一种以非编码lnc‑CXCL1及编码基因cxcl1组合为检测或诊断筛查标志物的重症肌无力检测试剂盒及应用

摘要

本发明公开了一种以非编码RNA lnc‑CXCl1及编码基因cxcl1组合为检测或诊断筛查标志物的重症肌无力检测试剂盒及应用。该试剂盒通过相对定量的检测重症肌无力患者外周血标本中lnc‑CXCL1和编码基因cxcl1的表达水平，用于重症肌无力患者筛查、临床症状QMG评分以及评判激素治疗的效果。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及以非编码lnc-CXCL1及编码基因cxcl1组合为检测或诊断筛查标志物的重症肌无力检测试剂盒及应用。

背景技术

重症肌无力(myasthenia gravis，MG)是神经肌肉接头相关疾病中最常见的自身免疫性疾病，典型的临床表现为波动性的全身骨骼肌易疲劳和无力，包括呼吸肌的受累。其在世界范围内的患病率约40-180/100万，年发病率约为4-12/100万，近年来随着检测技术的提高，新的抗体的不断被发现，MG的发病率呈上升趋势，尤其是晚发型MG。根据受累部位的不同、发病年龄的不同和血清抗体类型的不同，可将MG分为不同的亚型。尽管大多数MG的预后较好，但几乎所有的MG需要长时间的药物治疗，据统计仍有10-15％的患者不能用药物完全控制疾病进展或者以承受免疫抑制剂严重的副作用为代价，极大的影响了患者的生活质量，加重了家庭与社会的负担。因此对MG发病机制的研究和特异性治疗药物的开发正日益引起科研、临床工作者的重视。

非编码RNA(Non-coding RNA，ncRNA)是指在基因转录后不能继续进行翻译的RNA分子，其中具有调控作用的称为调控非编码RNA，调控非编码RNA根据其片段的长度可粗略分为短链非编码RNA(miRNA、siRNA和piRNA等)和长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)。LncRNAs是长度大于200bp的长链RNA分子。全基因组水平非编码基因序列的研究发现，在人类基因组中大约有10,000～200,000种不同类型lncRNAs被转录。LncRNA的来源不一，可以为编码基因结构的中断、ncRNAs复制过程中的反向移位、染色质的重排、编码基因开放阅读框的突变以及转位子插入到编码基因的片段等等。近年来的研究表明，lncRNAs具有广泛的生物学功能，可通过以下机制参与细胞凋亡、分化、发育等多种重要的调控过程：1.募集染色体重塑复合体到特定的基因位点来标记基因沉默区域；2募集转录因子来促进或抑制基因表达.；3.转录基因的反义链lncRNA可调控转录基因相应mRNAs的剪接或引导其降解。LncRNAs在免疫系统中也有着不可忽视的作用，它参与了免疫细胞的活化和分化。LncRNA可以调控CD8⁺T细胞和CD4⁺T细胞的激活与分化，并且随着T细胞的分化而呈现出动态的变化，对T细胞的发育凋亡起关键作用。Bolland>

编码基因cxcl1是CXCR2⁺家族细胞的趋化因子，如中性粒细胞；非编码Lnc-CXCL1是编码cxcl1的不表达的不同转录本，其表达和生物学功能还未见报道。因此本实验中我们采用荧光定量PCR同时检测了非编码Lnc-CXCL1和编码基因cxcl1在MG患者和正常对照组中的表达，发现非编码Lnc-CXCL1和编码基因cxcl1的ΔC_T表达上升，即相对表达下降，根据这个结果，研制一种以非编码lnc-CXCl1及编码基因cxcl1为检测或诊断筛查标志物的重症肌无力检测试剂盒。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种以非编码Lnc-CXCL1及编码基因cxcl1组合为检测或诊断筛查标志物的重症肌无力检测试剂盒。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

