一种具有抗氧化、抗疲劳活性的海马多肽及其制备工艺

摘要

本发明公开了一种具有抗氧化、抗疲劳活性的海马多肽及其制备方法，是以干海马为原料，经粉碎、电子束辐照‑超声波处理、复合酶解、超滤、冷冻干燥，制得所述海马多肽。本发明将电子束辐照技术与超声波处理结合应用于海马多肽的制备，能有效提高对海马的酶解速度，加快目标肽段的释放，并提高酶解产物的抗氧化活性。另一方面，利用可控酶解酶技术，通过控制水解条件和水解度，能获得尽可能多的目标分子量分布的肽类产物，同时在比较温和的酶解条件下能够很好地保存酶解产物的营养价值，安全性极高。此外，本发明利用滤膜包对酶解产物进行过滤，最终获得的海马多肽分子量在5000Da以下，纯度较高，并且具有明显的抗疲劳功效。

说明书

技术领域

本发明属于食品加工技术领域，具体涉及一种具有抗氧化、抗疲劳活性的海马多肽及其制备工艺。

背景技术

海马是海龙科动物，性温、味甘，是传统补益中药，具有温肾壮阳、散结消肿的作用。中国药典2005年版规定可入药的海马种类有海龙科动物线纹海马(Hip-pocampus>kelloggi>)、刺海马(Hippo-campus>)、大海马(Hippocampus>)、三斑海马(Hippocampus>)和小海马(海蛆) (Hippocampus>)的干燥体。海马药用历史悠久，早在梁代陶弘景《本草经集注》中已有记载，时称“水马”。公元739年陈藏器在《本草拾遗》中首次使用海马之名。欧洲从18世纪开始将海马入药。《本草纲目》记载：海马，主难产及血气痛；暖水脏，壮阳道；消瘕块，治疗疮肿毒。故有温肾壮阳，散结消肿之功效；主治阳痿、肾虚作喘、症瘕积聚、瘰疠痰核、跌打损伤，外治痈肿疗疮。近年来的药理研究表明海马不仅有激素样作用，增强造血功能，还显示了抗癌、抗衰老、抗疲劳和Ca²⁺阻断等作用。目前，关于海马的研究主要集中在养殖技术、化学成分的研究，对药理功效方面的研究也比较浅显。

近几年，海洋生物活性肽是食品领域的研究热点。海马含有丰富的蛋白和必须氨基酸，是制备蛋白质及生物活性肽的优质蛋白原料，具有潜在的巨大商业价值。而目前关于海马生物活性肽的研究只限于对酶解液化海马蛋白的抗氧化活性研究。因此，有必要对海马多肽的制备及其生物活性进行深入研究。

生物活性肽的来源主要有两个：一是天然存在于生物体内的活性肽，主要包括肽类激素、组织肌肽、神经多肽等，此类活性肽被称为内源性生物活性肽；二是通过水解海洋蛋白质资源所获得的具有各种生理功能的活性肽，此类活性肽被称为外源性海洋生物活性肽。内源性生物活性肽的制备方法主要是溶剂萃取法，在提取过程中需要使用大量的有机溶剂（多为丙酮和乙醇等），因此会对环境造成污染并且存在有机溶剂残留给活性肽带来毒性的问题；同时，由于内源性活性肽在生物体内含量很少，对下游技术（特别是分离纯化技术）要求苛刻并且要获得纯度较高的、足量的产物会造成极大地资源浪费，并不适合大规模工业化生产。外源性生物活性肽的制备方法主要是可控酶解法，蛋白质的可控酶解是采用内切肽酶对蛋白质进行水解，并通过控制水解条件和水解度，以获得尽可能多的目标分子量分布的肽类产物。在营养蛋白的多肽链内部可能普遍存在着功能区，通过可控酶解技术，就有可能把蛋白质中所蕴藏的功能区肽片段释放出来，制备出具有各种各样生理活性的生物活性肽。

蛋白酶的选择是酶解法制备海洋生物活性肽的关键，每种蛋白酶都有特定的酶切位点，使用不同的蛋白酶酶解同种蛋白所产生的水解产物的理化和功能性质不尽相同。目前海马的酶解工艺均采用单酶酶解，用此法得到多肽结构往往较为单一且生物活性也相对有限。复合酶解是利用多种蛋白酶以此对蛋白质进行切割，因此能够获得更加丰富的目标肽段，提高其生物活性，同时获得的多肽分子量也更为短小，将更有利于被人体吸收利用。

