一种紫红曲霉菌株及利用该菌株发酵生产红曲色素的方法

摘要

本发明提供了一种紫红曲霉菌株，其保藏编号为CGMCC 11611；本发明还提供了一种利用该菌株发酵生产红曲色素的方法，该方法包括以下步骤：(1)取保藏的紫红曲霉进行孢子培养，获得孢子液；(2)将孢子液接种到发酵培养基中，发酵培养36‑60h后，添加L型氨基酸和D型氨基酸，继续发酵培养；(3)发酵完毕后，用乙醇萃取红曲色素。本发明公开了一种新的紫红曲霉菌株，其可以用于发酵生产红曲色素。本发明红曲色素的发酵生产方法以氨基酸为诱导剂，诱导红曲霉产生红曲色素，所制得的红曲色素使得脂肪酶活性降低至＜110U；所用氨基酸成本较低易得，同时诱导产生色素含量高，具有较强的脂肪酶抑制性；本发明发酵生产红曲色素的方法简单，易操作。

说明书

技术领域

本发明属于微生物发酵的技术领域，具体涉及一种紫红曲霉菌株及利用该菌株发酵生产红曲色素的方法。

背景技术

在我国以及很多欧美国家，肥胖已成为一种常见的病症。引起肥胖的因素有很多，包括遗传因素、环境因素、饮食习惯、生活习惯等，其中进食过多，尤其是高脂肪食物的过多摄入是导致肥胖的主要原因。因此肥胖人群不仅应该降低食物的热量还应该限制脂肪的摄入，限制脂肪摄入的一条途径就是抑制体内的脂肪酶活力，如果能够阻止脂肪的消化吸收，同时配以低脂肪膳食，对高脂肪引起的肥胖和疾病将会有很大的改善。脂肪酶可以将脂肪水解成为自由脂肪酸和甘油，脂肪酶用来产生能量，储藏在脂肪组织中。所以，如果人体中如果脂肪酶被抑制，脂肪吸收和肥胖都能够被控制。四氢利泼斯汀(Tetrahydrolipstatin)是一种商业化的抑制肥胖的制剂，也是较好的脂肪酶抑制剂。

在亚洲地区，红曲色素是一种天然的食品着色剂，有着悠久的食用习惯。已有大量研究报道红曲色素能够降低哺乳动物体内的胆固醇和甘油三酯含量，提高人体免疫力和抑菌等作用，但是研究红曲色素对脂肪酶的抑制性的研究并不多。目前，董夏莲等通过D-青霉胺(D-penicillamine简称D-Pen)对红曲霉进行诱导，发现可以产生具有脂肪酶抑制活性的红曲色素，但是D-Pen价格昂贵，不适合在工业生产中大量使用。因此，寻找一种价格低廉的诱导剂，使得具有脂肪酶抑制活性的红曲色素能够广泛用于食品生产中，是亟待解决的难题。

发明内容

为了解决现有技术中红曲色素不能工业化生产的问题，本发明提供了一种紫红曲霉菌株及利用该菌株发酵生产红曲色素的方法，该方法简单有效，且易于工业化操作，能够提高具有脂肪酶抑制活性的红曲色素的产量。

本发明提供了一种紫红曲霉菌株MN-1，其保藏编号为CGMCC 11611。

所述菌株MN-1建议的分类命名为紫红曲霉，拉丁学名为Monascus purpureus；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2015年11月30日，保藏编号为CGMCC11611。

本发明中紫红曲霉菌株的菌落特征：在麦芽汁琼脂培养基(MEA)上生长较为局限，25℃黑暗条件下培养10d，菌落直径为29-35mm，边缘不规则，气生菌丝稀疏，浅到暗橙色；菌落背面红褐色。

显微特征：分生孢子较少，分生孢子梗特化不明显，直或稍弯曲，分生孢子球形，无色，壁光滑，基部平截，串生，5.6-11μm。未见成熟闭囊壳及子囊孢子。其Calmodulin基因序列如序列表中序列1所示。