所述以非编码lnc-CXCL1及编码基因cxcl1组合为检测或诊断筛查标志物的重症肌无力检测试剂盒包括如下引物对：

A、非编码lnc-CXCL1的实时定量的特异性PCR引物对如下：

正向引物：5’-AGTCAGTGAGTCTCTTCTTCCCT-3’(SEQ ID NO.1)；

反向引物：5’-CACCAGTGAGCTTCCTCCTC-3’(SEQ ID NO.2)；

B、编码基因cxcl1实时定量的特异性PCR引物对如下：

正向引物：5’-GCGCGCAGCAGGAGCGT-3’(SEQ ID NO.3)；

反向引物：5’-CACCAGTGAGCTTCCTCCTC-3’(SEQ ID NO.4)；

C、GAPDH的实时定量的特异性PCR引物对如下：

正向引物：5’-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3’(SEQ ID NO.5)；

反向引物：5’-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3’(SEQ ID NO.6)。

所述的非编码RNA lnc-CXCL1及编码基因cxcl1组合可用于制备重症肌无力检测或诊断筛查标志物，还可用于制备重症肌无力检测或诊断生物芯片等。

所述的非编码lnc-CXCL1及编码基因cxcl1组合的实时定量的特异性PCR引物和GAPDH的实时定量的特异性PCR在制备重症肌无力检测试剂中的评判阈值如下：

非编码lnc-CXCL1实时定量的特异性PCR在制备重症肌无力检测试剂中的评判阈值ΔC_T大于7.0，以及编码基因cxcl1实时定量的特异性PCR在制备重症肌无力检测试剂中的评判阈值ΔC_T大于8.0，存在重症肌无力危险，建议进行进一步筛查。

非编码lnc-CXCL1阈值ΔC_T大于7.0和编码基因cxcl1阈值ΔC_T大于8.0时与临床症状QMG评分相关。

经激素治疗有效后，其非编码lnc-CXCL1和编码基因cxcl1阈值ΔC_T比治疗前降低，其激素治疗效果越显著。

上述试剂盒中还包括本领域提取RNA的常规试剂，如下：淋巴细胞分离液；RNAiso Plus；无水乙醇；三氯甲烷；异丙醇。DEPC水或无酶水。TaKaRa的PrimeScript^TM>

上述非编码RNA lnc-CXCL1及编码基因cxcl1组合实时定量的特异性PCR引物和GAPDH的实时定量的特异性PCR引物可用于制备重症肌无力检测试剂。

发明人已检测了非编码RNA lnc-CXCL1及编码基因cxcl1在28例MG门诊患者和20例正常对照者中的表达，所有MG患者首次就诊前6个月内均未给予免疫调节或免疫抑制剂等药物治疗，就诊前均未行胸腺切除术，不合并其他免疫性疾病。QMG评分用来量化MG患者的疾病严重度。各组年龄、性别之间均无统计学差异。结果显示，与正常对照组相比较，MG患者PBMC中Lnc-CXCL1的ΔC_T表达明显大于正常健康人(p<0.0001)，Lnc-CXCL1与cxcl1编码基因时同一染色体上的DNA的不同转录本，因此我们也检测了cxcl1编码基因的表达，结果显示，MG患者PBMC中cxcl1编码基因的ΔC_T表达较正常对照组明显上升(p<0.0001)，差异有统计学意义。并且我们采用皮尔森相关性分析24例MG患者PBMC中Lnc-CXCL1和cxcl1的表达与患者首次采集血样时的QMG相关性分析；如图2所示，发现PBMC中Lnc-CXCL1(r＝-0.7862，p﹤0.0001)和cxcl1(r＝-0.5345，p＝0.0071)的ΔC_T表达与MG患者临床症状严重度评分(QMG)呈正相关性。

激素治疗是MG患者中最常用的一线的免疫治疗，本研究中28例MG患者第一次就诊采集标本后，其中有19例给予了强的松小剂量递增法治疗(起始剂量为20-30mg/日，每周增5mg，直到每日剂量达到1mg/kg，然后维持治疗4周)，我们对其中12例进行了随访，维持治疗4周后进行第二次采集标本，QMG评分。当临床症状减轻，QMG评分降低50％及以上，视为激素治疗有效组(6例)，小于25％视为激素治疗效差组(6例)。我们对比了激素治疗前后Lnc-CXCL1，cxcl1编码基因的表达变化。如图3所示，激素治疗有效组中，Lnc-CXCL1，cxcl1编码基因的ΔC_T表达治疗后明显比治疗前下降，差异有统计学意义；然而，在激素治疗效差组中，Lnc-CXCL1，cxcl1编码基因的表达治疗前后却无明显变化。

这些结果提示非编码RNA lnc-CXCL1及编码基因cxcl1是重症肌无力诊断、预测、检测或筛查的重要标志物之一。因此，本发明开发的以非编码lnc-CXCL1及编码基因cxcl1组合为基础的判断重症肌无力发生、以及预后标志物的试剂盒具有深远的临床意义和推广性。本发明试剂盒通过相对定量的检测重症肌无力患者外周血标本中非编码RNA lnc-CXCL1及编码基因cxcl1的表达水平，用于重症肌无力筛查和诊断。

