长链非编码RNA lnc-LEMGC、编码基因KIF26B对胃癌浸润、转移的调控作用及相关机制研究

摘要

第一部分 长链非编码RNA lnc-LEMGC发挥促进胃癌细胞增殖，抑制浸润、转移的作用
　　本课题在利用高通量lncRNA表达谱芯片筛选胃癌转移相关lncRNA的基础上，使用Real-time PCR在另外独立样本中进一步验证，随后利用生物信息学和相关实验进行lnc-LEMGC的精细基因分析，结合功能学实验明确lnc-LEMGC与胃癌转移的相关性。我们利用生物素标记的lnc-LEMGC对胃癌细胞的蛋白组分进行RNA pull-down，亲和纯化后结合质谱分析等实验鉴定lnc-LEMGC的直接结合蛋白，通过全基因组芯片进一步确定lnc-LEMGC/结合蛋白复合物调控的下游靶点，取得以下研究结果:
　　(1)通过lncRNA芯片筛选技术发现，lncRNAs在非肿瘤胃粘膜组织、转移性胃癌与非转移性胃癌中存在差异表达。转移性胃癌组织中特异表达的lncRNAs谱可以将转移性胃癌组织与未转移性胃癌组织进行准确的判别。通过数据分析及大样本验证筛选出转移性胃癌组织与未转移性胃癌组织中差异表达明显的lncRNAs进行深入的功能学及机制的研究，我们将其命名为lnc-LEMGC。利用Real-time PCR在芯片样本中验证lnc-LEMGC的表达水平。另外选取76例独立的胃癌样本检测lnc-LEMGC的表达水平。与芯片结果一致，扩大样本后lnc-LEMGC在未转移性胃癌组织中的表达水平明显高于转移性胃癌组织。
　　(2)利用在线网站对lnc-LEMGC进行基因学特征的综合查找，确定lnc-LEMGC定位在1号染色体长臂，其序列包含小的开放阅读框，但全长不具备编码蛋白的能力。应用RNA原位杂交技术在胃癌细胞爬片和组织切片上标记lnc-LEMGC显示，lnc-LEMGC主要表达在细胞质，细胞核中只有少量表达。
　　(3)普通Transwell小室、伤口愈合实验以及基质胶侵袭实验显示，lnc-LEMGC过表达能够降低胃癌细胞SGC7901、BGC823的迁移和侵袭能力;反之，抑制lnc-LEMGC表达水平则促进胃癌细胞的迁移、侵袭能力。MTS、EdU实验则显示lnc-LEMGC过表达对胃癌细胞SGC7901、BGC823增殖能力影响差异表达不显著。体外细胞学实验提示lnc-LEMGC抑制胃癌细胞浸润转移。
　　接下来，我们进一步利用荷瘤裸鼠来验证以上实验结论。动物实验分两组进行，第一组所接种的胃癌细胞来源于我们利用流式分选仪筛选稳定过表达lnc-LEMGC的SGC7901细胞系;第二组是采用慢病毒系统构建lnc-LEMGCknockdown的胃癌BGC823细胞系。小动物活体荧光示踪技术揭示，lnc-LEMGC在裸鼠体内促进皮下移植瘤的生长，但是抑制胃癌细胞在裸鼠体内的转移能力。过表达lnc-LEMGC后，小鼠的皮下移植瘤生长速度较快，瘤体比对照组大。干扰lnc-LEMGC的BGC823细胞组，裸鼠皮下肿瘤体积较明显对照组明显小，并且瘤体中心均出现坏死。在转移模型中，过表达lnc-LEMGC后裸鼠肺部转移灶比对照组少。lnc-LEMGC抑制体内胃癌细胞转移的现象在BGC823细胞组同样观察到，干扰lnc-LEMGC后，裸鼠肺部转移灶明显增多。
　　(4)lnc-LEMGC特异性引物扩增lnc-LEMGC全长并克隆至pcDNA3.1(+)载体，同时克隆lnc-LEMGC反向载体作为lnc-LEMGC pull-down实验的阴性对照。体外转录合成生物素标记的lnc-LEMGC，亲和纯化后利用液相色谱和质谱联用平台鉴定lnc-LEMGC结合的蛋白。从质谱分析结果中，结合相关基因的已有文献报道，筛选介导lnc-LEMGC发挥作用的结合蛋白为DNA-PKcs。
　　(5)pPEGF-lnc-LEMGC与vector control分别转染胃癌细胞株SGC790148h后，mRNA表达芯片筛选差异表达的基因，利用Kyoto Encyclopedia of Genes andGenomes(KEGG)网站对差异基因进行pathway分析，结合已有的基因功能报道，初步确定lnc-LEMGC调控的下游靶基因。前期工作中，我们在胃癌细胞株干扰lnc-LEMGC表达后，使用mRNA表达芯片分析显示，与细胞迁移、浸润有关的ErbB信号通路中（包括ErbB1、Src、FAK、Ras、MEK、Myc等），特别是TGFA-ErbB1-Src-FAK信号通路的分子出现连续性的改变。采用Real-time PCR和Western blot验证了lnc-LEMGC对该信号通路的调控作用。
　　同时，基因芯片结果显示VEGFA随着lnc-LEMGC表达量升高而升高。Real-time PCR和Western blot验证了lnc-LEMGC在胃癌细胞系中对其调控作用。在裸鼠皮下瘤体实验中我们观察到，干扰lnc-LEMGC后肿瘤中心发生坏死。这一结果提示我们lnc-LEMGC促进胃癌细胞增殖可能是通过调控VEGFA实现对肿瘤血管生成的影响实现的。
