用于体外诱导脂肪来源间充质干细胞分化为肝细胞的培养基

摘要

本发明涉及用于体外诱导脂肪来源间充质干细胞分化为肝细胞的培养基，属于干细胞分化技术领域。在本发明中，所述培养基包括消化酶溶液、脂肪来源间充质干细胞培养基、同步化培养基、诱导分化培养基和成熟培养基。本发明还提供了体外诱导脂肪来源间充质干细胞分化为肝细胞的试剂盒，以及所述培养基和试剂盒在体外诱导脂肪来源间充质干细胞分化为肝细胞中的应用。本发明提供的培养基能够实现脂肪来源间充质干细胞的大规模生产，且实现体外诱导脂肪来源间充质干细胞高效分化为肝细胞，操作简便、成本低。

说明书

技术领域

本发明涉及干细胞分化技术领域，尤其涉及用于体外诱导脂肪来源间充质干细胞分化为肝细胞的培养基。

背景技术

随着近年来组织工程研究的进展，干细胞移植治疗晚期肝病已经成为最具前景的发展方向。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是干细胞家族的重要成员，因具有多向分化潜能、造血支持、免疫调控和自我复制等特点，日益受到人们的关注。间充质干细胞具有多向分化潜能，可分化为多种组织细胞，进而发挥替代、修复组织的作用。利用MSCs诱导分化为肝细胞进而移植修复肝脏，已成为极具前景的治疗肝病的新方法。

目前诱导MSCs向肝细胞分化技术含有：改变干细胞生长的环境，如联合使用细胞因子、小分子化合物、细胞基质等，但如何恰当搭配各种因素促进诱导分化效率仍是一个问题；利用基因转移技术改造细胞，但存在致瘤性等安全性问题；蛋白转导技术，采用病毒载体介导蛋白基因转入细胞，但存在转染效率不高的问题。常用的细胞因子组合培养体系包括了成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)和表皮生长因子(Epidermal Growth Factor，EGF)，使用的细胞因子多，成本较高。

发明内容

本发明的目的在于提供用于体外诱导脂肪来源间充质干细胞分化为肝细胞的培养基。本发明的培养基能够很好地应用于体外诱导脂肪来源间充质干细胞分化为肝细胞的试剂盒的制备和体外诱导脂肪来源间充质干细胞分化为肝细胞的过程中。本发明的培养基能够实现脂肪来源间充质干细胞的大规模生产，且实现体外诱导脂肪来源间充质干细胞高效分化为肝细胞，操作简便、成本低。

本发明提供了用于体外诱导脂肪来源间充质干细胞分化为肝细胞的培养基，包括消化酶溶液、脂肪来源间充质干细胞培养基、同步化培养基、诱导分化培养基和成熟培养基；

所述消化酶溶液包含0.1～0.2％质量浓度的I型胶原酶、0.1～0.2％质量浓度的透明质酸酶、1～3U/ml硫酸软骨素酶和余量的水；

所述脂肪来源间充质干细胞培养基为含有10～20％体积分数胎牛血清的DMEM培养基；

所述同步化培养基为无血清的IMDM培养基；

所述诱导分化培养基包含10～15ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、2～5％体积分数的胎牛血清、20～40ng/ml肝细胞生长因子和1～5μM维甲酸的IMDM培养基；

所述成熟培养基为包含2～5％体积分数的胎牛血清、10～30ng/ml抑瘤素M、1～2μM地塞米松和1～5％体积分数的胰岛素-转铁蛋白-硒的IMDM培养基。

优选的是，所述消化酶溶液包含等体积的0.1～0.2％质量浓度的I型胶原酶、0.1～0.2％质量浓度的透明质酸酶和1～3U/ml硫酸软骨素酶。

优选的是，所述碱性成纤维细胞生长因子为FGF4。

优选的是，所述胰岛素-转铁蛋白-硒为包括8～12μg/ml胰岛素、4.5～6.5μg/ml转铁蛋白和6～7.5ng/ml亚硒酸钠的水溶液。

本发明还提供了一种用于体外诱导脂肪来源间充质干细胞分化为肝细胞的试剂盒，包含权利要求1～4任意一项所述的培养基，所述培养基以液态进行分装，所述培养基在2～8℃进行保存。