本发明还提供了一种利用该紫红曲霉菌发酵生产红曲色素的方法，该方法包括以下步骤：

(1)取保藏的紫红曲霉进行孢子培养，将得到的孢子溶解分散成浓度为10³-10⁷cfu/ml的孢子液；

(2)将孢子液接种到发酵培养基中，接种量为5-9％，发酵培养36-60h后，添加L型氨基酸和D型氨基酸，继续发酵培养；

(3)发酵完毕后，用乙醇萃取红曲色素。

本发明红曲色素的发酵生产方法中在发酵培养基中添加L型氨基酸和D型氨基酸，以氨基酸作为诱导剂诱导生产红曲色素。氨基酸成本较低易得，同时诱导产生色素含量高，且具有较强的脂肪酶抑制性。本发明制备红曲色素的方法简单，易操作。

进一步的，步骤(1)中，取保藏的紫红曲霉在琼脂固体培养基上进行孢子培养，培养温度为28-32℃，培养时间为5-9d。

进一步的，琼脂固体培养基的配方为：碳源3-4％、氮源0.5-1％、矿物质0.2-0.5％，其中，碳源为可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖中的一种或多种，氮源为硝酸钠、硝酸铵、氯化铵、牛肉膏、酵母粉、酪蛋白氨基酸、蛋白胨中的一种或多种，矿物质为磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钾、中的一种或多种。

进一步的，将琼脂固体培养基上的紫红曲霉孢子用灭菌铲子刮下来后，接种到液体培养基中，28-32℃条件下扩大培养45-50h。

进一步的，液体培养基的配方为：碳源4-6％、氮源1.5-2.5％、矿物质0.9-1％，其中，碳源为果糖、可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖中的一种或多种，氮源为细菌蛋白胨、硝酸钠、硝酸铵、氯化铵、牛肉膏、酵母粉、酪蛋白氨基酸中的一种或多种，矿物质为磷酸二氢钾、氯化钠、硫酸镁中的一种或多种。

进一步的，步骤(2)中，L型氨基酸为甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、精氨酸中的一种或多种，L型氨基酸的添加量为0.25-0.45％。

进一步的，D型氨基酸为甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、色氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸中的一种或多种，D型氨基酸的添加量为0.25-0.45％。

进一步的，发酵培养基的配方为：碳源8-10％、氮源0.8-1.2％、矿物质0.1-0.25％，其中，碳源为可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖中的一种或多种，氮源为硝酸钠、硝酸铵、氯化铵、牛肉膏、酵母粉、酪蛋白氨基酸、蛋白胨中的一种或多种，矿物质为磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钾、硫酸铁中的一种或多种。发酵培养基的pH为6.0-7.0。

进一步的，步骤(2)中，发酵培养的条件为：摇床转速为150-200r/min，温度为28-32℃，时间为5-7d。

本发明的有益效果为：本发明公开了一种新的紫红曲霉菌株，其可以用于发酵生产红曲色素。本发明红曲色素的发酵生产方法以氨基酸为诱导剂，诱导红曲霉产生红曲色素，所制得的红曲色素可以抑制脂肪酶活性，使得脂肪酶活性降低至＜110U；所用氨基酸成本较低易得，同时诱导产生色素含量高，具有较强的脂肪酶抑制性；本发明发酵生产红曲色素的方法简单，易操作。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。本发明中，所有的试剂盒原料均可从市场获得或者是本行业常用的。下面实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

本发明中紫红曲霉发酵生产物的检测方法如下：

1、菌丝体生物量测定

菌丝体干重的测定：发酵液用三层纱布过滤，再用蒸馏水洗涤2-3次，拧干水分，在60℃烘箱中烘干至恒重，即为菌丝干重。

2、色素的提取和定量

取10ml发酵液，于4000r/min离心15min，取上清液1ml，加入70％的乙醇9ml，于60℃保温2h，用70％的乙醇进行适当稀释后按照GB 4926-85《中华人民共和国国家标准-食品添加剂红曲米》规定的方法测定色价，结果以505nm下的吸光度值表示色价高低。

