一种基于Hg2+辅助及双聚合酶等温核酸扩增技术的microRNA检测方法

摘要

本发明公开了一种基于Hg2+辅助及双聚合酶等温核酸扩增技术的microRNA检测方法，属于光学生物传感技术领域。基于聚合酶Klenow片段和末端脱氧核苷酸转移酶共同催化作用，将microRNA有效延伸成长度较长的聚胸腺嘧啶碱基序列，加入Hg2+后形成T‑Hg2+‑T双链结构，SYBR Green І荧光染料插入到T‑Hg2+‑T双链结构中使SYBR Green І的荧光增强，荧光增强的程度与microRNA的浓度呈正相关，据此实现microRNA的灵敏检测。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于Hg²⁺辅助及双聚合酶等温核酸扩增技术的microRNA检测方法，属于光学生物传感技术领域。

背景技术

MicroRNA是一类长度在19-23个碱基、内源性非蛋白编码的RNA分子，在许多生物过程中起着举足轻重的作用。生物体内microRNA通过抑制翻译或降解目标信使核糖核酸分子的方式来实现对蛋白质表达的调控作用。近年来，研究发现microRNA表达水平的改变与癌症的种类、发展阶段甚至药物疗效等息息相关。所以，探索灵敏度高、选择性好的microRNA检测新方法具有重要意义。Northern印迹技术和微阵列技术都是microRNA检测的常用方法，但是它们的灵敏度较低，选择性较差，而且操作步骤费力耗时，限制了以上方法在生化分析方面的应用，尤其是其在临床诊断方面的推广。

基于序列扩增的检测方法由于具有显著的信号放大能力而成为强有力的生物分析工具，尤其在研究microRNA的检测新方法方面，基于序列扩增的信号放大方法显示出巨大的潜能。目前，常用的序列扩增方法有聚合酶链反应、链置换反应和滚环扩增技术等，且大多基于荧光分析的检测方法以SYBR Green І荧光染料作为信号源。SYBR Green І具有良好的光学性能、温度稳定性和灵敏性，可以插入DNA双链中，与DNA双链结合后发出强的荧光信号，但是它对单链核酸也有一定的非特异性吸附。因此，需要发展一种既可以形成双链又可以避免非特异性吸附的检测方法。基于此，我们提出一种基于Hg²⁺辅助及双聚合酶等温核酸扩增技术的microRNA检测方法，利用T-Hg²⁺-T双链结构避免了因杂交而引入单链的非特异性吸附、错配以及链置换反应的发生，提高了SYBR>

发明内容

本发明的目的在于提供了一种基于Hg²⁺辅助及双聚合酶等温核酸扩增技术的microRNA检测方法，该方法对microRNA检测具有简单、灵敏和快速的优点。

本发明是这样来实现的，一种基于Hg²⁺辅助及双聚合酶等温核酸扩增技术的microRNA检测方法，其特征在于，当microRNA存在时，引物microRNA与模板DNA杂交形成引物-模板复合物；加入聚合酶Klenow片段使其绑定在引物-模板复合物中引物的3'-羟基末端，催化引物延伸反应，生成与模板DNA互补的短DNA序列；加入末端脱氧核苷酸转移酶，将脱氧三磷酸胸腺嘧啶核苷添加到生成的短DNA序列的3'-羟基末端，催化短DNA序列从5'端向3'端延伸而形成聚胸腺嘧啶碱基序列；加入Hg²⁺，形成T-Hg²⁺-T双链结构，SYBR>2+-T双链结构中并使SYBR>

本发明采用以下技术方案：

（1）将microRNA与模板DNA混合，80 °C退火杂交5 min后慢慢冷却至室温，加入含聚合酶Klenow片段、脱氧三磷酸胸腺嘧啶核苷和末端脱氧核苷酸转移酶的三羟甲基氨基甲烷醋酸盐缓冲溶液，在37>2+并完全混合后，在37>2+-T双链结构溶液；

（2）将SYBR Green І加入步骤（1）反应形成的T-Hg²⁺-T双链结构溶液中，混合后移入离心管中，用三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液稀释至200>

上述方法中，步骤（1）中，所述的三羟甲基氨基甲烷醋酸盐缓冲溶液的浓度为20 mM，pH 7.9，含50 mM KAc、10 mM Mg(Ac)₂和0.25>2。步骤（2）中，所述的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液的浓度为10>2。

本发明的技术效果是：本发明利用聚合酶Klenow片段和末端脱氧核苷酸转移酶对脱氧三磷酸胸腺嘧啶核苷在microRNA-DNA复合物上延伸的共同催化作用，形成聚胸腺嘧啶碱基序列，加入Hg²⁺后形成T-Hg²⁺-T双链结构，SYBR>2+-T双链结构中使SYBR>

附图说明

图1是基于Hg²⁺辅助及双聚合酶等温核酸扩增技术的microRNA检测原理图。

图2是（A）荧光光谱图：(a)不含和(b)含microRNA-21。内插图：琼脂糖凝胶电泳图。条带M：ladder marker；条带0和1分别是(0)不含和(1)含microRNA-21的样品。（B）含microRNA-21时产物的原子力显微镜图。

