施氏假单胞菌、其代谢产物及其在防治黄曲霉菌及毒素中的应用

摘要

本发明公开了一种施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）YM6，其保藏号为CCTCC M 2016386。其代谢产物包括二甲基三硫。同时本申请还公开了该施氏假单胞菌及代谢产物抑制储藏期黄曲霉菌及毒素的应用。本发明的施氏假单胞菌及代谢产物对不同水活度的密闭环境下，均能有效抑制花生、玉米等的黄曲霉病害发生与黄曲霉毒素污染。

说明书

技术领域

本发明属于植物病害生物防治技术领域，具体涉及一株施氏假单胞菌、其代谢产物及其应用。

背景技术

黄曲霉菌 (Aspergillus>) 是产生黄曲霉毒素 (Aflatoxins, AFT) 最主要的植物病原真菌，它可侵染花生、玉米、高粱、大豆和棉籽等多种重要的粮食和油料作物，也是我国这些粮油作物及其产品在储藏过程中污染最重的产毒真菌。黄曲霉菌产生的AFT是目前已知霉菌毒素中毒性最高、致癌力最强的物质。AFT 的常见类型中又以黄曲霉毒素 B1 (AFB1) 毒性最高，达氰化钾的 10 倍、砒霜的 68倍，误食后易诱发肝癌、肾癌和直肠癌等，严重时可致急性死亡。

黄曲霉菌和AFT的危害在世界范围内普遍存在，全球每年受其危害的人口高达50 亿 (Williams et al 2004)。19 世纪 60 年代，美国发生的十万只火鸡中毒死亡事件“火鸡X病”，直接原因是由于食用了 AFT 污染的谷物所致。近年来，美国佐治亚州每年因 AFT 污染导致的花生损失达 2500 万美元。AFT 在乙型肝炎病毒流行国家（如中国，印度，非洲等）危害更为严重，易引发细胞性肝癌病变。中国每年约有37万人死于肝癌，占全世界肝癌死亡人数的 50％ 以上。给人们健康和日常生活带来严重的危害。

目前黄曲霉及毒素的防治有常规育种、化学防治与生物防治三种手段。通过育种手段可以将数量性状抗病基因整合到感病品种，选育新型的抗病新品种。但黄曲霉抗病材料匮乏，抗性基因的筛选与整合以及育种周期较长，使得常规育种进展缓慢。化学防治易引起药害和病原菌的抗药性，甚至污染环境。另外粮食作物上直接喷洒化学农药容易导致残留，影响人体健康，使用过程中饱受诟病。微生物源生物制剂作为新型无危害的防治策略，被逐渐开发和应用于黄曲霉和毒素的田间和储藏期防治中。近年来利用微生物产生的挥发性气体防治储藏期病害发展迅速，微生物源的挥发性气体因为其使用简单，散布均匀快速，接触广泛等优点被高效应用于储藏期病害的生物防治。到目前为止，对黄曲霉及毒素的储藏期防治研究较少，为筛选高效的储藏期生防菌株，我们从自然界中筛选抑菌微生物资源，研究其产气特性和抑菌作用，并开展储藏期黄曲霉毒素防治的研究。

发明内容

本发明目的在于提供一株施氏假单胞菌 (Pseudomonas>) YM6，其代谢产物及其应用。YM6可高效抑制黄曲霉菌侵染和毒素的产生，利用YM6在牛肉膏蛋白胨培养基上产生的有抑菌作用的挥发性气体，可有效抑制花生和玉米黄曲霉病菌的侵染与毒素的产生。

