一种基于氯化血红素催化反应的四环素比色检测方法

摘要

本发明公开了一种基于氯化血红素催化反应的四环素比色检测方法，包括将功能性ssDNA序列与含有四环素的样品混匀孵育，制备出待检测样液的步骤；还包括将待检测样液与氯化血红素混匀孵育，之后加入磷酸二氢钠缓冲溶液混匀，然后加入H2O2和TMB，通过测定混合溶液在450nm处吸光值变化来判断四环素的含量的步骤。本发明提供的检测方法不需要依赖大型仪器设备，检测特异性性好，且操作简单快速，借助手持型比色计就可以实现四环素残留现场检测，因而可以广泛应用于食品中四环素残留的快速检测。

说明书

技术领域

本发明属于食品中抗生素残留检测领域，通过紫外可见光测定氯化血红素(Hemin)催化的反应底物在450nm的吸光值以及颜色变化，可实现四环素的比色检测。

背景技术

四环素(TET)是从放线菌金色链丛菌(Streptomyces aureofaciens)的培养液等分离出来的抗菌物质，具有良好的杀菌抑菌作用。作为一种广谱抗生素，四环素对革兰氏阳性菌、阴性菌、立克次体、滤过性病毒、螺旋体等都有良好的抑制作用。由于其低廉的价格，良好的广谱抗菌作用，被广泛的应用于畜牧以及水产养殖行业。近年来，由于商业化利益驱使，四环素不合理使用甚至滥用的现象日益严重，导致动物源性产品中四环素残留过量，严重威胁消费者身体健康。当前，大部分国家都对动物源性食品中四环素在动物源性食品中的残留进行了严格监控，对残留量有着严格规定。中国“动物性食品中兽药最高残留限量”规定，肌肉组织中四环素类的最高残留限量(MRL)为100μg/L。欧盟规定肌肉牛奶中四环素类化合物含量不能超过100ng/g，美国食品药品监督管理局规定牛奶中四环素最大残留为900nM/L。

目前已报道的四环素类药物残留量的分析方法有微生物检测法、放射免疫测定法、胶体金免疫层析实验测定法、酶联免疫法、薄层色谱法、分子印记技术、毛细管电泳法和高效液相色谱-串联质谱法等。色谱方法准确性好，分辨率和灵敏度较高，重现性好，样品需要量少，能同时进行多种物质的分离，但是其仪器昂贵、要求样品纯度高、前处理复杂、导致检测成本高、周期长，无法适应快速大批量检测需要。免疫学方法虽然能够实现快速检测，灵敏性高，特异性强，能够同时对多样品进行分析等优点，然而抗体制备复杂，检测重现性差，导致结果稳定性差。毛细管电泳法、微生物学法等检测方法方便快捷，但准确性差，特异性不好，无法对样品进行精确分析。因此，需要建立一种快速准确的四环素检测新方法。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种简单快速检测四环素的方法，它具有特异性强、操作便捷，检测快速等优势，可广泛应用于食品中四环素残留的快速检测。

本发明的基本原理是：本发明采用的试剂主要包括功能性ssDNA序列，氯化血红素(Hemin)，双氧水(H₂O₂)和3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)等。Hemin在磷酸二氢钠缓冲溶液中具有辣根过氧化物酶活性，在H₂O₂存在下可催化一定量TMB失去1个电子，生成蓝色产物在650nm左右展现出显著特征吸收峰。当Hemin与功能性ssDNA序列发生作用后，其辣根过氧化物酶活性显著增强，可以使底物TMB失去2个电子，生成黄色产物在450nm处展现特征吸收峰。当体系中存在四环素(TET)，则Hemin催化活性受到抑制，导致反应产物在450nm处吸光值显著降低。由于四环素浓度与产物吸光值下降的幅度(ΔA)成正比，所以通过测定产物吸光值变化或通过观察颜色变化，可以判定四环素的含量。

