CXCR4RNAi慢病毒载体的构建方法

摘要

本发明提供一种CXCR4RNAi慢病毒载体的构建方法，通过根据GenBank CXCR4的mRNA全序列，经BLAST同源性比对证实特异性后应用RNA structure 4.4软件对靶mRNA序列的二级结构进行评估，得到19nt靶序列；然后针对各靶序列设计合成其相应的两条shRNA寡核苷酸单链；然后环状空质粒酶切后，酶切片段连接PLVX.1载体与shRNA寡核苷酸双链，连接形成的重组载体，连接产物转化新鲜感受态细胞E.coli DH5α，37℃培养16h后挑阳性克隆进行菌落PCR鉴定，测序结果验证重组质粒构建成功后，提取重组质粒。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种CXCR4RNAi慢病毒载体的构建方法。

背景技术

当前在世界范围内肺癌发病率逐年上升，每年大约有超过一百万人死于肺癌，已成为恶性肿瘤最常见死因之一，肺癌约30%患者在病程中出现颅脑转移，脑转移瘤自然生存时间为1～3个月，是恶性肿瘤严重并发症之一，颅脑转移为肺癌死亡的重要原因之一。趋化因子是一类具有生物化学趋化性的细胞因子，其中SDF-1及其特异性受体 CXCR4在肿瘤细胞的迁移与侵袭中发挥了重要的作用。研究显示 SDF-1及其受体CXCR4组成的信号传导通路可能与肺癌的发生、发展及颅脑转移关系密切。在非小细胞肺癌早期诊断和治疗中，侵袭和转移是非小细胞肺癌治疗效果不佳的主要因素。为了更好的研究CXCR4/SDF-1生物学轴在非小细胞肺癌侵袭及转移特别是脑转移中的作用，本研究采用具有脑转移潜能的肺癌细胞PC-9构建细胞模型，通过设计针对CXCR4基因序列的shRNA片段，构建慢病毒shRNA干扰表达载体，从而特异性的靶向沉默肺癌细胞CXCR4基因的表达。慢病毒介导的shRNA干扰的特点是高效、稳定且静默持续时间长，为进一步研究SDF-1/CXCR4生物学轴在非小细胞肺癌颅脑转移中的作用提供了工具。

发明内容

本发明的目的在于提供一种CXCR4RNAi慢病毒载体的构建方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

CXCR4RNAi慢病毒载体，所述载体含有CXCR4基因片段。

CXCR4RNAi慢病毒载体的构建方法，包括如下：

（1）干扰序列设计：根据GenBank CXCR4的mRNA全序列，经BLAST同源性比对证实特异性后应用RNA structure 4.4软件对靶mRNA序列的二级结构进行评估，得到19nt靶序列；然后针对各靶序列设计合成其相应的两条shRNA寡核苷酸单链；同时设计一对对照序列siRNAc；

（2）慢病毒表达载体的构建及鉴定：空载体pGC-LV 带有 GFP标记，将PLVX-shRNA-PUROvector环状空质粒用BamH 和EcoR 限制性内切酶进行双酶切，并回收PLVX-SHRNA-PUROvector酶切片段，连接空PLVX.1载体（来自clontech公司）与shRNA寡核苷酸双链，连接形成的重组载体，连接产物转化新鲜感受态细胞E.coli DH5α，37℃培养16h后挑阳性克隆进行菌落PCR鉴定，测序结果验证重组质粒构建成功后，提取重组质粒；

（3）QPCR筛选shRNA：CXCR4基因的QPCR引物为载体多克隆位点两端的引物，培养293细胞，将质粒和lipo2000复合物加入六孔板293细胞中，提取各组细胞的RNA，将RNA反转录为cDNA，利用cDNA为模板，利用所述QPCR引物检测CXCR4基因的相对表达量，荧光定量检测各组引物；PCR反应条件：95℃30s，1循环，55℃30s40循环，95℃5s，60℃1min，95℃15s。

步骤（3）中所述QPCR引物序列为： Primer（＋）:5’GGAGAGTTGTAGGATTCTAC-3’^，Primer(-):5’-CCTCGGTGTAGTTATCTGAAG-3^’。

PLVX-shRNA-PURO vector环状空质粒是由clontech公司载体PLVX-shRNA2改造的，具体方式是:扩增puro表达框，将puro表达框克隆至PLVX-shRNA2载体ZSgreen后面。公认的绿色强荧光蛋白，本领域技术人员可以按此方法获得该质粒。

本发明的优点在于：

慢病毒载体和逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体等相比，具有以下的优点：（1）可感染分裂期细胞与非分裂期细胞，如神经系统、造血系统等非分裂期细胞，免疫反应较小；（2）可转移基因片段较大，可插入约10 kb 的基因片段；（3）病毒突变与产生有复制能力的病毒机率较小，大大减少了产生有复制能力的病毒（replication competentvirus，RCV）；（4）目的基因和宿主基因组通过整合，可实现目的基因较长时间的表达。基因治疗中的RNA干扰技术已成为肿瘤治疗的新方法，慢病毒载体能安全将肿瘤目的基因转移到机体。通过慢病毒载体介导的RNAi技术，发现与疾病相关的影响因素，并尝试由此着手研究治疗的方法，达到治疗疾病的效果。为此还应该保证更高的安全性、 有效性和可靠性，并逐步从体外实验和动物实验进入到临床试验阶段，相信该技术将在今后的研究领域和临床实际应用方面有着更广阔的前景。