本发明还提供了权利要求1～4任意一项所述培养基或权利要求4所述试剂盒在体外诱导脂肪来源间充质干细胞分化为肝细胞中的应用。

本发明还提供了一种体外诱导脂肪来源间充质干细胞分化为肝细胞的方法，包括以下步骤：

采用消化酶溶液对脂肪组织进行消化，将所述消化后的细胞加入到脂肪来源间充质干细胞培养基中进行原代培养，得到原代培养脂肪来源间充质干细胞；

将所述原代培养脂肪来源间充质干细胞置于脂肪来源间充质干细胞培养基中进行传代扩增培养，得到第3～5代脂肪来源间充质干细胞；

将所述第3～5代脂肪来源间充质干细胞置于同步化培养基中进行同步化培养，得到周期同步化的细胞；

将所述周期同步化的细胞置于诱导分化培养基中进行诱导分化培养，得到分化后的细胞；

将所述分化后的细胞置于成熟培养基中进行成熟培养，得到成熟的肝细胞。

优选的是，由所述脂肪组织培养至所述第3～5代脂肪来源间充质干细胞的过程具体为：

采用磷酸盐缓冲溶液清洗脂肪组织；

将所述清洗后的脂肪组织与消化酶溶液按1:2体积比混合进行消化，所述消化的时间为25～40min，每8～12min进行摇晃；

将所述消化后的脂肪组织过200～400目筛网，1000～1500rpm离心5～10min，去除上层液体，得到细胞沉淀；

将所述细胞沉淀用含10％体积分数胎牛血清的DMEM培养基重悬后接种于培养皿中进行原代培养，得到原代培养脂肪来源间充质干细胞；

将所述原代培养脂肪来源间充质干细胞，加入0.2～0.4％质量体积分数的胰酶进行消化，传代扩增培养；

当传代扩增培养的细胞单层汇合80％时，继续传代培养，得到第3～5代脂肪来源间充质干细胞。

优选的是，将所述第3～5代脂肪来源间充质干细胞培养为成熟肝细胞的具体过程包括以下步骤：

将所述第3～5代脂肪来源间充质干细胞置于同步化培养基中，继续同步化培养2～4天，得到周期同步化的细胞；

将所述周期同步化的细胞加入到诱导分化培养基中进行诱导分化培养，培养6～8天得到分化后的细胞；

将所述分化后的细胞加入到成熟培养基中，成熟培养14～21天，得到成熟的肝细胞。

本发明提供的培养基包括消化酶溶液、脂肪来源间充质干细胞培养基、同步化培养基、诱导分化培养基和成熟培养基。本发明提供的培养基能够应用于体外诱导脂肪来源间充质干细胞分化为肝细胞的过程中。获得的脂肪来源间充质干细胞数量多，细胞量为常规方法的2倍以上，且细胞活力达到98％以上；本发明提供的培养基诱导效率高，操作简单，诱导过程无需进行基因转染或病毒介导方法，仅需添加细胞因子和分子化合物等；成本低，仅需使用成纤维细胞生长因子和肝细胞生长因子两种细胞因子。实现了在体外诱导脂肪来源间充质干细胞分化为肝细胞中的高效应用。

附图说明

图1是实施例3提供的脂肪来源间充质干细胞培养过程中的细胞形态观察示意图；

图2是实施例3提供的第3代脂肪来源间充质干细胞流式细胞仪检测结果图；

图3是实施例3提供的第3代脂肪来源间充质干细胞诱导分化为成熟肝细胞过程中形态观测结果图；

图4是实施例3提供的第3代脂肪来源间充质干细胞与成熟肝细胞的细胞表面ALB的表达情况图；

图5是实施例3提供的第3代脂肪来源间充质干细胞与成熟肝细胞的过碘酸雪夫染色结果图。

具体实施方式

本发明提供了用于体外诱导脂肪来源间充质干细胞分化为肝细胞的培养基，包括消化酶溶液、脂肪来源间充质干细胞培养基、同步化培养基、诱导分化培养基和成熟培养基；

所述消化培养基包含0.1～0.2％质量浓度的I型胶原酶、0.1～0.2％质量浓度的透明质酸酶、1～3U/ml硫酸软骨素酶和余量的水；

所述脂肪来源间充质干细胞培养基为含有10～20％体积分数胎牛血清的DMEM培养基；

所述同步化培养基为无血清的IMDM培养基；

所述诱导分化培养基包含10～15ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、2～5％体积分数的胎牛血清、20～40ng/ml肝细胞生长因子和1～5μM维甲酸的IMDM培养基；

