一种酸性外切多聚半乳糖醛酸酶及其基因和应用

摘要

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种酸性外切多聚半乳糖醛酸酶及其制备方法和应用。所述酸性外切多聚半乳糖醛酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。该酶最适pH为3.5、热稳定性好(最适温度70℃，在60、70℃中处理1h都能保持80％以上的酶活)，容易发酵生产。所有这些优点都意味着新发明的外切多聚半乳糖醛酸酶在饲料、食品行业中，将会比以前报道的外切多聚半乳糖醛酸酶更有应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种酸性外切多聚半乳糖醛酸酶及其基因和应用。

背景技术

果胶是一类带负电的高分子多糖，广泛存在于高等植物，特别是水果和蔬菜的组织中，是果蔬植物细胞中胶层的主要成分。果胶由不同酯化度的D-半乳糖醛酸以α-1,4糖苷键连接而成的多糖链,常带有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖等组成的侧链,分子量介于25kD～360kD之间。果胶类物质分为4类:原果胶(protopectin)、果胶(pectin)、果胶酸(pectic acid,pectate)和果胶酯酸(pectinic acid,pectinate)。果胶酶是分解果胶质的多种酶的总称,它能将高分子果胶多糖降解为小分子或单体还原糖形式，能够有效降解果胶，因此果胶酶具有重要的工业应用(Lucie Parenicova et al.,FEBS Letters(2000)467:333-336)。按作用机制果胶酶可以分为原果胶酶、解聚酶和果胶酯酶。解聚酶又可分为果胶水解酶和果胶裂解酶。其中水解酶通过水解作用切割D-半乳糖酸的α-1,4糖苷键生成寡聚半乳糖醛酸，而裂解酶则通过反式消去作用切断α-1,4糖苷键生成β-4,5不饱和半乳糖醛酸，果胶酯酶水解果胶中的甲酯,生成果胶酸(Nilay Demir et al.,Journal of Food Engineering(2001)47:275-280)。

多聚半乳糖醛酸链可通过裂解酶和水解酶两种方式进行解聚。多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase,Endo-/EC 3.2.1.15,Exo-/EC 3.2.1.67)作用于多聚半乳糖醛酸链的α-1,4-d-糖苷键，发生水解反应，产生单个或寡聚的半乳糖醛酸。多聚半乳糖醛酸酶的研究和应用最为广泛(Sharma et al.,Reviews in Environmental Science and Bio/Technology 2013,12:45–60。

多聚半乳糖醛酸酶是果胶酶系中研究最为广泛的酶种，属于糖苷水解酶第28家族，特异催化水解多聚半乳糖醛酸链中α-1,4-糖苷键产生单个或寡聚的半乳糖醛酸，而不能水解甲酯化或乙酰酯化的多聚半乳糖醛酸。与其他糖苷水解酶一样，多聚半乳糖醛酸酶有内切酶(endo-)和外切酶(exo-)之分，内切多聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15)的水解产物是寡聚半乳糖醛酸，而细菌和真菌来源的外切多聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.67)的水解终产物有所不同：细菌外切多聚半乳糖醛酸酶水解终产物为半乳糖醛酸；真菌外切多聚半乳糖醛酸酶的水解终产物为二聚半乳糖醛酸。

不同来源的多聚半乳糖醛酸酶，酶学性质差异显著。大多数外切多聚半乳糖醛酸酶的最适pH值属于碱性范围，外切多聚半乳糖醛酸酶的最适温度保持在50-60℃的范围。

发明内容

本发明的目的是提供了一种酸性、耐热外切多聚半乳糖醛酸酶。

本发明的再一目的是提供上述外切多聚半乳糖醛酸酶的编码基因。

本发明的再一目的是提供包含上述外切多聚半乳糖醛酸酶基因的重组载体。

本发明的再一目的是提供包含上述外切多聚半乳糖醛酸酶基因的重组菌株。

本发明的再一目的是提供一种制备外切多聚半乳糖醛酸酶的方法。

本发明的再一目的是提供上述外切多聚半乳糖醛酸酶的应用。

本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在饲料、食品等行业中应用的新的外切多聚半乳糖醛酸酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1：

该酶全长433个氨基酸，N端22个氨基酸为信号肽序列“MKFSNTLTQA ISLLSLGLAV EG”。

因此，成熟的外切多聚半乳糖醛酸酶的理论分子量为45.0kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2：

该外切多聚半乳糖醛酸酶的最适pH为3.5，在pH1.0-pH7.0范围内稳定；最适温度70℃，在85℃时依然具有30％的酶活力，在60处理1h酶活能保持80％以上，70℃中处理1h酶活能保持60％以上，在80℃下处理2min，能够保持60％以上的酶活力，具有良好的热稳定性。