附图说明

图1 CXCR4-shRNA阳性克隆PCR鉴定图，1：阴性对照（ddH₂O）；2:Marker；3-8:CXCR4-shRNA克隆。

图2各组293细胞中CXCR4表达变化（,n=3），*P>P>

具体实施方式

1材料与方法

1.1材料

人肺腺癌PC9细胞株购自上海玉博生物科技有限公司。细胞用DMEM 90%, FetalBovine Serum 10%培养基，在37℃，5％CO₂的细胞培养箱中常规培养。CXCR4兔多克隆抗体、GAPDH鼠多抗购自abcam公司，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗购自abcam公司

1.2方法

1.2.1 干扰序列设计

根据GenBank CXCR4的mRNA全序列（Accession No：NM_003467），经BLAST同源性比对证实特异性后应用RNA structure 4.4软件对靶mRNA序列的二级结构进行评估，得到3条19nt靶序列。然后针对各靶序列设计合成其相应的两条shRNA寡核苷酸单链。同时设计一对对照序列siRNAc。然后根据siRNA的序列设计合成两条shRNA寡核苷酸单链。设计如下：BamH 酶切位点+19 nt靶核苷酸序列+茎环结构（TTCAAGAGA）+靶序列互补序列+RNA Poly聚合酶转录中止位点（TTTTTT）+EcoR 酶切位点六个区域，分别命名为shRNA1、shRNA2 、shRNA3、，以及shRNAc，具体序列见表1。shRNA寡核苷酸链由上海生工公司合成。

表1. CXCR4基因的3条特异性SiRNA靶序列

1.2.2 慢病毒表达载体的构建及鉴定

空载体pGC-LV 带有 GFP标记。将PLVX-shRNA-PURO vector环状空质粒用BamH 和EcoR 限制性内切酶进行双酶切，并回收PLVX-SHRNA-PURO vector酶切片段。连接空PLVX.1载体与shRNA寡核苷酸双链，连接形成的重组载体分别标记为：PLVX-CXCR4shRNA1、PLVX-CXCR4shRNA2、PLVX-CXCR4shRNA3、PLVX-CXCR4shRNAc。连接产物转化新鲜感受态细胞E.coli DH5α。37℃培养16h后挑阳性克隆进行菌落PCR鉴定，送上海生工进行DNA测序鉴定。测序结果验证重组质粒构建成功后，提取重组质粒。

1.2.3 QPCR筛选最佳干扰效果的shRNA

CXCR4基因的QPCR引物为载体多克隆位点两端的引物，序列为Primer（＋）:5,’GGAGAGTTGTAGGATTCTAC3^’，Primer(-):5^’CCTCGGTGTAGTTATCTGAAG3^’，

培养293细胞，将质粒(pLVX-CXCR4shRNA1,pLVX-CXCR4shRNA2,pLVX-CXCR4shRNA3、pLVX-acGFP-C1）和lipo2000复合物加入六孔板293细胞中，提取各组细胞的RNA，将RNA反转录为cDNA，利用cDNA为模板，检测CXCR4基因的相对表达量，荧光定量检测各组引物。PCR反应条件：95℃30s，1循环，55℃30s40循环，95℃5s，60℃1min，95℃15s。以 2^-△△Ct值表示CXCR4基因mRNA的相对表达水平>

1.2.4 慢病毒包装

根据干扰筛选的结果，将最佳干扰效果的干扰载体PLVX-CXCR4-shRNA1涂板，37℃培养过夜，挑取单菌落，接种到200ml的LB培养基中，250rpm,37℃摇菌培养过夜，大量提取质粒。大量培养293T细胞，转染前一天，用胰蛋白酶消化对数生长期的 293T细胞，用不含抗生素的DMEM完全培养基接种293FT细胞于60 mm平皿中，每个皿接种细胞2×106个细胞，37℃、5%CO2 培养箱内培养24 h。将shRNAc、CXCR4-shRNA分别和慢病毒包装质粒共转染293T细胞。48 h收集转染后的293T 细胞上清液，滤液经超速离心后浓缩，去掉上清，保留下面沉淀，加入适量的PBS 溶解病毒沉淀，分装后保存在病毒管中，-80℃长期保存。

1.2.5 病毒滴度测定

培养293细胞，将细胞接种到48孔板，每孔105个细胞，37℃，5%CO2继续培养18h。取20μl的病毒稀释到200μl的DMEM培养基，依次10稀释病毒即（10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7），混匀稀释的病毒，分别加到48孔中，每孔100μl，37℃，5%CO2继续培养48h。利用荧光倒置显微镜检测统计各个孔带荧光细胞的数量，结合稀释倍数计算病毒滴度：滴度(TU／m1)>

