一种酶法催化合成山梨酸酯的方法

摘要

本发明公开一种酶法催化合成山梨酸酯的方法，所述方法是以山梨酸和C1‑C4醇为反应底物，以脂肪酶为催化剂，以有机溶剂为反应介质，加入吸水剂，在30‑60℃、200rpm条件下进行酯化反应，反应完全后，反应液分离纯化，获得山梨酸酯；本发明所述山梨酸酯的制备方法的有益效果主要体现在：酶的区域选择性强，反应转化率高，下游分离简单，能耗低，环境污染小，适合工业化生产，酯化率为90～99％。

说明书

(一)技术领域

本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种脂肪酶催化合成山梨酸酯的方法。

(二)背景技术

山梨酸是一种不饱和脂肪酸，具有优良的抑制酵母菌、霉菌和好氧性细菌的活性，能抑制微生物的生长和繁殖，从而达到有效延长食品的保存时间。但由于山梨酸是天然存在的有机酸，易被微生物分解代谢，抗菌作用时效短，其抗菌作用也不够强，对微生物抑制能力有限，对乳酸菌及厌氧性芽孢菌无效，只适宜在偏酸性的条件下使用，使用范围受到很大限制。为了提高山梨酸的抗菌范围，需要对山梨酸进行酯化修饰。

山梨酸酯是一类新型的山梨酸衍生物，具有浓郁的醇香味，是生产山梨酸酯增效剂及无公害农药增效剂的中间体，是一种被国际公认的低毒高效食品防腐剂，山梨酸酯在调香、天然果汁等防腐保鲜有良好的前景。目前国内外报道的山梨酸酯的合成方法均采用化学方法，化学法往往是在高温、高压、酸性或碱性催化剂中进行反应，生产能耗较高，存在安全隐患。

2000年邓继勇等报道的山梨酸乙酯的非酸催化合成，该方法以山梨酸和乙醇为底物，氯化亚锡水化合物作催化剂，4A分子筛作除水剂，在110℃下合成山梨酸乙酯。反应后除去催化剂后需取样测定酸值，催化剂在制备、运输、使用中也存在安全隐患。

2001年汤健等申请的一项发明专利(山梨酸原液生产的方法，公开号CN1296001A)中介绍了一种仿自然衍生法在反应釜中进行，经过混合，加热，冷却出料的工序，低酸量，高醇化的反应工艺制取山梨酸乙酯原液。该专利介绍的方法合成的山梨酸乙酯原液中，山梨酸乙酯含量较低，仅15％左右。

2013年梁红冬等报道的山梨酸乙酯的合成研究，该方法以对甲苯磺酸为催化剂，用分子筛作为吸水剂，用环己烷作带水剂，底物山梨酸和乙醇在催化剂作用下进行酯化反应制得山梨酸乙酯。该方法是在水相中催化合成山梨酸乙酯，最大得率不到80％。

(三)发明内容

本发明的目的是为了解决上述方法的不足，利用脂肪酶为催化剂合成山梨酸酯。利用脂肪酶催化山梨酸酯未见文献报道，而且生产工艺条件温和，步骤简单，产品收率高，环境友好，节能环保等优点。

为达到发明目的本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种酶法催化合成山梨酸酯的方法，所述方法是以山梨酸(Ⅰ)和C1-C4醇为反应底物，以脂肪酶为催化剂，以有机溶剂为反应介质，加入吸水剂，在30-60℃、200rpm条件下进行酯化反应(2-20小时，优选6～10小时)，反应完全后，反应液分离纯化，获得山梨酸酯(Ⅱ)；所述吸水剂为4A分子筛；所述有机溶剂为下列之一：叔丁醇、正己烷、环己烷、甲苯、苯、石油醚、乙醚或氯仿，优选叔丁醇或甲苯；所述脂肪酶与山梨酸质量比为0.05-5：1，优选5:1。

(Ⅱ)R为C1-C4直链烷基。

所述脂肪酶优选来自来自南极假丝酵母(Candida antarctica)的脂肪酶B(CAL-B)。其中固定化CAL-B脂肪酶(丹麦诺维信公司Novozyme 435)是一种商品化脂肪酶，原料易得，催化效率高，稳定性好，具有较宽的底物范围，酶活为10000U/g。所述脂肪酶形式可以为微生物发酵所得湿菌体干燥得到的静息细胞、经分离纯化后的脂肪酶提取物或者其固定化酶形式。最优选所述脂肪酶为Novozyme 435。