附图说明

图1非编码RNA lnc-CXCL1及编码基因cxcl1的ΔC_T在重症肌无力患者外周血单个核细胞中的表达；图中：a：非编码RNA>

图2 nc-CXCL1及cxcl1的ΔC_T表达水平与MG患者QMG评分的相关性；24例MG患者PBMC中Lnc-CXCL1和cxcl1的ΔCT表达与患者首次采集血样时的QMG相关性分析；pearson相关性分析示PBMC中Lnc-CXCL1的ΔCT表达与MG患者QMG评分呈正相关，r＝-0.638，p＝0.0006；_CXCL1的ΔCT表达与MG患者QMG评分呈正相关，r＝-0.5345，p＝0.0071；

图3 Lnc-CXCL1及cxcl1在重症肌无力患者激素治疗后的表达；图中：a～b:Lnc-CXCL1及CXCL1编码基因在6例激素治疗有效患者中的表达；c～d:Lnc-CXCL1及CXCL1编码基因在6例激素治疗效差患者中的表达。两组之间采用成对的t检验，a～b:*P<0.05,**P<0.01。

具体实施方式

实施例中所用常规试剂均为市售，实施例中所述的引物对如下：

A、非编码lnc-CXCL1的实时定量的特异性PCR引物对如下：

正向引物：5’-AGTCAGTGAGTCTCTTCTTCCCT-3’(SEQ ID NO.1)；

反向引物：5’-CACCAGTGAGCTTCCTCCTC-3’(SEQ ID NO.2)；

B、编码基因cxcl1实时定量的特异性PCR引物对如下：

正向引物：5’-GCGCGCAGCAGGAGCGT-3’(SEQ ID NO.3)；

反向引物：5’-CACCAGTGAGCTTCCTCCTC-3’(SEQ ID NO.4)；

C、GAPDH的实时定量的特异性PCR引物对如下：

正向引物：5’-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3’(SEQ ID NO.5)；

反向引物：5’-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3’(SEQ ID NO.6)。

一、RNA提取方法：

(1)用EDTA抗凝采血管采取外周肘静脉血样标本5ml，放置4℃保藏；

(2)3000rpm室温离心10min，小心吸出上层血清。

(3)向剩余的血液样本中加入等体积PBS(1×)液，充分吹打混匀稀释血样；

(4)将上述稀释后的血样靠壁缓慢地加入到另一已加入等体积的淋巴细胞分离液的离心管中，并使上述混合液处于淋巴细胞分离液液面之上(即两种液体不要混合，保留清晰的界面)，2400rpm室温离心20min；

(5)用移液枪小心吸取离心后标本中第二层白细胞层，装入一新的无酶离心管中，3000rpm，4℃离心10min，弃上清；

(6)加入1ml PBS(1×)液洗涤白细胞，4℃离心10min，弃上清；

(7)重复上述步骤6

(8)加入1mlRNAiso plus，吹打溶解细胞至白色絮状物完全消失，室温(15-30℃)静置5分钟使核蛋白体完全分解(注意：若不继续做完整个提取，震荡后可直接放入-80℃冻存)

(9)每1mlRNAiso plus加入200ul氯仿；若为冻存标本，需从-80℃冰箱中取出后在冰上溶解，剧烈震荡15s(使充分变性)，室温静置5分钟后12000rpm，4℃离心15min，吸取上清转移到另一新的离心管中；

(10)加入200ul氯仿，室温静置5分钟后12000rpm，4℃离心15min，吸取上清转移到另一新的离心管中；

(11)加入与上清液等体积的异丙醇，上下颠倒混匀后，室温放置30min。

(12)12000rpm，4℃离心10min，小心吸弃上清；

(13)加入1ml的75％乙醇(DEPC水配制)，上下颠倒混匀后；7500rpm，4℃离心5min。

(14)弃上清，室温干燥5-10min，待残余的乙醇挥发完全后，加入适量的DEPC水溶解RNA沉淀，存于-80℃。用分光光度计测定RNA的浓度。

二、RNA质量检测：

ND-1000测定RNA浓度和纯度，

测量前先用溶解RNA用的DEPC水调零，滴加2.0ul洗涤测量基座的三次，用擦镜纸擦拭，加2.0ul样本测定RNA的浓度。RNA的质量检测标准之一，260nm/280nm的比值在1.7-2.0之间为合格样本，样本除了260nm的峰外无明显的杂峰。