干海马质地坚硬，传统的酶法提取需要较长的酶解时间，同时在酸、碱、有机溶剂等反应介质中易使蛋白质变性失活，因此酶解效率较低。已授权的发明专利“一种海马多肽酶解液的制备方法”（申请号：CN 201310196742.1）和已公布的发明专利“一种海马血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法”（申请号：CN 201510100963.3）、“一种从海马提取短肽的方法”（ 申请号 CN 201310180051.2）均采用传统的酶解方法，因而酶解时间较长（7-9h），效率低下，且以上专利的加工工艺与本专利有本质不同。采用电子束辐照处理蛋白质，可以改变蛋白的结构特征，辅助增强蛋白质中的肽键断裂，使海马蛋白结构变得松散，从而提高蛋白的水解度；超声波对酶解反应的影响主要是空化效应，即超声波可在液体介质中形成微泡，其破裂伴随能量的释放，使海马蛋白结构变得软烂，以此提高许多化学反应的速度。如果将电子辐照、微波或者超声波等物理手段与酶解法相结合应用于海马生物活性肽的制备，不仅可以缩短酶解时间，提高酶解效率，还可以获得更加丰富的目标肽段。已公布的发明专利“一种从鱼鳞中提取胶原蛋白的方法”（申请号：CN 201510603711.2）应用了电子辐照技术来提高鱼鳞胶原蛋白的提取速率，但其酶解处理仍然需要较长的时间（3-4h），此发明也应用了超声波处理进行脱灰，但并没有将电子辐射与超声波技术结合应用于酶解处理，以此进一步缩短酶解时间，提高酶解效率，且以上专利的加工工艺与本专利有本质不同。

发明内容

本发明的目的在于针对现有加工技术上的不足和存在的问题，提供一种具有抗氧化、抗疲劳活性的海马多肽及其制备方法，解决了传统酶解工艺存在的耗时长、效率低、产物生物活性不高等问题，提供了一种高活性海马多肽的制备工艺。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种具有抗氧化、抗疲劳活性的海马多肽及其制备工艺，其特征在于：本法有利于高效、快速地制备具有最强抗氧化活性的目标肽段，制得的海马多肽分子量在5000Da以下，具有较好的抗疲劳功效。

所述具有抗氧化、抗疲劳活性的海马多肽的制作工艺，是以干海马为原料，经粉碎、电子束辐照-超声波处理、复合酶解、超滤、冷冻干燥制得成品，其具体包括以下步骤：

1）粉碎：选取未吸潮变质、味道清淡无异味的干燥海马，将其剪成0.5~1cm的小段，并用中草药粉碎机进行粉碎；

2）电子束辐照-超声波处理：将步骤1）得到的海马粉末置于电子直线加速器中进行辐照处理（2.5~3KGy，），之后以料液比1:15~1:20的比例，将海马粉末溶于去离子水中，磁力搅拌20~30分钟，最后进行超声处理（400~600W，50~60℃，20~30min）；

3）复合酶解：调节步骤2）得到的海马溶液pH至6.5~7.0，以3000~4000U/g_海马的比例加入适量的木瓜蛋白酶，在60~65℃的条件下水浴酶解30~40分钟；冷却至室温后再次调节溶液的pH至7.5~8.0，以3000~4000U/g_海马的比例加入适量的胰蛋白酶，在40~45℃的条件下水浴酶解30~40分钟，最后在沸水浴中灭酶10~15分钟后离心取上清液，得到海马酶解液；

4）过滤：依次用截留分子量为10000Da、5000Da的超滤膜对海马酶解液进行超滤，得到分子量小于5000Da的海马多肽液；

5）干燥：将步骤4）处理后的滤液进行浓缩，将浓缩液冷冻结冰后进行真空冷冻干

燥，得到海马多肽粉末。

本发明的显著优点在于：

（1）本发明采用复合酶解技术制备海马多肽，能够获得更加丰富的目标肽段，提高其生物活性，同时获得的多肽分子量也更为短小，将更有利于被人体吸收利用；酶解条件比较温和，可以很好地保存酶解产物的营养价值，安全性极高，无任何对人体有害的副产物产生；另外酶解切除了蛋白中非功能区的肽段，可以有效地避免免疫排斥反应的困扰。