　　以上研究结果阐明了lncRNA协同结合蛋白DNA-PKcs通过不同的信号通路调控胃癌发生发展。一方面调控ErbB信号通路抑制胃癌细胞浸润转移，另一方面调控VEGFA影响血管生成促进胃癌细胞增殖的作用机制。该课题不仅扩展了 lncRNA在胃癌中的研究，也为今后胃癌转移相关lncRNA的研究建立基础平台。
　　第二部分 KIF26B通过激活VEGF信号通路调控胃癌增殖、转移
　　在第一部分中，我们对lnc-LEMGC调控胃癌发生发展的分子机制进行研究，首先检测lnc-LEMGC是否发挥顺式作用调控邻近编码基因SMYD3和KIF26B的表达。尽管结果显示，lnc-LEMGC表达水平的改变与邻近的两个蛋白编码基因（SMYD3和KIF26B）没有相关性，但是通过样本水平的检测发现KIF26B在转移性胃癌组织中的表达明显高于未转移性胃癌组织。因此，我们进一步研究了编码基因KIF26B在胃癌中发挥的生物学作用，取得如下研究结果:
　　(1)利用Real-time PCR在新鲜组织中验证得到KIF26B在转移组的表达量显著高于未转移组。在课题组已有的7种胃癌细胞系(MKN28、MKN823、MKN45、SGC7901、MGC803、KATOⅢ、AGS)和1种永生化人胃粘膜上皮细胞(GES-1)检测KIF26B表达水平，发现其在低分化具有转移潜能的SGC7901细胞株中表达量最高，在永生化人胃粘膜上皮细胞GES-1中表达量最低。大样本的免疫组化实验显示，KIF26B的表达水平在非肿瘤胃粘膜组织、未转移性胃癌组织、转移性胃癌组织及淋巴结转移灶中出现逐级升高的趋势。临床病理参数分析，KIF26B高表达与肿瘤直径、淋巴结转移、远处转移密切相关，并且KIF26B高表达组患者的预后较差。
　　(2)MTS、EdU实验则显示KIF26B过表达能够促进胃癌细胞SGC7901、BGC823的增殖能力。凋亡实验表明，KIF26B对胃癌细胞的凋亡不存在调控作用。
　　采用慢病毒系统构建KIF26B knockdown的胃癌BGC823细胞系。小动物活体荧光示踪技术揭示，KIF26B在裸鼠体内促进皮下移植瘤的生长。体外细胞实验和体内动物实验一致性显示，KIF26B促进胃癌细胞的增殖。
　　(3)Transwell小室以及基质胶侵袭实验显示，KIF26B过表达能够促进胃癌细胞SGC7901、BGC823的迁移能力和侵袭转移能力;反之，降低KIF26B表达水平则抑制胃癌细胞的迁移、侵袭能力。
　　在皮下成瘤实验中，对照组出现了瘤体向肌肉浸润的趋势。并且，抑制胃癌细胞KIF26B的表达水平能够降低癌细胞在裸鼠体内的转移能力。KIF26B knockdown组较对照组的肺部转移克隆灶数目明显降低，并且对照组发生了淋巴结转移和肾脏转移。
　　(4)通过Targetscan等软件预测并结合已发表文献，我们推测miR-29a，miR-93，miR-106a，miR-106b，miR-372可能调控KIF26B的表达。双荧光素酶实验、Real-time PCR、Westen blot等实验证明miR-372可以靶向KIF26B mRNA的3'UTR区域，降低KIF26B的表达。
　　(5)敲减KIF26B在胃癌细胞SGC7901的表达并进行基因芯片分析，与对照组相比，降低KIF26B的表达可出现1076条mRNA表达上调，882条mRNA表达下调。对芯片结果进行Pathway富集分析显示，激活的肿瘤相关基因PIK3CA、BCL2、PXN、FAK、CREB1、Src、VEGFA富集在VEGF信号通路。Real-time PCR及Westen blot实验进一步验证基因芯片的可靠性。在荷瘤裸鼠的皮下移植瘤中，KIF26B与VEGFA、PXN、FAK、PIK3CA、BCL2、CREB1的表达呈现正相关的关系，在胃癌患者组织样本中KIF26B与VEGFA同样呈现一致性。
　　综上所述，长链非编码RNA lnc-LEMGC及编码基因KIF26B在胃癌的发生、发展过程中通过不同的调节机制发挥重要的作用。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

第一部分 长链非编码RNA lnc-LEMGC促进胃癌细胞增殖，抑制浸润转移的作用

材料与方法

结果

讨论

结论

第二部分 KIF26B激活VEGF信号通路促进胃癌增殖、转移

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

致谢

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