基于上述目的，本发明采取了如下技术方案：

施氏假单胞菌（Pseudomonas>）YM6，其保藏号为CCTCC NO：M 2016386。

该施氏假单胞菌的16S rDNA具有序列表SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

所述的施氏假单胞菌在防治储藏期作物籽粒产生黄曲霉菌和毒素中的应用。

所述作物籽粒为花生或玉米。

所述的施氏假单胞菌的代谢产物，所述代谢产物包括二甲基三硫（丰度最高物质）。

施氏假单胞菌的代谢产物在抑制黄曲霉菌及毒素方面的应用。

二甲基三硫抑菌的最低浓度为200 μg/L。

本发明从中国山东省烟台市海域采集海洋漂浮物，通过微生物学方法从中分离得到一株对黄曲霉有高效抑制作用的施氏假单胞菌株。将其命名为施氏假单胞菌YM6，Pseudomonas>YM6，将该菌株于2016年07月11日送交位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，保藏号为CCTCC NO：M 2016386。

施氏假单胞菌 (Pseudomonas>) YM6的菌学特征：

施氏假单胞菌YM6为革兰氏阴性菌，可以利用D-葡萄糖、D-果糖、蔗糖、L-阿拉伯糖、D-甘露糖等，可利用柠檬酸，不能利用纤维素，不能水解淀粉，不产硫化氢，不产芽孢，好氧微生物、菌体杆状，大小为(0.5~1)μm × (2.0~4.0) μm (宽×长)，最适生长温度为37℃。

对菌株YM6的16S rDNA序列进行了测序分析，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。

本发明检测了该菌株YM6对黄曲霉菌菌丝和孢子的高效抑制作用，鉴定了YM6产生的挥发性抑菌代谢产物，在密闭储藏条件下，分析YM6对花生、玉米黄曲霉的抑制作用及毒素残留量分析等相关研究。

本发明的施氏假单胞菌YM6具有很好的抑菌作用，在密闭储藏环境条件下可抑制花生、玉米等黄曲霉的发病和产毒。该菌株可应用于防治玉米等饲料储藏期的霉菌污染，同时可延伸应用于大棚蔬菜的抑菌防病种植。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

（1）本发明分离的施氏假单胞菌YM6为海洋细菌，从海洋漂浮物中分离得到的一种高效新型抑菌微生物，可作为作物储藏期真菌病害的生防菌株应用；

（2）本发明首次证明分离的施氏假单胞菌YM6可产挥发性抑菌物质，且在密闭环境下可完全抑制黄曲霉菌菌丝的生长与孢子的萌发；

（3）本发明分离到的施氏假单胞菌YM6抑菌效果显著，在密闭空间内可高效抑制花生和玉米籽粒上的黄曲霉发病与毒素的合成；

（4）本发明得到的施氏假单胞菌YM6可产生高活性的挥发性抑菌物质，通过气相色谱质谱联用仪检测到8种物质，其中组分二甲基三硫的相对含量最高，为11.24%；

（5）本发明得到的施氏假单胞菌YM6产生的二甲基三硫抑菌效果显著，在200 μg/L（物质重量/空间体积）的浓度下可完全抑制黄曲霉菌的生长，抑菌效果显著。

附图说明：

YM6保藏日期： 2016年07月11日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号CCTCC NO：M2016386。

序列表SEQ ID NO：1是本发明分离的施氏假单胞菌YM6的16S rDNA的序列；

图1是施氏假单胞菌YM6菌体的扫描电镜图片；

图2是施氏假单胞菌YM6菌株与其近缘种菌株16s rDNA序列的系统发育树分析；

图3是施氏假单胞菌YM6对黄曲霉菌的菌丝生长与孢子萌发的抑制作用图片；

图4是施氏假单胞菌YM6与黄曲霉孢子共培养12 h和24 h后的萌发形态图片；

图5是施氏假单胞菌YM6对不同水活度玉米籽粒黄曲霉菌的控制图片.图5中，标有A、B、C图为对照组，分隔培养皿一侧分别为接种黄曲霉孢子的玉米籽粒（三种水活度），另一侧为加入牛肉膏蛋白胨培养基（NA）（牛肉膏3.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，琼脂15.0 g/L，补充蒸馏水至1L；调pH至 7.2）的对照处理；标有a、b、c图是YM6菌株处理组，及分隔培养皿一侧为接种黄曲霉孢子的玉米籽粒（三种水活度），隔层另一侧内加入NA培养基，表面涂布YM6菌液，两组为28℃密闭培养7天后的发病状况；