3、脂肪酶抑制活性测定

以对硝基苯酚棕榈酸酯(p-NPP)为底物，在最佳酶促反应条件下，底物p-NPP与脂肪酶作用生成产物为对硝基苯酚(pNP)。根据一定时间内pNP的生成量来确定脂肪酶的活力。

4、桔霉素测定方法

参考GB/T 5009.222-2008《红曲类产品中桔霉素的测定》测定发酵产物中桔霉素的含量。

实施例1

本发明提供了一种紫红曲霉菌株MN-1，其保藏编号为CGMCC 11611。所述菌株MN-1建议的分类命名为紫红曲霉，拉丁学名为Monascus purpureus；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2015年11月30日，保藏编号为CGMCC 11611。

本发明还提供了一种利用该紫红曲霉菌发酵生产红曲色素的方法，该方法包括以下步骤：

(1)取保藏的紫红曲霉在琼脂固体培养基(琼脂固体培养基的配方为：蔗糖3％、酵母粉0.5％、磷酸二氢钾0.15％、硫酸镁0.05％，以上％为质量体积比)上进行孢子培养，培养温度为28℃，培养时间为5d；

将培养在琼脂固体培养基上的紫红曲霉孢子用灭菌铲子轻轻刮下来后，用生理盐水调节孢子数为10⁵cfu/ml；取该含有孢子的生理盐水接种至液体培养中，30℃下摇床180r/min培养48h，进行孢子液的制备，其中液体培养基的配方为：果糖5％、蛋白胨2％、磷酸二氢钾0.8％、氯化钠0.1％、硫酸镁0.05％，以上％为质量体积比。

(2)将孢子数为10⁵cfu/ml的孢子液接种到发酵培养基中，30℃下摇床180r/min培养6d；其中发酵培养基的配方为：蔗糖10％、酪蛋白氨基酸1％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.05％、氯化钾0.05％、硫酸铁0.001％，以上％为质量体积比，接种量为培养基体积的7％；

发酵培养48h后，添加L型亮氨酸和D型亮氨酸，L型亮氨酸的添加量为培养基体积的0.35％，D型亮氨酸的添加量为培养基体积的0.35％。

(3)发酵完毕后，用体积分数为70％的乙醇萃取红曲色素。

培养6d后菌体量为6.8g，发酵液吸光度值为0.7，脂肪酶活性为95.22U，未检出桔霉素。

实施例2

本发明提供了一种紫红曲霉菌株MN-1，其保藏编号为CGMCC 11611。所述菌株MN-1建议的分类命名为紫红曲霉，拉丁学名为Monascus purpureus；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2015年11月30日，保藏编号为CGMCC 11611。

本发明还提供了一种利用该紫红曲霉菌发酵生产红曲色素的方法，该方法包括以下步骤：

(1)取保藏的紫红曲霉在琼脂固体培养基(琼脂固体培养基的配方为：葡萄糖3.5％、酵母粉0.6％、磷酸二氢钾0.2％、氯化钠0.05％、硫酸镁0.05％，以上％为质量体积比)上进行孢子培养，培养温度为30℃，培养时间为7d；

将培养在琼脂固体培养基上的紫红曲霉孢子用灭菌铲子轻轻刮下来后，用生理盐水调节孢子数为10³cfu/ml；取该含有孢子的生理盐水接种至液体培养中，28℃下摇床150r/min培养45h，进行孢子液的制备，其中液体培养基的配方为：蔗糖6％、酵母粉1.5％、磷酸二氢钾0.75％、氯化钠0.1％、硫酸镁0.05％，以上％为质量体积比。

