同源重组与Gibson Assembly方法构建腺病毒载体对比

摘要

目的：腺病毒广泛存在于自然中，能通过呼吸道、消化道、眼粘膜等途径感染动物和人，无论增殖和非增殖细胞也都可以被感染，对人类的致病性低，且与人类基因组同源，不会整合到人染色体中，不会导致染色体突变。如果用腺病毒作为特异性DNA序列呈递载体，将具有感染效率高、安全性好、多种给药途径、成本易控制、便于保存等优势。本研究用传统同源重组与近年来开发的Gibson Assembly及两者相结合三种构建腺病毒载体的方法进行构思、设计、制作和对比，并做出评价，为腺病毒载体构建提供依据和经验。
　　方法:将E1区、E3区、蛋白IX缺损的AD4（4型腺病毒）感染入Hela229细胞，使其在细胞中感染、增殖72小时，并用超滤管提取AD4 DNA。分为三组进行实验：第一组用同源重组方法，经PCR将pBR322质粒中扩增左右两条同源臂，同源臂与AD4 DNA两端同源，将AD4 DNA镶嵌入pBR322质粒，构建出携带全长AD4 DNA的腺病毒载体。第二组用Gibson Assembly方法，将AD4 DNA分成4段（每段10kbp左右）和pBR322质粒，共5段DNA，两侧均设计30bp左右同源臂，用PCR分别扩增，再用Gibson Assembly方法将数段基因连接起来。第三组用Gibson Assembly和同源重组相结合方法，将DY330中含有kil和Red基因的一段基因组及第一组中的pBR322质粒及左右两条同源臂，共4段DNA，分别用PCR分别扩增，用Gibson Assembly方法将4段DNA连接，再与全长AD4 DNA进行同源重组。三组方法构建的腺病毒载体进行测序等鉴定，比较三种方法构建腺病毒载体的效价。
　　结果：经鉴定，用同源重组方法构建腺病毒载体：培养平板中菌落数量大于1000个，对其中360个鉴定，阳性结果有1个。用Gibson Assembly方法构建腺病毒载体：培养平板中菌落数量有112个，对其中10个鉴定，阳性结果有3个。用Gibson Assembly和同源重组相结合方法构建腺病毒载体：培养平板中菌落数量有65个，鉴定所以菌落，无阳性结果。
　　结论：比三种方法，Gibson Assembly方法比同源重组方法更加简单、高效、灵活多变。两者结合的方法败。

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3 讨 论

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综述：腺病毒载体疫苗的特点及研究进展

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