图6是施氏假单胞菌YM6对不同水活度花生籽粒黄曲霉菌的控制图片；图6中，标有A、B、C图为对照组，分隔培养皿一侧分别为接种黄曲霉孢子的花生籽粒（三种水活度），另一侧为加入NA培养基的对照处理；标有a、b、c图是YM6菌株处理组，及分隔培养皿一侧为接种黄曲霉孢子的花生籽粒（三种水活度），隔层另一侧内加入NA培养基，表面涂布YM6菌液，两组为28℃密闭培养7天后的发病状况；

图7是水活度为0.859下培养7天花生籽粒的扫描电镜观察；图7中，“CK”是花生接种黄曲霉孢子培养7天后的电镜照片，“CK+YM6”是花生接种黄曲霉孢子与YM6共培养7天后花生表面的电镜照片；

图8是施氏假单胞菌YM6产气体物质的气相色谱质谱联用检测结果；

图9是购买二甲基三硫（Sigma）标准品在不同浓度下的抑菌作用结果；图9中，浓度为重量体积比，即二甲基三硫物质的重量/密闭培养空间的体积。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。

实施例1 候选菌株YM6的分离和菌学鉴定

（1）候选菌株YM6的分离

本发明从中国山东省烟台市渤海海域采集海洋漂浮物，并通过微生物学筛选方法从中分离得到一株对黄曲霉有高效抑菌作用的施氏假单胞菌株，将该候选菌株编号为YM6。

微生物的分离采用NA纯化培养法，将收集到的海洋漂浮物质用剪刀剪成小块，放于NA培养基表面，28℃培养2-3天，挑取形态差异菌株单菌落，纯化培养后分析单菌落抑菌效果，选取抑菌效果较好的菌株进行保存，用于后续研究。

（2）YM6菌株的形态特征鉴定

YM6菌株于NA培养基培养48 h后，可见菌落粘稠，呈淡黄色，表面光滑，边缘整齐，不透明，革兰氏染色为阴性。电子显微镜观察表明，菌体呈短杆状（见图1）。不产芽孢。

（3）YM6的分子生物学鉴定

将YM6菌株于NB培养液（牛肉膏3.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，补充蒸馏水至1L；调pH至 7.2）摇培24 h，12000 rpm离心收集菌体，采用10 mM的tris-HCl（购自Amresco公司产品）和1 mM的EDTA提取基因组DNA，提取后用苯酚-氯仿-异戊醇 (25:24:1) 抽提和TER溶解。利用特异性引物扩增16s rDNA并送深圳华大公司进行测序。测序序列长度为1544 bp，具体序列如SEQ ID NO.：1所示。

测序引物的DNA序列：

16S rDNA（正向引物）：AGAGTTTGATCCTGGCTC

16S rDNA（反向引物）：AAGGAGGTGATCCAGCCGCA

在Genbank数据库中，将YM6菌株的16s rDNA序列进行BLAST检索，发现其与假单胞菌属内不同种的细菌菌株相似度较高，为进一步确定该菌株的遗传特性，选取16s rDNA序列比对结果中同源性较高的菌株，进行系统发育树分析。

根据其16S rDNA基因序列系统发育分析（图2），结合形态和生化特征，经鉴定本发明所分离的菌株为施氏假单胞菌(Pseudomonas>)，申请人将该菌株命名为施氏假单胞菌YM6，Pseudomonas>YM6。但该菌株序列与已发现的施氏假单胞菌近缘种相似度仅为81%，具有高度种属特异性，可判定为一个新的施氏假单胞菌变种。并于2011年07月11日将该菌株送交中国.武汉.武汉大学中国典型微生物保藏中心（CCTCC）保藏，其保藏号为NO：M2016386。