(2)将孢子数为10³cfu/ml的孢子液接种到发酵培养基中，30℃下摇床180r/min培养5d；其中发酵培养基的配方为：葡萄糖12％、酵母粉0.8％、磷酸二氢钾0.15％、硫酸镁0.05％、氯化钾0.05％，以上％为质量体积比，接种量为培养基体积的9％；

发酵培养36h后，添加L型酪氨酸和D型色氨酸，L型酪氨酸的添加量为培养基体积的0.2％，D型色氨基酸的添加量为培养基体积的0.3％。

(3)发酵完毕后，用体积分数为70％的乙醇萃取红曲色素。

培养5d后菌体量为6.2g，发酵液吸光度值为0.62，脂肪酶活性为100.23U，未检出桔霉素。

实施例3

本发明提供了一种紫红曲霉菌株MN-1，其保藏编号为CGMCC 11611。所述菌株MN-1建议的分类命名为紫红曲霉，拉丁学名为Monascus purpureus；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2015年11月30日，保藏编号为CGMCC 11611。

本发明还提供了一种利用该紫红曲霉菌发酵生产红曲色素的方法，该方法包括以下步骤：

(1)取保藏的紫红曲霉在琼脂固体培养基(琼脂固体培养基的配方为：果糖4％、酪蛋白氨基酸1％、磷酸二氢钾0.2％、氯化钠0.15％、硫酸镁0.15％，以上％为质量体积比)上进行孢子培养，培养温度为32℃，培养时间为9d；

将培养在琼脂固体培养基上的紫红曲霉孢子用灭菌铲子轻轻刮下来后，用生理盐水调节孢子数为10⁷cfu/ml；取该含有孢子的生理盐水接种至液体培养中，32℃下摇床200r/min培养50h，进行孢子液的制备，其中，液体培养基的配方为：葡萄糖4％、酪蛋白氨基酸2.5％、磷酸二氢钾0.85％、氯化钠0.1％、硫酸镁0.05％，以上％为质量体积比。

(2)将孢子数为10⁷cfu/ml的孢子液接种到发酵培养基中，32℃下摇床200r/min培养7d；其中发酵培养基的配方为：麦芽糖8％、牛肉膏1.2％、磷酸二氢钾0.05％、硫酸镁0.05％、氯化钾0.05％，以上％为质量体积比。

发酵培养60h后，添加L型色氨酸和D型酪氨酸，L型色氨酸的添加量为培养基体积的0.45％，D型酪氨酸的添加量为培养基体积的0.45％。

(3)发酵完毕后，用体积分数为70％的乙醇萃取红曲色素。

培养7d后菌体量为6.0g，发酵液吸光度值为0.6，脂肪酶活性为100.45U，未检出桔霉素。

实施例4

本发明提供了一种紫红曲霉菌株MN-1，其保藏编号为CGMCC 11611。所述菌株MN-1建议的分类命名为紫红曲霉，拉丁学名为Monascus purpureus；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2015年11月30日，保藏编号为CGMCC 11611。

本发明还提供了一种利用该紫红曲霉菌发酵生产红曲色素的方法，该方法包括以下步骤：

(1)取保藏的紫红曲霉在琼脂固体培养基(琼脂固体培养基的配方为：葡萄糖3.5％、酵母粉0.6％、磷酸二氢钾0.2％、氯化钠0.05％、硫酸镁0.05％，以上％为质量体积比)上进行孢子培养，培养温度为30℃，培养时间为7d；

将培养在琼脂固体培养基上的紫红曲霉孢子用灭菌铲子轻轻刮下来后，用生理盐水调节孢子数为10³cfu/ml；取该含有孢子的生理盐水接种至液体培养中，28℃下摇床150r/min培养45h，进行孢子液的制备，其中液体培养基的配方为：蔗糖6％、酵母粉1.5％、磷酸二氢钾0.75％、氯化钠0.1％、硫酸镁0.05％，以上％为质量体积比。