所述成熟培养基为包含2～5％体积分数的胎牛血清、10～30ng/ml抑瘤素M、1～2μM地塞米松和1～5％体积分数的胰岛素-转铁蛋白-硒的IMDM培养基。

在本发明中，所述消化酶溶液包括0.1～0.2％质量浓度的I型胶原酶，优选为0.15％；

所述消化酶溶液包括0.1～0.2％质量浓度的透明质酸酶，优选为0.15％；

所述消化酶溶液包括1～3U/ml硫酸软骨素酶，优选为2U/ml；

所述消化酶溶液包括余量的水。

在本发明中，所述消化酶溶液包含等体积的0.1～0.2％质量浓度的I型胶原酶、0.1～0.2％质量浓度的透明质酸酶和1～3U/ml硫酸软骨素酶。

在本发明中，所述脂肪来源间充质干细胞培养基为含10～20％体积分数胎牛血清的DMEM培养基，更优选为含10％体积分数胎牛血清的DMEM培养基；

本发明对胎牛血清没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的胎牛血清的市售产品即可。

本发明对DMEM培养基的种类和来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的DMEM培养基市售产品即可。

在本发明中，所述同步化培养基为无血清的IMDM培养基，本发明所述对IMDM培养基的种类和来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的DMEM培养基市售产品即可。

在本发明中，所述诱导分化培养基为包括碱性成纤维细胞生长因子、胎牛血清、肝细胞生长因子和维甲酸的IMDM培养基，在所述诱导分化培养基中，包含10～15ng/ml碱性成纤维细胞生长因子，优选为12ng/ml；本发明中，所述碱性成纤维细胞生长因子为FGF4。

所述诱导分化培养基包含2～5％体积分数的胎牛血清，优选为3％；

所述诱导分化培养基包含20～40ng/ml肝细胞生长因子，优选为30ng/ml；

所述诱导分化培养基包含1～5μM维甲酸，优选包含3μM；

所述诱导分化培养基为包含上述各组分的IMDM培养基。

在本发明中，所述成熟培养基为包括胎牛血清、抑瘤素M、地塞米松和胰岛素-转铁蛋白-硒的IMDM培养基。所述成熟培养基包含2～5％体积分数的胎牛血清，更优选为3％；

所述成熟培养基包含10～30ng/ml抑瘤素M，优选15～25ng/ml，更优选为18～22ng/ml；

所述成熟培养基包含1～5μM的地塞米松，优选为1μM；

所述成熟培养基包含1～5％体积分数的胰岛素-转铁蛋白-硒，优选为2％；

所述成熟培养基为包含上述各组分的IMDM培养基。

在本发明中，所述胰岛素-转铁蛋白-硒包括胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠和水，具体的，在本发明中，所述胰岛素-转铁蛋白-硒优选制备成水溶液的形式。在本发明中，所述胰岛素-转铁蛋白-硒包括8～12μg/ml的胰岛素，优选为10μg/ml；

所述胰岛素铁硒传递蛋白包括4.5～6.5μg/ml的转铁蛋白，优选为5.5μg/ml；

所述胰岛素铁硒传递蛋白包括6～7.5ng/ml的亚硒酸钠，优选为6.7ng/ml。

本发明还提供了一种用于体外诱导脂肪来源间充质干细胞分化为肝细胞的试剂盒，包含上述技术方案所述的培养基，所述培养基以液态进行分装，所述培养基在2～8℃进行保存。

本发明还提供了上述技术方案所述培养基或上述技术方案所述试剂盒在体外诱导脂肪来源间充质干细胞分化为肝细胞中的应用，具体提供了一种体外诱导脂肪来源间充质干细胞分化为肝细胞的方法，包括以下步骤：