实施例2 施氏假单胞菌YM6对黄曲霉的抑菌作用

施氏假单胞菌YM6抑制黄曲霉菌丝生长的实验

方法：采用培养皿（直径9 cm）对扣方式进行。黄曲霉孢子接种于50 mL PDB培养液（去皮马铃薯200.0 g，沸水煮20 min，纱布过滤收集滤液，添加葡萄糖20.0 g，蒸馏水定容至1L，不调pH）中，28℃和200 rpm条件下摇培3天，挑取白色的黄曲霉菌丝团，接种于含PDA的培养皿中央。菌株YM6（100 μL, 10⁸>

抑菌率的计算公式如下：

菌丝生长抑菌率=（对照菌丝直径-处理菌丝直径）/对照菌丝直径×100%。

施氏假单胞菌YM6对黄曲霉孢子萌发的抑制实验

方法：采用培养皿对扣培养法，100 μL黄曲霉孢子（5Ⅹ10⁵>8>

计算公式如下：

孢子萌发抑制率=（对照孢子萌发率-处理孢子萌发率）/对照孢子萌发率×100%。

实验结果分析

实验结果见图3和图4所示，从图3中可以看出，YM6对菌丝生长抑菌率达100%，分析原因在于，施氏假单胞菌YM6与黄曲霉菌丝在密封培养皿内无接触培养过程中，可以产生挥发性的气体物质，完全抑制黄曲霉菌丝的生长；从图4可以看出，当培养12h后，对照组的孢子已萌发长出菌丝，但YM6处理组的孢子未见萌发，继续培养24h后，对照组萌发的菌丝形成菌丝团，覆盖培养基的表面，YM6处理组孢子未见萌发，YM6对孢子萌发的抑菌率达100%，分析原因在于，施氏假单胞菌YM6在与孢子的共培养过程中，通过产生抑菌气体物质可完全抑制孢子的萌发。

实施例3 施氏假单胞菌YM6对花生、玉米黄曲霉菌和毒素的防治效果实验：

样品制备：

1）分别称取100 g玉米和花生籽粒并保存于250 mL三角瓶中，每个作物称取3个三角瓶，于121℃ 和1.01MPa下灭菌20 min，室温下静置冷却；2）所有三角瓶接种新鲜收集的黄曲霉孢子液1 mL（5Ⅹ10⁵>

处理方法：

抑菌试验分花生和玉米2种作物进行，每个作物三个水活度处理，花生籽粒的3个水活度分别为0.785，0.866和0.934，玉米籽粒的3个水活度至0.740，0.859和0.923。每个水活度处理分对照组（CK）和YM6处理组，每组实验均采用分隔培养皿（9 cm 直径）进行，分隔的一侧加入接种黄曲霉孢子的作物籽粒，一侧加NA培养基（2 cm厚），YM6（50 μL，10⁸>

黄曲霉毒素的提取：称取研磨的样品1g于5 mL的聚丙烯塑料管中。用5 mL 已腈/水（84/16, v/v）抽提。拧紧管盖后蜗旋处理1 min，之后超声处理60 min。6000 rpm 离心10 min，取上清1 mL转移至新的离心管中，加入相同体积的正己烷混合均匀后静置分层。吸取下层有机相500 μL进行毒素定量分析。

黄曲霉毒素的检测：提取的黄曲霉毒素采用高效液相色谱与质谱联用仪（Thermo Scientific，加利福尼亚大学，美国）进行检测。液相色谱分析采用C18色谱柱（50 mm × 2.1 mm, 3.0 μm填充粒径），温度设置为35℃。流动相为A: 甲醇和 B: 水（超纯水含5mM醋酸铵和0.05%甲酸，v/v）。流速为0.3 mL/min，采用梯度进行方式进行洗脱，共计7 min，具体进样程序为，0-1 min，20% A；1-4 min，20%-100% A；4-5 min，100% A；5-5.5 min，100%-20% A。进样体积为5 μL。质谱分析采用电喷雾质谱（ESI+）选择离子监测模式进行，最优雾化器温度为350℃，毛细管温度为350℃，喷雾电压为3.5Kv（ESI+）。碰撞气压力为1.5m Torr，碰撞气体为氩气。黄曲霉毒素B1, B2, G1和G2的检测采用选择离子监测模式，监测离子（定量离子，定性离子）分别为 AFB1 (m/z285.1,>m/z287.1,>m/z243.0,>m/z313.1,>