图3是荧光光谱图：(a)>-+TdTase，(b)>-，(c)>-；条带3：cpDNA+microRNA-21+TdTase；条带4：cpDNA；条带5：cpDNA+microRNA-21+KFexo^-+TdTase。

图4是不同浓度的microRNA-21（0，10，20，30，50，100，200，500，1000，2000，5000，10000 pM）存在时的荧光光谱图。内插图：荧光光谱强度与microRNA-21浓度的对数线性相关曲线。

图5是分析方法的特异性：Blank，microRNA-141，microRNA-210，单碱基错配的microRNA-21（SM），完全互补的microRNA-21（PM）。

图6是实际样品检测：Blank，人类肺癌表皮细胞（A549），人类乳腺癌细胞（MCF-7）。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步阐述，本发明并不限于此。

实施例1

（1）将microRNA与模板DNA（cpDNA）混合，80 °C退火杂交5 min后慢慢冷却至室温，加入含聚合酶Klenow片段（KFexo^-）、脱氧三磷酸胸腺嘧啶核苷和末端脱氧核苷酸转移酶（TdTase）的20>2和0.25>2的三羟甲基氨基甲烷醋酸盐缓冲溶液，在37>2+并完全混合后，在37>2+-T双链结构溶液；

（2）将5 μL SYBR Green І加入T-Hg²⁺-T双链结构溶液中，混合后移入离心管中，用10>2的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液稀释至200>

由图2A可见，当microRNA-21存在时，出现了SYBR Green І的强荧光（曲线a），表明microRNA-21引发聚合反应并生成大量的双链扩增产物。没有microRNA-21的空白对照的荧光则很微弱（曲线b），表明没有发生扩增反应。采用琼脂糖凝胶电泳对双聚合酶延伸胸腺嘧啶的反应产物进行分析（内插图），当存在microRNA-21时，反应产物呈现出明显的拖尾条带（条带1），表明生成了高分子量的聚胸腺嘧啶碱基结构；而当没有microRNA-21存在时，则未获得高分子量的产物（条带0），表明没有发生扩增反应。进一步采用原子力显微镜表征反应产物，由图2B可见，当存在microRNA-21时，形成了不同长度的核酸扩增产物，这个结果与琼脂糖凝胶电泳相符合。

实施例2

通过荧光光谱和聚丙烯酰胺凝胶电泳研究聚合反应过程中两种聚合酶对反应的影响。由图3可见，在cpDNA+microRNA-21溶液中，只有当聚合酶KFexo^-和TdTase都存在时，SYBR>-和TdTase的共同作用。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳对双聚合酶延伸胸腺嘧啶的反应产物进行分析（内插图），当只有聚合酶TdTase或KFexo^-时，没有扩增产物生成（条带1-4）；而当聚合酶TdTase和KFexo^-同时加入时（条带5），生成了大量扩增产物，因产物太长以至于留在样品孔中，没有进入电泳凝胶。以上结果证实了所提出的检测方法是由目标microRNA引发，两种聚合酶协同催化扩增反应，当加入Hg²⁺辅助时，以SYBR>

实施例3

图4为SYBR Green І荧光强度随microRNA-21浓度的变化。SYBR Green І的荧光强度随microRNA-21浓度的增加而增强， microRNA-21浓度为10 pM-10 nM范围内，SYBR Green І荧光强度与microRNA-21浓度的对数呈良好的线性关系（内插图），对microRNA-21的检测限为5 pM。

为了评估本方法对microRNA-21检测的特异性，开展了对照实验：采用microRNA-210、microRNA-141和单碱基错配（SM）microRNA-21为阴性对照，不含microRNA-21的样品为空白对照（Blank），结果如图5所示。MicroRNA-210和microRNA-141存在时，SYBR Green І的荧光强度与空白对照相近；单碱基错配microRNA-21存在时，SYBR Green І的荧光强度比空白对照的荧光强度稍有增强；然而，完全互补（PM）microRNA-21存在时，SYBR Green І的荧光强度与空白对照的荧光强度相比显著增强。由此可见，本方法可区别完全互补和非互补的microRNA，即使只有一个碱基的差异也能识别，具有良好的特异性。

为了探讨本方法在复杂生物基质中定量检测microRNA的可行性，我们将本方法应用于定量检测从人类乳腺癌细胞（MCF-7）和人类肺癌表皮细胞（A549）提取的细胞溶解产物中microRNA-21的表达含量。由图6可见，A549细胞溶解产物中SYBR Green І的荧光强度比空白对照的荧光强度有所增加，表明在A549肺癌细胞中含有少量microRNA-21。而MCF-7细胞溶解产物中SYBR Green І的荧光强度与空白对照的荧光强度相比显著增强，表明MCF-7乳腺癌细胞中microRNA-21的含量比较高。以上结果表明，本方法可用于细胞溶解产物等复杂生物样品中microRNA的定量分析，具有广泛的应用前景。