(2)将孢子数为10³cfu/ml的孢子液接种到发酵培养基中，30℃下摇床180r/min培养5d；其中发酵培养基的配方为：葡萄糖12％、酵母粉0.8％、磷酸二氢钾0.15％、硫酸镁0.05％、氯化钾0.05％，以上％为质量体积比，接种量为培养基体积的9％；

发酵培养36h后，添加L型酪氨酸、L型苯丙氨酸和D型色氨酸，L型酪氨酸的添加量为培养基体积的0.2％，L型苯丙氨酸的添加量为培养基体积的0.2％，D型色氨酸的添加量为培养基体积的0.4％。

(3)发酵完毕后，用体积分数为70％的乙醇萃取红曲色素。

培养5d后菌体量为6.1g，发酵液吸光度值为0.65，脂肪酶活性为98.42U，未检出桔霉素。

实施例5

本发明提供了一种紫红曲霉菌株MN-1，其保藏编号为CGMCC 11611。所述菌株MN-1建议的分类命名为紫红曲霉，拉丁学名为Monascus purpureus；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2015年11月30日，保藏编号为CGMCC 11611。

本发明还提供了一种利用该紫红曲霉菌发酵生产红曲色素的方法，该方法包括以下步骤：

(1)取保藏的紫红曲霉在琼脂固体培养基(琼脂固体培养基的配方为：果糖4％、酪蛋白氨基酸1％、磷酸二氢钾0.2％、氯化钠0.15％、硫酸镁0.15％，以上％为质量体积比)上进行孢子培养，培养温度为32℃，培养时间为9d；

将培养在琼脂固体培养基上的紫红曲霉孢子用灭菌铲子轻轻刮下来后，用生理盐水调节孢子数为10⁷cfu/ml；取该含有孢子的生理盐水接种至液体培养中，32℃下摇床200r/min培养50h，进行孢子液的制备，其中，液体培养基的配方为：葡萄糖4％、酪蛋白氨基酸2.5％、磷酸二氢钾0.85％、氯化钠0.1％、硫酸镁0.05％，以上％为质量体积比。

(2)将孢子数为10⁷cfu/ml的孢子液接种到发酵培养基中，32℃下摇床200r/min培养7d；其中发酵培养基的配方为：麦芽糖8％、牛肉膏1.2％、磷酸二氢钾0.05％、硫酸镁0.05％、氯化钾0.05％，以上％为质量体积比。

发酵培养60h后，添加L型色氨酸、L型精氨酸、D型亮氨酸和D型酪氨酸，L型色氨酸的添加量为培养基体积的0.2％，L型精氨酸的添加量为培养基体积的0.2％，D型亮氨酸的添加量为培养基体积的0.2％，D型酪氨酸的添加量为培养基体积的0.2％，。

(3)发酵完毕后，用体积分数为70％的乙醇萃取红曲色素。

培养5d后菌体量为7.5g，发酵液吸光度值为0.75，脂肪酶活性为90.46U，未检出桔霉素。

对比例1

红曲霉孢子液培养和红曲发酵液制备方法同实施例1，其中红曲发酵液制备的发酵培养基中，不添加氨基酸，培养6d后菌体量为2.25g，发酵液吸光度值为0.38，脂肪酶活性为465.80U。

对比例2

红曲霉孢子液培养和红曲发酵液制备方法同实施例2，其中红曲发酵液制备的发酵培养基中，分别只添加L型的甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、精氨酸，或者只添加D型的甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、色氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸，上述氨基酸的的添加量为培养基体积的0.3％。发酵过程中产生的色素衍生物，进行脂肪酶活性测定实验。结果见表1，如表1所示，与未添加氨基酸的发酵条件相比，脂肪酶活性没有显著差异。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明实质内容上所作的任何修改、等同替换和简单改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

表1添加氨基酸后制得的红曲色素对脂肪酶活性的影响