1.2.6 稳定干扰细胞株的建立

感染前1天取对数生长期状态良好的PC9细胞按每孔5 x10⁵>-1>

1.2.7 QPCR检测细胞 PC-9mRNA干扰效率

收集PC9/CXCR4-shRNA、PC9/shRNAc细胞，按QIAGEN Rneasy Mini kit试剂盒说明书中的实验方法和步骤提取细胞总RNA，并按照反转录试剂盒（PrimeScript RT reagent Kit）进行cDNA逆转录合成。以此cDNA为模板，应用荧光定量PCR试剂盒进行PCR扩增，CXCR4和GAPDH基因(内参照)引物由生工生物工程（上海）股份有限公司设计合成。CXCR4：Primer（＋）:5^,>,CCTCGGTGTAGTTATCTGAAG3^,。PCR反应条件：95℃30s，1循环，55℃30s40循环，95℃5s，60℃1min，95℃15s。以2^-ddCt值表示CXCR4基因mRNA的相对表达水平。

1.2.8 Western blot检测细胞PC-9蛋白干扰效率

收集 PC9/CXCR4-shRNA、PC9/shRNAc细胞，加入细胞裂解液冰上裂解10 min，取蛋白上清用BCA蛋白浓度测定浓度。取 50～80g蛋白质进行10％SDS—PAGE电泳，分离后的蛋白质电转移至PVDF膜上，用含5％脱脂奶粉的封闭液室温封闭2 h；加入1：2000稀释的兔抗人CXCR4多克隆抗体和1：2000稀释的小鼠抗人 GAPDH单克隆抗体，4℃反应过夜；TBS洗膜后，分别加入1：3000稀释的二抗(HRP标记的山羊抗兔或山羊抗小鼠IgG)，室温反应2h； TBS洗涤后，加入化学发光试剂，冷CCD成像系统曝光、显影和定影。扫描胶片，对各蛋白条带进行灰度值分析，以CXCR4蛋白条带灰度值与内参照GAPDH蛋白条带灰度值的比值表示CXCR4蛋白的相对表达水平。

2结果

2.1重组慢病毒质粒的PCR和测序鉴定

PCR鉴定重组慢病毒质粒时，连接入shRNA片段的阳性克隆PCR片段大小为200bp。将PCR产物进行电泳，第1、2、3对靶点序列结果均显示阳性克隆(Fig1)。从每个靶点序列的阳性克隆中各选一个进行测序，结果测试结果显示序列是正确的。

2.2 最佳干扰效果的shRNA筛选

各组293细胞中的CXCR4的mRNA表达水平如图2所示，结果显示：通过单因素方差分析，与空白对照组相比，实验组中的293细胞的CXCR4的表达水平均显著下降（P=0.0001<0.01），阴性对照载体组的293细胞的CXCR4表达水平变化无统计学意义（P=0.192>0.05），说明CXCR4-shRNA载体能显著下调293细胞中CXCR4mRNA的表达，且CXCR4-shRNA1载体下调最明显。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110>福建医科大学

<120>CXCR4RNAi慢病毒载体的构建方法

<130>10

<160>10

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

ggagagttgt aggattctac 20

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

cctcggtgta gttatctgaa g 21

<210>3

<211>59

<212>DNA

<213>shRNA1（Top）

<400>3

gatccggatc agcatcgact ccttttcaag agaaaggagt cgatgctgat ccttttttg59

<210>4

<211>59

<212>DNA

<213>shRNA1（Bottom）

<400>4

aattcaaaaa aggatcagca tcgactcctt tctcttgaaa aggagtcgat gctgatccg59

<210>5

<211>59

<212>DNA

<213>shRNA2（Top）

<400>5

gatccggatc agtatataca cttcttcaag agagaagtgt atatactgat ccttttttg59

<210>6

<211>59

<212>DNA

<213>shRNA2（Bottom）

<400>6

aattcaaaaa aggatcagta tatacacttc tctcttgaag aagtgtatat actgatccg59

<210>7

<211>59

<212>DNA

<213>shRNA3（Top）

<400>7

gatccgcaag gcagtccatg tcatttcaag agaatgacat ggactgcctt gcttttttg59

<210>8

<211>59

<212>DNA

<213>shRNA3（Bottom）

<400>8

aattcaaaaa agcaaggcag tccatgtcat tctcttgaaa tgacatggac tgccttgcg59

<210>9

<211>59

<212>DNA

<213>shRNAc（Top）

<400>9

ccggtgcttc gacatttaac caatttcaag agaattggtt aaatgtcgaa gcttttttg59

<210>10

<211>59

<212>DNA

<213>shRNAc（Bottom）

<400>10

aattcaaaaa agcttcgaca tttaaccaat tctcttgaaa ttggttaaat gtcgaagca59