采用消化酶溶液对脂肪组织进行消化，将所述消化后的细胞加入到脂肪来源间充质干细胞培养基中进行原代培养，得到原代培养脂肪来源间充质干细胞；

将所述原代培养脂肪来源间充质干细胞置于脂肪来源间充质干细胞培养基中进行传代扩增培养，得到第3～5代脂肪来源间充质干细胞；

将所述第3～5代脂肪来源间充质干细胞置于同步化培养基中进行同步化培养，得到周期同步化的细胞；

将所述周期同步化的细胞置于诱导分化培养基中进行诱导分化培养，得到分化后的细胞；

将所述分化后的细胞置于成熟培养基中进行成熟培养，得到成熟的肝细胞。

在本发明中，所述脂肪组织消化的时间优选为25～40min，更优选为30min；所述消化的温度优选为37℃。本发明优选在所述消化的过程中，每隔8～12min对培养体系进行晃动，更优选间隔10min。

完成所述消化后，本发明将所述消化后的细胞加入到脂肪来源间充质干细胞培养基中进行原代培养，得到原代培养脂肪来源间充质干细胞。本发明在进行所述原代培养前，优选将所述消化后的脂肪来源间充质干细胞过筛和离心，得到细胞沉淀。在本发明中，所述过筛的筛网孔径优选为200～400目，更优选为200目；所述离心的转速优选为1000～1500rpm，更优选为1000rpm；所述离心的时间优选为5～10min。

在本发明中，所述原代培养过程中，优选培养24～36h进行全量换液，更优选为24h，随后每2～3天进行半量换液，培养时间共5～15天，得到原代培养脂肪来源间充质干细胞。

完成所述原代培养后，本发明将得到的原代培养脂肪来源间充质干细胞再次接种到脂肪来源间充质干细胞培养基中进行传代扩增培养，得到第3～5代脂肪来源间充质干细胞。本发明在进行所述传代扩增培养前，优选将得到的原代培养脂肪来源间充质干细胞采用胰酶消化。在本发明中，所述胰酶浓度优选为0.2～0.4％，更优选为0.25％，所述胰酶的消化温度优选为37℃。

所述原代培养脂肪来源间充质干细胞生长融合达到90％，经MTT法检测细胞活力达98％以上。

所述传代细胞生长达到单层汇合80％时，进行传代培养，所述传代培养时间为3～10天，得到第3～5代脂肪来源间充质干细胞。

本发明中，将所述第3～5代脂肪来源间充质干细胞培养为成熟肝细胞的具体过程包括以下步骤：

将所述第3～5代脂肪来源间充质干细胞置于同步化培养基中，继续同步化培养2～4天，更优选为3天，得到周期同步化的细胞，促进诱导分化的效率；

将所述周期同步化的细胞加入到诱导分化培养基中进行诱导分化培养，培养6～8天，更优选为7天，得到分化后的细胞；

将所述分化后的细胞加入到成熟培养基中，成熟培养14～21天，，更优选为16天，得到成熟的肝细胞。

下面结合实施例，对本发明提供的用于体外诱导脂肪来源间充质干细胞分化为肝细胞的培养基进行详细的描述，但是不能将它们理解为对本申请保护范围的限定。

实施例1

用于体外诱导脂肪来源间充质干细胞分化为肝细胞的培养基分别为：

消化酶溶液：等体积0.15％I型胶原酶、0.15％透明质酸酶、2U/ml硫酸软骨素酶；

脂肪来源间充质干细胞培养基：含10％体积分数胎牛血清的DMEM培养基；

同步化培养基：无血清的IMDM培养基；

诱导分化培养基：15ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、3％体积分数的胎牛血清、35ng/ml肝细胞生长因子和2.5μM维甲酸的IMDM培养基；