（2）干海马质地坚硬，传统酶解工艺需要较长的酶解时间才能释放出目标肽段的活性肽，因此会导致产物的活性降低。本发明将电子束辐照-超声波处理与酶解法相结合应用于海马多肽的制备，不仅可以缩短酶解时间，提高酶解效率，还可以获得更加丰富的目标肽段，提高其生物活性。采用电子束辐照处理蛋白质，可以改变蛋白的结构特征，辅助增强蛋白质中的肽键断裂，使海马蛋白结构变得松散，从而提高蛋白的水解度；超声波对酶解反应的影响主要是空化效应，即超声波可在液体介质中形成微泡，其破裂伴随能量的释放，使海马蛋白结构变得软烂，以此提高许多化学反应的速度。传统的酶解时间为7-9小时，本发明所需的酶解时间为1-2小时，效率提高了大约85-88%。

（3）本发明所制得的海马多肽分子量较小，均在5000Da以下，将更有利于被人体吸收利用。

（4）本发明应用冷冻干燥技术，能够尽量减少海马多肽在干燥过程中生物活性的损失，同时获得存储性能良好的海马多肽粉末。

（5）本发明所制得海马多肽粉末，不仅有良好的抗氧化功效，同时具有较强的抗疲劳活性。

附图说明

图1 小鼠力竭游泳实验结果；

图2 小鼠体内抗疲劳活性指标测定结果；

图3 不同酶制剂酶解效果的比较。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

实施例1

所述具有抗氧化、抗疲劳活性的海马多肽的制作方法具体包括以下步骤：

1）粉碎：选取未吸潮变质、味道清淡无异味的干燥海马，将其剪成0.5cm的小段，并用中草药粉碎机进行粉碎；

2）电子束辐照-超声波处理：将步骤1）得到的海马粉末置于电子直线加速器中进行辐照处理（2.5KGy，），之后以料液比1:15的比例，将海马粉末溶于去离子水中，磁力搅拌25分钟，最后进行超声处理（600W，50℃，30min）；

3）可控酶解：调节步骤2）得到的海马溶液pH至6.5，以4000U/g_海马的比例加入适量的木瓜蛋白酶，在60℃的条件下水浴酶解40分钟；冷却至室温后再次调节溶液的pH至7.5，以3000U/g_海马的比例加入适量的胰蛋白酶，在40℃的条件下水浴酶解30分钟，最后在沸水浴中灭酶15分钟后离心取上清液，得到海马酶解液；

4）过滤：依次用截留分子量为10000Da、5000Da的超滤膜对海马酶解液进行超滤，得到分子量小于5000Da的海马多肽液；

5）干燥：将步骤4）处理后的滤液进行浓缩，将浓缩液冷冻结冰后进行真空冷冻干

燥，得到海马多肽粉末。

实施例2

所述具有抗氧化、抗疲劳活性的海马多肽的制作方法具体包括以下步骤：

1）粉碎：选取未吸潮变质、味道清淡无异味的干燥海马，将其剪成1cm的小段，并用中草药粉碎机进行粉碎；

2）电子束辐照-超声波处理：将步骤1）得到的海马粉末置于电子直线加速器中进行辐照处理（3.0KGy，），之后以料液比1:20的比例，将海马粉末溶于去离子水中，磁力搅拌20分钟，最后进行超声处理（400W，50℃，25min）；

3）可控酶解：调节步骤2）得到的海马溶液pH至7.0，以3000U/g_海马的比例加入适量的木瓜蛋白酶，在60℃的条件下水浴酶解30分钟；冷却至室温后再次调节溶液的pH至8.0，以4000U/g_海马的比例加入适量的胰蛋白酶，在45℃的条件下水浴酶解40分钟，最后在沸水浴中灭酶15分钟后离心取上清液，得到海马酶解液；

4）过滤：依次用截留分子量为10000Da、5000Da的超滤膜对海马酶解液进行超滤，得到分子量小于5000Da的海马多肽液；

5）干燥：将步骤4）处理后的滤液进行浓缩，将浓缩液冷冻结冰后进行真空冷冻干

燥，得到海马多肽粉末。

抗疲劳活性实验

以实施例1所得海马多肽为原料进行动物实验，验证其抗疲劳活性。

一、分组

将100只ICR小鼠分成5大组，一组20只；一个大组再分成两个亚组，一组10只；第一个亚组用于游泳力竭实验，第二个亚组用于测定游泳30min 后小鼠体内各生理生化指标的变化。