在磷酸二氢钠缓冲液体系下，于氯化血红素催化反应的四环素的便捷检测方法，主要包含以下步骤：

步骤1：将功能性ssDNA序列与含有四环素的样品混匀孵育，制备出待检测样液；

步骤2：将待检测样液与氯化血红素混匀孵育，之后加入磷酸二氢钠缓冲溶液混匀，然后加入H₂O₂和TMB，通过测定混合溶液在450nm处吸光值变化来判断四环素的含量。

具体包括以下详细步骤：

(1)制备已知四环素浓度的检测体系：取15支1.5mL刻度离心管，分别加入5μL功能性ssDNA序列溶液和5μL不同浓度的四环素标准液，使得整个检测体系中的四环素含量维持在10-200nM，充分混匀后置于30℃条件下孵育1h，之后加入5μL Hemin溶液继续孵育30min。最后再加入磷酸二氢钠缓冲溶液至500μL，充分混匀后留作以下测定用。

(2)另取1支按步骤(1)方法制备的检测溶液，加入5μL三蒸水替代四环素标准液，处理后作为空白对照体系溶液。

(3)分别向步骤(1)和步骤(2)制备的标准溶液和空白对照液中加入10μL H₂O₂与10μL>

(4)以不同浓度的四环素测定的ΔA(空白样品的吸光值-待测样品的吸光值)作图，绘制标准曲线。

(5)制备样品检测体系：取5μL实际样液，按步骤(1)方法制备的检测溶液，充分混匀后按步骤(3)方法测定其450nm处吸光值。

(6)根据样品测得的吸光值，查标准曲线，可以求得不同样品中四环素的含量。

本发明提供的检测方法不需要依赖大型仪器设备，检测特异性性好，且操作简单快速，借助手持型比色计就可以实现四环素残留现场检测，因而可以广泛应用于食品中四环素残留的快速检测。

附图说明

图1展示了考查检测四环素的可行性，图中：1.Hemin+ssDNA；2.Hemin+ssDNA+50nM TET；3.Hemin+ssDNA+200nM TET；4.Hemin+H₂O；5.Hemin+TET；

图2展示了不同浓度四环素与吸光值变化(ΔA)对应关系；

图3.展示了不同种类抗生素对四环素检测的影响；

图4展示了本发明应用于乳制品中四环素的检测示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。实施例中如涉及数值或数值比例，如无注明均指质量数值或质量比例。

实施例1：

制备已知四环素浓度的检测体系：取15支1.5mL刻度离心管，分别加入5μL浓度为100nM功能性ssDNA序列母液和5μL不同浓度的四环素标准液，使得整个检测体系中的四环素含量维持在10-200nM。功能性ssDNA序列组成为：5’-ATCGGGTGTGGGTGGCGTA AAGGGAGCATCGGACA-3’。上述溶液充分混匀后置于30℃条件下孵育30min，之后加入5μL浓度为1mM的Hemin母液继续孵育30min。最后再加入磷酸二氢钠缓冲溶液至500μL，充分混匀后留作以下测定用。

(2)另取1支按步骤(1)方法制备的检测溶液，加入5μL三蒸水替代四环素标准液，处理后作为空白对照体系溶液。

(3)分别向步骤(1)和步骤(2)制备的标准溶液和空白对照液中加入10μL 2MH₂O₂与10μL>

(4)以不同浓度的四环素测定的ΔA(450nm)作图，绘制标准曲线，如图3所示。得到线性范围10～100nM，其对应的回归方程为y＝4×10^-3C+0.105，其中C指四环素浓度(nM)。

(5)制备样品检测体系：如图5所示，取5μL随机购买的不同乳制品(分别命名为牛奶-1和牛奶-2)样本，按步骤(1)方法制备的检测溶液，充分混匀后按步骤(3)方法测定其吸收峰值。

(6)根据样品测得的吸光度值，查标准曲线，可以求得不同样品中四环素的含量。

(7)实际样本检测效果验证：用本发明方法测定2份随机购买取得的牛奶-1和牛奶-2，分别往样品中加入100nM和150nM的四环素，得到的回收率分别为98％和102％，证明本发明可靠性。

(8)本发明方法可以测定浓度范围为10-200nM的四环素，其最低检测限为5.69nM。

应当指出的是：对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些变形和改进都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

SEQUENCE LISTING

序列表

<110>贵州大学

<120>一种基于氯化血红素催化反应的四环素比色检测方法

<130>nm:

<160>1

<170>PatentIn version

<210>1

<211>35

<212>ssDNA

<213>人工序列

<400>1

ATCGG GTGTG GGTGG CGTAA AGGGA GCATC GGACA 35