本发明还提供了编码上述外切多聚半乳糖醛酸酶的基因。该酶的全基因序列如SEQ ID NO.3所示：

其中，信号肽的碱基序列为：

“ATGAAGTTCT CCAATACCCT TACCCAGGCA ATCAGCCTGT TGTCTCTGGG CCTCGCCGTG GAAGGG”

因此，成熟基因的编码序列为

SEQ ID NO.4所示：

该酶属于糖基水解酶第28家族，通过比对该酶为一种新的外切多聚半乳糖醛酸酶。

本发明还提供了包含上述外切多聚半乳糖醛酸酶基因的重组载体，优选为毕赤酵母表达载体。将本发明的外切多聚半乳糖醛酸酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将外切多聚半乳糖醛酸酶基因cDNA插入到质粒pPIC9上的EcoRI和NotI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOXl启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒。

本发明还提供了包含上述外切多聚半乳糖醛酸酶基因的重组菌株，优选为重组毕赤酵母菌株。

本发明还提供了一种制备外切多聚半乳糖醛酸酶酶的方法，包括以下步骤：

1)用上述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组外切多聚半乳糖醛酸酶的表达；以及

3)回收并纯化所表达的外切多聚半乳糖醛酸酶。

其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞或多型汉逊酵母(Hansenula polymorpha)细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichic pastoris)GS115，得到重组菌株。

本发明还提供了上述外切多聚半乳糖醛酸酶的应用。运用基因工程手段来产业化生产外切多聚半乳糖醛酸酶。本发明从蓝状菌中得到了一个新的外切多聚半乳糖醛酸酶基因，其编码的外切多聚半乳糖醛酸酶具有以下几个优点：酸性(最适pH为3.5)、热稳定性好(最适温度70℃，在60、70℃中处理1h都能保持80％以上的酶活)，容易发酵生产。所有这些优点都意味着新发明的外切多聚半乳糖醛酸酶在饲料、食品行业中，将会比以前报道的外切多聚半乳糖醛酸酶更有应用价值。本发明提供了一个新的外切多聚半乳糖醛酸酶基因，可作应用于饲料、食品等工业。根据本发明的技术方案就可以实现利用基因工程手段生产性质优良适合工业应用的外切多聚半乳糖醛酸酶。

附图说明

图1外切多聚半乳糖醛酸酶在毕赤酵母中表达的SDS-PAGE分析，M.蛋白分子量标准，1纯化的重组酶，2脱糖基后的重组酶。

图2本发明重组外切多聚半乳糖醛酸酶的最适pH值。

图3本发明外切多聚半乳糖醛酸酶的pH稳定性。

图4本发明外切多聚半乳糖醛酸酶最适反应温度。

图5本发明外切多聚半乳糖醛酸酶热稳定性。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：表达宿主Pichia pastoris GS115，表达质粒载体pPIC9为本公司保存。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自Fermentas公司，连接酶购自Promaga公司，多聚半乳糖醛酸购自Sigma公司。其它都为国产分析纯试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基：

(1)LB培养基：0.5％酵母提取物，1％蛋白胨，1％NaCl，pH 7.0

(2)YPD培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖

(3)MD固体培养基：2％葡萄糖，1.5％琼脂糖，1.34％YNB，0.00004％Biotin

(4)MM固体培养基：1.5％琼脂糖，1.34％YNB，0.00004％Biotin，0.5％甲醇

(5)BMGY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％甘油(V/V)，1.34％YNB，0.00004％Biotin

(6)BMMY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.00004％Biotin，0.5％甲醇(V/V)

4、本实施例中未做详细具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1外切多聚半乳糖醛酸酶编码基因的获得

设计克隆引物F：atgaagttctccaatacccttacccaggc和R：ctatacgcagtcgatggccaaagtgctc。提取蓝状菌KWB1总RNA，利用Oligo(dT)₂₀和反转录酶得到cDNA的一条链，然后设计扩增开放阅读框的的引物F和R，扩增该单链cDNA，获得外切多聚半乳糖醛酸酶的cDNA序列，扩增得到产物回收后送测序。以蓝状菌KWB1总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：95℃5min；94℃30sec,62℃30sec,72℃60sec,30个循环，72℃10min。得到一约1.3k>

实施例2外切多聚半乳糖醛酸酶工程菌株的构建

(1)表达载体的构建及在酵母的表达

以测序正确的外切多聚半乳糖醛酸酶的cDNA为模板，设计合成了带有EcoR I和Not I限制性酶切位点的引物cdna-sF:actgaattctcagggatcaatattcagagagatgatgcg和cdnaR:atagcggccgcctatacgcagtcgatggccaaagtgctc，对外切多聚半乳糖醛酸酶的成熟蛋白的编码区进行扩增。并利用EcoR>

