一种生态、安全、有效的缓解连作障碍的措施。

说明书

技术领域

本发明涉及一种外源添加龙胆二糖缓解三七自毒伤害的方法，属植物保护技术领域。

背景技术

三七是我国大宗名贵中药材之一，但连作障碍严重制约三七的生产。现有研究表明，种植过三七的土壤10至20年后也不能连作，连作障碍已经成为限制三七产业健康发展的主要因素。多年来，众多学者围绕引起三七连作障碍的原因展开了深入的研究，认为连作障碍主要与根腐病菌的侵染、自毒物质的积累、土壤理化性状的恶化及土壤微生物区系的改变等因素有关。本课题组研究表明，三七生长过程中分泌至土壤中的皂苷类自毒物质是造成三七连作障碍严重发生的重要诱因。尤其在种子和种苗的出苗阶段，三七根系抵抗能力弱，土壤中残留的自毒物质严重影响种子种苗的出苗和生长。这些皂苷类自毒物质对三七种子萌发和根系生长具有明显的自毒作用，导致根系细胞死亡。根系细胞死亡后更有利于病原菌的侵染，加重根腐病的发生。课题组利用GC-TOF-MS技术进行代谢差异分析发现，自毒皂苷处理根系后会导致细胞体内的抗氧化物(龙胆二糖)含量迅速下降。自毒机制研究表明，自毒皂苷会导致根系活性氧(ROS)迸发，细胞膜被破坏，最终导致细胞死亡。为了维持细胞体内的ROS平衡，细胞会产生系列抗氧化酶和抗氧化物来消除多余的ROS，维持细胞氧化还原平衡。龙胆二糖是细胞体内产生的抗氧化物质，在维持细胞ROS平衡过程中起着重要作用。三七分泌的皂苷类自毒物质(如粗皂苷或皂苷单体Rg₁)处理三七根系后使细胞内的抗氧化物质含量降低，干扰了根系的氧化还原平衡，导致根系细胞内活性氧的大量积累造成氧化伤害，最终导致根系细胞死亡。因此，寻找一种方法来提高根系细胞的氧自由基清除能力，恢复由自毒物质造成的氧自由基积累失衡状态是克服自毒损伤、减轻连作障碍的重要途径。

本发明根据自毒作用机制研究的结果，提供一种外源添加龙胆二糖缓解三七自毒伤害的方法。该方法能安全有效地消除三七自毒伤害，缓解三七连作障碍。经文献检索，未见与本发明相同的公开文献报道。

发明内容

本发明针对三七生长过程中由皂苷类自毒物质引起的细胞氧化伤害，提供一种利用外源添加龙胆二糖来调节细胞氧化还原平衡，恢复根系氧化还原能力，减轻自毒物质伤害的方法。

本发明的具体技术方案是：利用浓度为1.0～50.0mg/L的龙胆二糖溶液对三七种子进行浸种处理；或将龙胆二糖溶解于种衣剂适乐时中配制成含有浓度为5.0～500.0mg/L龙胆二糖的种衣剂，然后按照药种质量比1:50对三七种子进行包衣处理；或利用浓度为1.0～50.0mg/L的龙胆二糖溶液对种苗进行浸根处理。这些处理方式均能有效缓解三七的自毒伤害，促进三七的出苗和生长。

所述的龙胆二糖种子浸种处理为：利用体积百分比为0.01％吐温80的去离子水将龙胆二糖配制成浓度1.0～50.0mg/L的溶液，然后将三七种子放入溶液中浸泡10min，取出晾干种子表面水分后播种；

所述的龙胆二糖种子包衣处理为：用体积百分比为0.01％吐温80的去离子水溶解后添加于三七种衣剂适乐时中，配制财务含有龙胆二糖浓度为5.0～500.0mg/L的种衣剂，然后按照药种质量比1:50的比例进行包衣处理，种子表面种衣剂晾干后播种；

所述的龙胆二糖种苗浸根处理为：利用体积百分比为0.01％吐温80的去离子水水溶解龙胆二糖，配制成浓度1.0～50.0mg/L的溶液，然后将三七种苗根系放入溶液中浸泡10min，取出晾干种苗根系表面水分后移栽。