实验结果与分析：

作物籽粒接种黄曲霉孢子培养7天结果见图5和图6，结果表明，YM6菌株可高效抑制花生和玉米黄曲霉菌的侵染和发病，表明在非接触条件下YM6产生挥发性物质，抑制了分隔培养皿一侧黄曲霉孢子的萌发，抑菌效果显著；与此相比，对照组中无YM6的抑制作用，作物的黄曲霉菌发病明显，产生绿色的孢子霉层，且高水活度发病更重，有利于黄曲霉菌侵染。

培养7天后收集所有样品并研磨后进行黄曲霉毒素检测，检测了AFB1和AFB2毒素的含量，结果如表1所示。

表1. 菌株YM6对黄曲霉菌产AFT的抑制作用

注：* 表明未检出。

由表1可知，在花生的对照组处理中，三种水活度下毒素的总量分别为99.491ng/g，330.165 ng/g和1767.619 ng/g，毒素的含量随水活度的增加而增加。与此相比，YM6处理中三种水活度下黄曲霉毒素明显较低，在aw0.923的高水活度条件下，花生样品的毒素含量为3.740 ng/g，其他两种水活度均为检出毒素。表明YM6产生的气体物质在花生中可高效抑制黄曲霉毒素的产生。在玉米籽粒的处理中，三种水活度下毒素的总产量分别为27.089 ng/g，178.391 ng/g和466.130 ng/g。YM6处理中均未检测到黄曲霉毒素。毒素检测结果与发病率的结果相符，表明在仓储条件下，YM6在不同水活度范围内可高效抑制黄曲霉的侵染和毒素的产生。

实施例4 施氏假单胞菌YM6对黄曲霉抑制作用的显微观察

由于黄曲霉孢子接种于花生籽粒培养7天后，高水活度条件下黄曲霉发病严重，但YM6处理组未见明显的发病症状，为检测黄曲霉的侵染状态，选取水活度0.859条件下的花生籽粒进行扫描电镜观察。对照组与YM6处理组的花生籽粒取出，分别于1%的锇酸中熏蒸固定1 h，取固定后的花生表皮表面喷金，进行扫描电镜观察（型号JSM-6390, 日立公司，日本）。其扫描结果见图7所示。

图7显示，对照组花生表面覆盖大量的黄曲霉菌丝和孢子。YM6处理组花生表面仅见少量孢子，为接种用的原始孢子，且孢子未见萌发，表明YM6产生的气体物质可抑制孢子萌发，进一步抑制了孢子萌发形成菌丝和孢子梗的形成。

实施例5 施氏假单胞菌YM6挥发性气体检测

将菌株YM6接种于100 mL三角瓶中的NA培养基表面，涂布均匀。瓶口用双层塑料薄膜封闭，以不接种YM6的三角瓶作为对照，所有三角瓶置于28℃黑暗条件下培养48h。培养后的三角瓶转移到40℃的水浴锅中平衡30 min，之后依次进行样品的萃取和GC-MS检测，所有检测重复2次。

样品萃取方法：

采用固相微萃取柱（SPME）进行挥发性物质的富集。将SPME的萃取头插入塑料薄膜之内，推出纤维头，使纤维头处于样品瓶上空的中间位置，吸附30 min。将纤维头收回萃取头，并拔出样品瓶后转入气相色谱质谱联用仪（GC-MS）进样检测，检测参数设计如下。