以同样的方式构建含外切多聚半乳糖醛酸酶信号肽序列的cDNA的表达载体，并转化。

(2)高外切多聚半乳糖醛酸酶活性转化子的筛选

用灭过菌的牙签从长有转化子的MD板上挑取单菌落，按照编号先点到MD平板上，将MD平板置于30℃培养箱中培养1～2天，至菌落长出。按编号从MD平板上挑取转化子接种于装有3mL BMGY培养基的离心管中，30℃、220rpm摇床培养48h；将摇床培养48h的菌液3,000×g离心15min，去上清，离心管中再加入1mL含有0.5％甲醇的BMMY培养基，在30℃、220rpm诱导培养；诱导培养48h后，3,000×g离心5min，取上清用于酶活性检测，从中筛选出高外切多聚半乳糖醛酸酶活性的转化子，具体操作请参考毕赤酵母表达操作手册。

实施例3重组外切多聚半乳糖醛酸酶的制备

(1)外切多聚半乳糖醛酸酶基因在毕赤酵母中摇瓶水平的大量表达

筛选出酶活较高的转化子，接种于300mL BMGY液体培养基的1L三角瓶中，30℃，220rpm摇床振荡培养48h；5,000rpm离心5min，轻柔弃上清，再向菌体加入100mL含有0.5％甲醇的BMMY液体培养基，30℃，220rpm诱导培养72h。诱导培养期间，间隔24h补加一次甲醇溶液以补偿甲醇的损失，使甲醇浓度保持在0.5％左右；(3)12,000×g离心10min，收集上清发酵液，检测酶活性并进行SDS-PAGE蛋白电泳分析(图1)。

(2)重组外切多聚半乳糖醛酸酶的纯化

收集摇瓶表达的重组外切多聚半乳糖醛酸酶上清液，通过膜包进行浓缩，同时用低盐缓冲液置换其中的培养基，然后用超滤管进一步的浓缩。浓缩能稀释到一定倍数的重组外切多聚半乳糖醛酸酶，通过离子交换层析进行纯化。具体地，取重组外切多聚半乳糖醛酸酶浓缩液2.0mL经预先用20mM Tris-HCl(pH 7.5)平衡过的HiTrap Q Sepharose XL阴离子柱，然后用0-1mol/L的NaCl进行线性梯度洗脱，对分步收集的洗脱液检测酶活性和进行蛋白浓度的测定。

实施例4重组外切多聚半乳糖醛酸酶部分性质分析

采用DNS法对本发明的外切多聚半乳糖醛酸酶进行活性分析。具体方法如下：在pH 3.5，70℃条件下，1mL的反应体系包括l00μL适当的稀释酶液，900μL底物，反应l0rnin，加入1.5mL DNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。外切多聚半乳糖醛酸酶活性单位定义：在一定条件下，每分钟分解多聚半乳糖醛酸生成lμmol还原糖所需的酶量为1个活性单位(U)。

(1)外切多聚半乳糖醛酸酶的最适pH及pH稳定性

经纯化的实施例3表达的外切多聚半乳糖醛酸酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。所用缓冲液为pH 1.0～3.0甘氨酸-盐酸缓冲液，pH2.2～8.0的柠檬酸一磷酸氢二钠系列缓冲液，pH 8.0～9.0Tris-HC缓冲液，pH9.0～12甘氨酸-NaOH系列缓冲液。纯化的外切多聚半乳糖醛酸酶在不同pH的缓冲体系。80℃下测定的pH适性结果(图2)表明：。该外切多聚半乳糖醛酸酶的最适pH为3.5。

将酶液在不同pH值的缓冲液中于37℃下处理60min，再测定酶活性以研究酶的pH稳定性。结果表明(图3)，分析结果表明该酶在pH2.0-pH8.0之间稳定，具有优良的pH稳定性。

(2)外切多聚半乳糖醛酸酶反应最适温度及热稳定性

纯化的外切多聚半乳糖醛酸酶在pH 3.5条件下，测定不同温度(40-90℃)下的酶活性，分析实验结果表明显示，最适温度70℃，在80℃时依然具有60％的酶活力(图4)，在60℃下处理60min，酶活基本不损失，在70℃下处理60min，能够保持60％以上的酶活力，在80℃下处理2min，能够保持60％以上的酶活力，具有良好的热稳定性(图5)。

以多聚半乳糖醛酸(0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液)为底物，所述突变体和野生型在最适条件下的比活力分别为388U/mg，V_max＝1001U/min/mg,K_m＝3.8mg/mL。