一组2×10（空白）：不作任何处理，自由进食。

二组2×10（阳性对照）：灌胃0.5mg/g.d谷胱甘肽，自由进食。

三组2×10（低）：灌胃0.15mg/g.d海马多肽，自由进食。

四组2×10（中）：灌胃0.5mg/g.d海马多肽，自由进食。

五组2×10（高）：灌胃1.5mg/g.d海马多肽，自由进食。

二、喂养

正式实验前，小鼠需饲养一周适应实验环境，每笼5只小鼠，自由饮食，喂养标准饲料，饮水瓶随时更换，鼠笼每周换洗2次。

正式实验开始，按“分组”中的要求对小鼠进行灌胃，给药频率为1次/日，给药时间为4周。

三、小鼠力竭游泳时间测定

第一个亚组的5组小鼠在末次给药30 min 后，小鼠尾根部负荷 5 %体重铅皮，置于游泳箱中（水温25±1℃，水深不少于30 cm）游泳，至小鼠沉入水底后10 s不再浮起作为力竭死亡标准，记录自游泳开始至死亡时间，作为小鼠力竭游泳时间。

四、海马多肽体内抗疲劳活性研究

第二个亚组的5组小鼠在末次给药 30 min后，游泳30min后处死，采血后取肝脏，测定血糖、血尿素氮、肝糖原含量。

五、实验结果

由图1、图2可知，相比于空白组，阳性对照组、实验组都能增加小鼠的力竭游泳时间，说明海马多肽和谷胱甘肽均有一定的抗疲劳活性，其原因是海马多肽和谷胱甘肽能够有效地稳定小鼠体内血糖的含量，同时能明显降低其血尿素氮含量，有助于小鼠体内糖原的合成代谢，提高其肝糖原贮备量，使肌体对负荷的适应性增强，显示出较强的抗疲劳作用，提高了肌体的耐力。另外，比较阳性对照组和中剂量组的实验结果可以发现，海马多肽的抗疲劳效果要优于谷胱甘肽。

对比例1

重复实施例1，不同之处在于用单一的木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶、风味蛋白酶、碱性蛋白酶取代步骤（3）的复合酶处理，几种不同酶制剂的酶解效果、单酶酶解与复合酶解效果的比较分别如图3、表1所示。

由图3可知，比较六种酶的酶解效果，它们在水解度、肽得率上差异并不显著，木瓜蛋白酶酶解却有最强的DPPH•自由基清除率（71.89%）同时具有较强的羟自由基清除率（66.9%），胰蛋白酶酶解液具有最大的肽得率（33.65%）和较强的羟自由基清除率（75.15%），说明木瓜蛋白酶、胰蛋白酶更有利于剪切出具有较强抗氧化活性的海马多肽，因而选用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶作为制备海马多肽的复合酶制剂。

表1 单酶酶解与复合酶解对酶解效果影响的对比

由表1可知，相比于单酶酶解，复合酶解能够提高海马蛋白的水解度，获得更多的海马多肽，同时有效提高产物的DPPH•自由基和羟自由基清除率，说明胰蛋白酶和木瓜蛋白酶具有协同增效的作用。

对比例2

重复实施例1，不同之处在于用单一的电子束辐照处理工艺取代步骤（2）的电子束辐照-超声波处理工艺。

对比例3

重复实施例1，不同之处在于用单一的超声波处理工艺取代（2）的电子束辐照-超声波处理工艺。

对比例4

重复实施例1，不同之处在于去除步骤（2）的电子束辐照-超声波处理工艺。

五种处理方式对酶解效果的影响如表2所示：

表2 电子束辐照-超声波处理对酶解效果影响的对比

对比实施例1、实施例2和对比例2、对比例3、对比例4的酶解效果，可以看出电子束辐照-超声波处理工艺能够缩短酶解时间，提高酶解效率，传统的酶解时间为7-9小时，本发明所需的酶解时间为1-2小时，效率提高了大约85-88%。此外，酶解液具有更强的DPPH•自由基清除、羟自由基清除效果。

对比例5

重复实施例1，不同之处在于步骤3）的酶解时间，以木瓜蛋白酶解20min、胰蛋白酶酶解10min替代实施例1的可控酶解工艺。

对比例6

重复实施例1，不同之处在于步骤3）的酶解时间，以木瓜蛋白酶解80min、胰蛋白酶酶解60min替代实施例1的可控酶解工艺。

表3 酶解时间对酶解效果影响的对比

对比实施例1、实施例2和对比例5、对比例6的酶解效果，可以看出酶解时间过短或过长都不利于制备高活性的海马多肽，因此通过可控酶解技术，能够把蛋白质中所蕴藏的功能区肽片段充分释放出来，制备出具有高生理活性的生物活性肽，同时保证较高的多肽得率。

综上所述，采用本发明工艺制备海马多肽可以高效、快速地制备具有最强抗氧化活性的目标肽段，并且最终制得的海马多肽具有较好的抗氧化、抗疲劳功效。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

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