三、RNA逆转录方法：

(1)融解lncRNA反转录所需的试剂，上下轻微颠倒混匀，短暂离心后放置冰上待用

(2)去除基因组DNA反应

按表1所示成分于冰上配制反应混合液至总体积10ul

表1

上述混匀液配制后混匀，在42℃下反应2min，反应结束后置冰上备用。

(3)lncRNA反转录反应液的配制

在冰上的预冷RNase free的反应管内加入表2所示试剂至总体积25μl。

表2

Note:在反应中使用的total RNA必须含有小分子RNA；Total RNA使用量可在1ng～5μg之间调整,如使用纯化的小分子RNA，其使用量可在0.1ng～1μg之间调整。RT Primer是市售反转录反应液自带引物，为oligoT或者是Random。

(4)反转录反应

混匀配制的反应液，短暂离心后在37℃下反应15min，结束后再进行85℃5sec灭活处理。所得的反转录产物可用无酶水稀释4倍并冰上放置以进行下游qPCR实验。

四、荧光定量PCR检测方法：

(1)融解All-in-One miRNA qRT-PCR Detection Kit中的2×All-in-One qPCR mix上

下轻微颠倒混匀，短暂离心后放置冰上待用。

(2)冰上进行qPCR反应液的配制(所有测试进行复孔测试)，分别分成三份，一份检测Lnc-CXCL1在样本中的表达，一份检测cxcl1在样本中的表达，第三份份检测GAPDH在同一个样本中的表达。见表3。

表3

Note：待所有试剂溶剂彻底溶解后，依次按照顺序加入各种反应试剂于PCR管中，用离心机“soft”离心，确保所有试剂都在PCR管底部。Lnc-CXCL1，cxcl1 or GAPDH primer F(20uM)即Lnc-CXCL1，cxcl1实时定量的特异性PCR正向引物或GAPDH的实时定量的特异性PCR正向引物；Lnc-CXCL1，cxcl1 or GAPDH primer R(20uM)即Lnc-CXCL1，cxcl1的实时定量的特异性PCR反向引物或GAPDH的实时定量的特异性PCR反向引物。

(3)进行Real Time PCR反应

建议采用表4显示的两步法PCR反应程序。

表4

五、结果计算

ΔC_T值的测定：ΔC_T是指同一样本中，待测定非编码Lnc-CXCL1和编码基因cxcl1的C_T与内参GAPDH的C_T的差值，即非编码Lnc-CXCL1＝Lnc-CXCL1-GAPDH的C_T，编码基因cxcl1＝cxcl1C_T-GAPDH的C_T，在本发明中，ΔC_T是三个平行试验中的平均值。在我们的实验验证结果中，健康对照组的Lnc-CXCL1ΔC_T的平均值在5.95±1.00，重症肌无力患者的Lnc-CXCL1ΔC_T的平均值为9.02±3.38，在健康对照组中，93.75％的人的Lnc-CXCL1ΔC_T小于7.0，而在重症肌无力患者组中85.7％以上的病人的ΔC_T值大于7.0。其中编码基因cxcl1ΔC_T健康对照组的平均值在6.56±1.2，重症肌无力患者的编码基因cxcl1ΔC_T的平均值为10.14±1.9，在健康对照组中，87.5％的人的cxcl1ΔC_T小于8.0，而在重症肌无力患者组中82.1％以上的病人的ΔC_T值大于8.0。因此，在本发明所述试剂盒中，建议非编码lnc-CXCL1实时定量的特异性PCR在制备重症肌无力检测试剂中的评判阈值ΔCT大于7.0，以及编码基因cxcl1实时定量的特异性PCR在制备重症肌无力检测试剂中的评判阈值ΔCT大于8.0，时存在重症肌无力危险，建议进行进一步筛查。同时通过pearson相关性分析发现，非编码lnc-CXCL1和编码基因cxcl1的ΔCT与MG患者的临床症状QMG评分呈正相关性。经激素治疗后，在激素治疗有效组中，发现非编码lnc-CXCL1和编码基因cxcl1阈值ΔCT比治疗前降低，具有统计学意义，而在在激素治疗无效组中，其阈值ΔCT变化不明显，因此其治疗后阈值ΔCT的变化可以间接反映激素治疗的效果。