GC条件：

进样口温度为250℃；载气为氦气，柱流速1 mL／min；不分流进样。程序升温条件：起始温度为40℃，保持3 min后，以3℃／min的速度升温至160℃，同样保持2 min，再以8℃／min速率升至220℃，保持3 min。J&WHP一5MS弹性石英毛细管柱 (30 m×0．25 mm ID，0.25 um thickness film)。

MS条件：

离子源温度为230℃，四极杆温度150℃，电离方式：EI源，能量为70 eV，采用全扫描的模式进行检测，检测范围为50-550 amu。检测物质自动进行谱库检索National Institure of Standards and Technology (NIST 08)，对检测的物质进行定性。气相色谱质谱联用检测（GC-MS）结果见图8所示。

GC-MS检测后，YM6培养后检测到的物质，扣除NA培养基对照组中检测到的气体物质，即为YM6产生的挥发性气体组分。由图8可知，试验中YM6共计检出8种物质，8种物质具体列于表2。8种物质中含有芳香族化合物，烷/烯/炔烃化合物，硫化物，噁唑类以及酯类等。所有物质分子量是介于60-97 道尔顿（D）之间的小分子物质，易于挥发。经检测，所有物质中，Nist 08谱库检索相似度高于90%，相对含量（该物质峰面积/所有检出物质峰面积之和）高于10%的物质仅为组分1（二甲基三硫）。以该物质为主要产生代谢物质，分析其抑菌作用，我们购买了该物质的标准品，进行最低抑菌浓度实验。

表2. YM6代谢产物的GC-MS检测

。

实施例6 二甲基三硫对黄曲霉菌的抑制作用分析：

YM6产生的挥发性物质抑菌作用显著，为分析其抑菌作用，购买二甲基三硫的标准品，进行抑菌试验。采用双皿对扣培养法测定购买标准品对黄曲霉菌的抑制效果，具体操作如下：将二甲基三硫纯品用无水乙醇溶解至1000 μg/mL，之后依次稀释至500 μg/mL, 250 μg/mL，空白乙醇试剂为对照。在下层的培养皿中放一片圆形滤纸片 (直径5 cm)，分别在滤纸片上滴加40 μL稀释液（有效物质浓度约为 200 μg/L, 100μg/L, 50μg/L, 0 μg/L），迅速将接种了黄曲霉菌丝块的PDA培养皿扣在放有滤纸片的培养皿上，用封口膜封口后，放在28℃条件下培养5 d后，以相同浓度的无水乙醇为对照，测量黄曲霉菌丝直径并计算抑菌率。

培养5天后检测，检测不同浓度二甲基三硫标准品对黄曲霉菌的抑制作用，具体结果见图9。图9显示，与对照相比，二甲基三硫在200 μg/L（物质质量/空间体积）时可完全抑制菌丝生长，表明二甲基三硫的最低抑菌浓度为200 μg/L，此浓度可作为后续抑菌应用参考。随浓度的降低，抑菌作用逐渐减弱，50 μg/L浓度下，抑菌作用降到最弱，这表明二甲基三硫具有明显抑菌效果，在高浓度抑制作用强，低浓度下抑菌效果较弱。

AGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGC

GGATGAGTGGAGCTTGCTCCATGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCT

GCCTGGTAGTGGGGGACAACGTTTCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGA

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CACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACA

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CACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCATTAACCTAATACGTTAGTGTTTTGACGTTACCGACA

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ATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTTGTTAAGTTGGATGTGAAAGCCC

CGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCAAGCTAGAGTATGGCAGAGGGTGGTG

GAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCG

ACCACCTGGGCTAATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGAT

ACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTAGCCGTTGGGATCCTTGAGATCTTAG

TGGCGCAGCTAACGCATTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCA

AATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCG

AAGAACCTTACCAGGCCTTGACATGCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGG

GAACTCTGACACAGGTGCTGCATGGCTGTTGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAA

GTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTTATGGTGGGCACTCTAA

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