本发明的有益效果在于：

1、利用种子浸种、包衣及种苗浸根的外源添加的方式补充三七根系细胞中龙胆二糖的含量，克服由于自毒物质导致的根系细胞内抗氧化物质龙胆二糖降低带来的氧自由基清除能力下降的问题，增强三七种子和种苗根系的抗氧化能力，减轻自毒物质的伤害。

2、通过外源抗氧化剂龙胆二糖的添加，增强了三七的抗性，降低了三七生长过程中由于自毒物质导致细胞伤害从而加大根腐病菌危害的机率，减少了农药的使用量，是一种生态、安全、有效地缓解三七连作障碍的措施。

具体实施方式：

实施例1:外源添加龙胆二糖增强根系细胞的抗氧化能力

一年生三七幼苗在试验荫棚中生长7个月后，选取健康的三七植株带回实验室，用自来水将根上的土冲洗干净再用无菌水冲洗3次后放入200mL组培瓶中进行液体培养。为了排除体积百分比为1‰甲醇对三七根系的影响，所有处理中均加入体积百分比为1‰的甲醇。试验共设置5个处理，即用浓度1.0mg/L Rg₁分别处理0h、3h、12h、24h和48h。每一处理设置4次重复，每一重复放入8棵三七苗。试验采用倒序法进行处理，所有处理均在无菌水中水培48h后取样，先将所有处理培养于无菌水中(100mL/瓶)，然后在距离取样时间3、12、24、48h时分别加入0.1mL浓度为1.0mg/L的人参皂苷Rg₁，对照为含有1‰甲醇的去离子水。处理后的三七苗置于人工气候箱中12h光暗交替培养，培养箱白天温度为25℃，夜间温度为20℃。取样时每个重复分别随机挑选4株三七苗取其须根，立刻用液氮冷冻，并置于-80℃冰箱保存。冻存的样品萃取并衍生化后，利用GC-TOF-MS对龙胆二糖相对含量的变化进行测定，同时利用HPLC结合标准品的方法进行不同处理时间根系中龙胆二糖的绝对定量分析。另外，将三七根系在自毒皂苷Rg₁处理的同时加入0.1、1.0、10.0、50.0和100.0mg/L的龙胆二糖溶液，隔12小时后取样，测定根组织中与清除活性氧相关酶系APX、SOD、POD、GST的含量变化。

结果表明，自毒皂苷Rg₁处理三七根系后，无论是用GC-TOF-MS测定的相对含量变化，还是用HPLC绝对定量分析的结果均表明根系组织内龙胆二糖的浓度在处理3h后急剧下调，随后开始缓慢上升(表1)。自毒皂苷Rg₁处理三七根系后12小时根系组织内的活性氧含量显著增高，表明根系细胞受到氧化损伤(表2)。自毒皂苷Rg₁处理的同时外源添加浓度0.1～50.0mg/L龙胆二糖处理能显著提高根组织内与H₂O₂清除相关的酶APX、SOD、POD、GST的活性，从而降低组织内的H₂O₂含量，减轻自毒物质的氧化损伤。但当龙胆二糖浓度升高至100.0mg/L时不能明显降低自毒伤害(表2)。

该实施例结果表明：自毒皂苷处理会导致根系抗氧化物龙胆二糖含量显著下降，根系对自毒物质的抵抗能力降低。但外源添加龙胆二糖处理后能显著增强根系的抗氧化能力，减轻自毒物质对根系的危害。

表1自毒皂苷Rg₁处理不同时间后三七根系中龙胆二糖含量变化

表2外源添加龙胆二糖处理对三七细胞活性氧积累和抗氧化相关酶的影响

实施例2:利用龙胆二糖浸种处理提高三七的出苗率

三七种子采集后去除果肉晾干种子表面的水分，用体积百分比为0.01％吐温80的去离子水配制浓度为0、0.1、1.0，10.0、50.0、100.0mg/L的龙胆二糖溶液浸泡种子10min，取出后晾干种子表面水分。然后将处理后的三七种子播种于添加浓度为1.0mg/L自毒皂苷Rg₁的土壤中，以未用龙胆二糖浸泡的三七种子种植于未添加自毒皂苷的新土为对照处理。每个处理设置3次重复，每个重复播种1000粒种子。播种后按照常规方法进行管理，待对照处理出苗率达到60％以上调查出苗率，比较抗氧化剂处理对三七种子出苗和生长的影响。