成熟培养基：3％体积分数的胎牛血清、15ng/ml抑瘤素M、2μM地塞米松和2％体积分数的胰岛素-转铁蛋白-硒的IMDM培养基。

脂肪来源间充质干细胞的培养

无菌条件下取脂肪组织，用3倍体积的磷酸盐缓冲溶液洗涤3遍，添加消化酶溶液，放入CO₂培养箱中37℃下消化培养25min，每隔8min轻轻摇晃培养皿以保证充分消化，200目筛网过滤，1000r/m离心8min，去上层液体，得到细胞沉淀；细胞沉淀用脂肪来源间充质干细胞培养基重悬并接种于培养皿中，24h后全量换液，之后每2天半量换液，原代培养5d至生长融合达到90％，细胞活力达98％，得到原代培养脂肪来源间充质干细胞。用0.25％的胰酶对原代培养脂肪来源间充质干细胞进行消化，进行传代扩增培养，当传代细胞生长接近单层汇合80％时，继续传代，得到第3代脂肪来源间充质干细胞。

将不同培养阶段得到的细胞置于倒置显微镜下进行观察，原代接种24h后的呈圆形或短梭形，大小不一；2天后细胞逐渐伸展呈长梭形，第6天开始呈漩涡状生长，第10天可达到80％融合，0.25％胰酶消化并传代后5天细胞达80％融合，细胞为长梭形，大小均一。

流式细胞仪检测，第3代脂肪来源间充质干细胞的免疫表型CD90、CD73、CD105均呈阳性表达(>98％)，而造血细胞系分子标记物CD45呈阴性表达(0.06％)。

将第3代脂肪来源间充质干细胞培养为成熟肝细胞

将所述第3代脂肪来源间充质干细胞置于同步化培养基中，继续同步化培养3天，得到周期同步化的细胞；

将上述周期同步化的细胞加入到诱导分化培养基中进行诱导分化培养，培养6天得到分化后的细胞；

将所述分化后的细胞加入到成熟培养基中，成熟培养16天，得到成熟的肝细胞。

实施例2

用于体外诱导脂肪来源间充质干细胞分化为肝细胞的培养基分别为：

消化酶溶液：等体积0.2％I型胶原酶、0.2％透明质酸酶、3U/ml硫酸软骨素酶；

脂肪来源间充质干细胞培养基：含15％体积分数胎牛血清的DMEM培养基；

同步化培养基：无血清的IMDM培养基；

诱导分化培养基：14ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、2％体积分数的胎牛血清、30ng/ml肝细胞生长因子和2.5μM维甲酸的IMDM培养基；

成熟培养基：3％体积分数的胎牛血清、28ng/ml抑瘤素M、1.5μM地塞米松和3％体积分数的胰岛素-转铁蛋白-硒的IMDM培养基。

脂肪来源间充质干细胞的培养

无菌条件下取脂肪组织，用2.5倍体积的磷酸盐缓冲溶液洗涤4遍，添加消化酶溶液，放入CO₂培养箱中37℃下消化培养35min，每隔8min轻轻摇晃培养皿以保证充分消化，400目筛网过滤，1500rpm离心8min，去上层液体，得到细胞沉淀；细胞沉淀用脂肪来源间充质干细胞培养基重悬并接种于培养皿中，36h后全量换液，之后每1天半量换液，原代培养6d至生长融合达到90％，细胞活力达98％，得到原代培养脂肪来源间充质干细胞。用0.3％的胰酶对原代培养脂肪来源间充质干细胞进行消化，进行传代扩增培养，当传代细胞生长接近单层汇合80％时，继续传代，得到第5代脂肪来源间充质干细胞。

将不同培养阶段得到的细胞置于倒置显微镜下进行观察，原代接种24h后的呈圆形或短梭形，大小不一；4天后细胞逐渐伸展呈长梭形，第8天开始呈漩涡状生长，第13天可达到80％融合，0.25％胰酶消化并传代后4天细胞达80％融合，细胞为长梭形，大小均一。

流式细胞仪检测，第3代脂肪来源间充质干细胞的免疫表型CD90、CD73、CD105均呈阳性表达(>98％)，而造血细胞系分子标记物CD45呈阴性表达(0.06％)。