进一步，所述C1-C4醇为甲醇、乙醇、丙醇或丁醇。

进一步，所述有机溶剂体积用量以山梨酸质量计为90ml/g，所述C1-C4醇体积用量以山梨酸质量计为10ml/g，所述吸水剂与山梨酸质量比为1-10:1，优选10:1。

凡是能溶解反应底物山梨酸或产物山梨酸酯的有机溶剂都在本发明的保护范围之内，本发明推荐的有机溶剂为下列之一：叔丁醇、正己烷、环己烷、石油醚、甲苯、苯、乙醚、或氯仿，更优选叔丁醇和甲苯。

山梨酸酯的提取分离：酶转化后过滤除去固定化脂肪酶，通过蒸馏除去有机溶剂得到产物山梨酸酯产品。具体所述反应液分离纯化方法为：反应结束后，反应液过滤，滤液在0.1MPa减压蒸馏至无馏出物，得到所述山梨酸酯。

本发明所述山梨酸酯的制备方法的有益效果主要体现在：酶的区域选择性强，反应转化率高，下游分离简单，能耗低，环境污染小，适合工业化生产，酯化率为90～99％。

(四)附图说明

图1实施例4中山梨酸乙酯标准品气相色谱图。

图2实施例4中产物山梨酸乙酯的气相色谱图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1

在密闭10ml三角瓶中，将0.04g山梨酸和0.4ml无水乙醇溶3.6ml叔丁醇中，加入0.2g脂肪酶Novozyme 435(酶活10000U/g)和0.4g 4A分子筛(购自阿拉丁试剂(上海)有限公司)，在30℃恒温振荡反应10小时，振荡速度为200r/min，取样进行气相色谱分析，山梨酸转化率为81.6％。

山梨酸Ⅰ或产物Ⅱ的气相色谱仪测定条件：HP-5毛细管柱；柱温箱温度恒温150℃；载气：氮气；柱流量：1ml/min；FID检测器。

实施例2

在密闭10ml三角瓶中，将0.04g山梨酸和0.4ml无水乙醇溶3.6ml叔丁醇中，加入0.2g脂肪酶Novozyme 435和0.4g 4A分子筛，在40℃恒温振荡反应10小时，振荡速度为200r/min，取样进行气相色谱分析，山梨酸转化率为90.5％。

实施例3

在密闭10ml三角瓶中，将0.04g山梨酸和0.4ml无水乙醇溶3.6ml叔丁醇中，加入0.2g脂肪酶Novozyme 435和0.4g 4A分子筛，在50℃恒温振荡反应10小时，振荡速度为200r/min，取样进行气相色谱分析，山梨酸转化率为96.2％。

实施例4

在密闭10ml三角瓶中，将0.04g山梨酸和0.4ml无水乙醇溶3.6ml叔丁醇中，加入0.2g脂肪酶Novozyme 435和0.4g 4A分子筛，在60℃恒温振荡反应10小时，振荡速度为200r/min，取样进行气相色谱分析，山梨酸转化率为99.4％，反应结束，反应液过滤，滤液在0.1MPa压力下减压蒸馏无液体流出，得到山梨酸乙酯(气相色谱图见图2)，产率96.2％，纯度为99.2％。山梨酸乙酯标准品气相色谱图见图1所示。

实施例5：

按实施例4方法，用其它有机溶剂代替水叔丁醇作为反应溶剂，其他条件不变，对山梨酸进行酶法酯化。该反应的转化率见表1。表1结果表明，在反应转化率方面上，叔丁醇和甲苯作为反应溶剂都要优于其他溶剂。

表1：不同溶剂体系的酶转化结果

实施例6：

按实施例4方法，用不同脂肪酶作为催化剂，其他条件不变，对山梨酸进行酶法酯化。该反应的转化率见表2。表2结果表明，Novozyme 435要优于其他脂肪酶。

表2：不同脂肪酶的酶转化结果

实施例7：

按实施例4方法，用不同短链醇作为酰基受体代替无水乙醇，其他条件不变，对山梨酸进行酶法酯化合成相应的山梨酸酯。该反应的转化率见表3。表3结果表明，Novozyme435可以催化合成相应短链醇的山梨酸酯。

表3：不同短链醇的酶转化结果

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明的技术内容作任何形式上的限制。凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均落入本发明的保护范围内。