结果表明(表3)：三七种子播种于未添加自毒皂苷Rg₁的土壤中生长正常，但土壤中加入1.0mg/L的自毒物质Rg₁后显著抑制了三七种子的出苗、株高、根长和根重的生长指标。当三七种子用浓度1.0～50.0mg/L的龙胆二糖浸种处理后能显著缓解自毒皂苷对出苗和生长的抑制，三七种子的出苗率、株高、株重和根长均显著高于未添加自毒物质的对照处理。但当三七种子用0.1和100mg/L的龙胆二糖处理后不能明显缓解自毒作用，这表明龙胆二糖对自毒作用的缓解作用存在明显的剂量效应。上述试验结果表明，利用浓度1.0～50.0mg/L的龙胆二糖对三七种子进行浸种处理后能够有效缓解自毒物质的危害。

表3龙胆二糖溶液浸种处理对三七种子萌发和生长的影响

实施例3:利用龙胆二糖种子包衣处理有效缓解皂苷自毒伤害

三七种子采集后去除果肉晾干种子表面的水分，分别利用含龙胆二糖浓度为0、5.0、50.0，500.0、2500.0、5000.0mg/L的种衣剂适乐时按照药种质量比1:50的比例混合进行包衣处理，种衣剂晾干后播种。然后将处理后的三七种子播种于添加浓度为1.0mg/L自毒皂苷Rg₁的土壤中，以仅用种衣剂适乐时处理的三七种子种植于未添加自毒皂苷的新土为对照处理。每个处理设置3次重复。每个重复播种1000粒种子。播种后按照常规方法进行管理，待对照处理出苗率达到60％以上调查出苗率，比较抗氧化剂龙胆二糖包衣处理对三七种子出苗和生长的影响。

结果表明(表4)：土壤中加入自毒物质Rg₁后对三七出苗率的抑制率达到22％。但三七种子用含有浓度5.0～500.0mg/L龙胆二糖的种衣剂包衣后能显著缓解自毒皂苷对出苗的抑制作用。当种衣剂中龙胆二糖浓度超过2500.0mg/L时不能明显缓解自毒作用，三七株高、根长和根重受到显著抑制。这表明龙胆二糖包衣处理浓度需要控制在5.0～500.0mg/L的范围内。

表4抗坏血酸溶液包衣处理对三七种子萌发和生长的影响

实施例4:利用龙胆二糖浸根处理提高三七种苗的出苗率

三七种苗采挖后去除根系黏附的土壤，用体积百分比为0.01％吐温80的去离子水配制浓度为0、0.1、1.0、10.0、50.0、100.0mg/L的龙胆二糖溶液浸泡种苗10min，取出晾干根系表面水分后移栽。种苗移栽于添加浓度为1.0mg/L自毒皂苷Rg₁的土壤中，以未用龙胆二糖浸泡的三七种苗种植于未添加自毒皂苷的新土为对照处理。每个处理设置3次重复。每个重复移栽100株种苗。播种后按照常规方法进行管理，待对照处理出苗率达到60％以上调查出苗率，比较抗氧化剂浸根处理对三七出苗和生长的影响。

结果表明(表5)：土壤中加入自毒物质Rg₁后显著抑制了三七种苗出苗率、株高、株重、根重和根长的生长指标。种苗用浓度1.0～50.0mg/L的龙胆二糖浸根处理后能有效缓解自毒皂苷对出苗的抑制，种苗的出苗率和长势与对照处理相当，甚至优于对照。但浓度为0.1和100.0mg/L的龙胆二糖不能有效缓解自毒伤害。这表明利用龙胆二糖灌根处理的浓度需要控制在1.0～50.0mg/L的范围内。

表5龙胆二糖溶液浸根处理对三七种苗生长的影响