将第5代脂肪来源间充质干细胞培养为成熟肝细胞

将所述第5代脂肪来源间充质干细胞置于同步化培养基中，继续同步化培养4天，得到周期同步化的细胞；

将上述周期同步化的细胞加入到诱导分化培养基中进行诱导分化培养，培养6天得到分化后的细胞；

将所述分化后的细胞加入到成熟培养基中，成熟培养21天，得到成熟的肝细胞。

实施例3

用于体外诱导脂肪来源间充质干细胞分化为肝细胞的培养基分别为：

消化酶溶液：等体积0.1％I型胶原酶、0.1％透明质酸酶、1U/ml硫酸软骨素酶；

脂肪来源间充质干细胞培养基：含20％体积分数胎牛血清的DMEM培养基；

同步化培养基：无血清的IMDM培养基；

诱导分化培养基：12ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、4％体积分数胎牛血清、25ng/ml肝细胞生长因子和1μM维甲酸的IMDM培养基；

成熟培养基：2％体积分数的胎牛血清、15ng/ml抑瘤素M、1μM地塞米松和1％体积分数的胰岛素-转铁蛋白-硒的IMDM培养基。

脂肪来源间充质干细胞的培养

无菌条件下取脂肪组织，用2倍体积的磷酸盐缓冲溶液洗涤3遍，添加消化酶溶液，放入CO₂培养箱中37℃下消化培养30min，每隔10min轻轻摇晃培养皿以保证充分消化，200目筛网过滤，1000r/m离心10min，去上层液体，得到细胞沉淀；细胞沉淀用脂肪来源间充质干细胞培养基重悬并接种于培养皿中，24h后全量换液，之后每2天半量换液，原代培养3～5d至生长融合达到90％，细胞活力达98％，得到原代培养脂肪来源间充质干细胞。用0.25％的胰酶对原代培养脂肪来源间充质干细胞进行消化，进行传代扩增培养，当传代细胞生长接近单层汇合80％时，继续传代，得到第3代脂肪来源间充质干细胞。

将不同培养阶段得到的细胞置于倒置显微镜下进行观察，原代接种24h后的呈圆形或短梭形，大小不一；3天后细胞逐渐伸展呈长梭形，第7天开始呈漩涡状生长，第12天可达到80％融合，0.25％胰酶消化并1:3传代后3天细胞达80％融合，细胞为长梭形，大小均一，观察结果如图1所示，其中图1-1为原代培养7天后的细胞(100×)，图1-2为第一次传代培养3天后的细胞(100×)。

流式细胞仪检测，第3代脂肪来源间充质干细胞的免疫表型CD90、CD73、CD105均呈阳性表达(>98％)，而造血细胞系分子标记物CD45呈阴性表达(0.06％)，第3代脂肪来源间充质干细胞流式细胞仪检测结果见图2。

将第3代脂肪来源间充质干细胞培养为成熟肝细胞

将所述第3代脂肪来源间充质干细胞置于同步化培养基中，继续同步化培养2天，得到周期同步化的细胞；

将上述周期同步化的细胞加入到诱导分化培养基中进行诱导分化培养，培养7天得到分化后的细胞；

将所述分化后的细胞加入到成熟培养基中，成熟培养14天，得到成熟的肝细胞。

对上述培养得到的肝细胞表型和功能进行鉴定

①形态表型

通过倒置显微镜，第3代脂肪来源间充质干细胞呈现纤维样细胞形态如图3-1所示(标尺：100μm)，在诱导分化为成熟肝细胞的过程中，细胞形态逐渐变为多边形，成熟培养第21天的观察结果如图3-2所示(标尺：50μm)，细胞多为多边形、类圆形等上皮细胞样形态，细胞大小不等，折光性强，核大而圆，可见少数细胞为双核。

②白蛋白(albumin，ALB)分化率

通过流式细胞术分别检测诱导分化前后细胞表面ALB的表达情况，结果显示：经诱导后，90％以上的细胞表达ALB，说明第3代脂肪来源间充质干细胞成功诱导分化得到了肝细胞。诱导分化前后细胞表面ALB的表达情况如图4所示，图4-1为第3代脂肪来源间充质干细胞表面ALB的表达情况，图4-2为成熟肝细胞表面ALB的表达情况。

③过碘酸雪夫(Periodic Acid-Schiff，PAS)染色

诱导分化后PAS染色阳性，细胞质可见紫色糖原颗粒。染色结果如图5所示((标尺均为50μm))，图5-1为第3代脂肪来源间充质干细胞PAS染色结果，图5-2为成熟肝细胞PAS染色结果。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。