IL-13修饰的含钆螯合物脂质体靶向磁共振成像对比剂及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种IL-13修饰的含钆螯合物脂质体靶向磁共振成像对比剂及其制备方法和应用。该对比剂为包封钆螯合物的脂质体，且脂质体表面经过IL-13修饰。其制备方法是先制备脂质体薄膜，然后将钆螯合物加入到含有脂质体薄膜的容器里，超声波的协助下，脂质体薄膜将钆螯合物包裹以形成含钆螯合物的多室脂质体；包封了钆螯合物的多室脂质体表面经硫醇化的IL-13修饰。本发明的对比剂可以穿过血脑屏障，传递到肿瘤病变部位并与之特异性结合。所以此对比剂具备靶向性，能够检测到小于2mm肿瘤病灶，可用于肿瘤的早期检测。

说明书

技术领域

本发明属于医学影像学技术领域，具体涉及IL-13修饰的含钆螯合物脂质体靶向磁共振成像对比剂及其制备方法和应用。

背景技术

目前，用于肿瘤诊断的技术主要包括计算机断层扫描(CT)、正电子发射计算机断层扫描(PET)、光学成像以及超声成像等。因磁共振成像(MRI)没有电离辐射，并可借助对比剂对深部组织进行较准确的定位、定量分析等特性，已成为临床上常用的检测和诊断手段之一。

肠癌，也称为结肠直肠癌，其发生在结肠或直肠，在美国属诊断到的第三种最为常见癌症，并属于癌症致死的第三大癌症。其危害性在于，一旦晚期肠癌发生肝转移时，部分肝切除仅有25％存活率，再发率却有75％，而这75％再发率大多数最终导致死亡，在这75％再发率中，约有50％的转移会转移到肝以外的组织。恶性肠癌转移细胞里有IL-13α2受体高度表达，并在肠癌的转移过程中粘连、迁移、进住，转移性移殖期间扮演了一个重要的角色，且导致晚期肠癌预后难以理想。

肾上腺皮质癌相对罕见,但它是一种具有侵袭性而暂无有效治疗方法的恶性肿瘤。研究结果显示肾上腺皮质癌具有IL-13α2受体高度表达，IL-13α2起到调节恶性肾上腺皮质癌肿瘤细胞进住、再生繁殖。肾上腺皮质癌IL-13α2受体高度表达是检测和化疗肾上腺皮质癌的一个新颖的靶向目标。

脑胶质瘤是一种生长在中枢神经系统的原发性恶性肿瘤，其对脑组织具有很强的侵袭性,并可细分为星形细胞瘤、少突胶质瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤和多形性胶质母细胞瘤。脑胶质瘤的常规治疗方式是手术后追加放疗或化疗，非常遗憾的是常规治疗方式之预后极差，平均生存率仅约14个月。造成如此低生存率的主要原因之一是目前我们缺乏一种灵敏的早期检测手段，常规检测手段无法检出小于2mm的病灶，当脑癌小于2mm时，常规检测手段失灵，这是由目前临床上广泛应用磁共振成像对比剂(如钆喷酸葡胺等含钆螯合物)的机制所决定的。磁共振钆喷酸葡胺仅能够检测到大于2mm以上的肿癌，其往往已属于肿瘤晚期。肿瘤晚期血脑屏障受损，钆喷酸葡胺可以通过受损的血脑屏障而进入肿瘤的生长部位并大量累积于此，使核磁共振仪能捕捉到钆喷酸葡胺所产生的信号变化。而钆喷酸葡胺的局限性在于肿瘤小于2mm时的早期病变时血脑屏障相对完整，钆喷酸葡胺受限于血脑屏障从而无法累积于肿瘤病灶部位，因而无法提供核磁共振成像所需信号变化，致使核磁共振仪无法检测到早期肿瘤及浸润性病灶。同时，常规对比剂不能与肿瘤细胞产生特异性结合，即属非标靶性对比剂，无法准确区分病灶部位与正常组织，导致病灶在手术时无法被完全切除，继而复发频生。因此，肿瘤早期的浸润性病灶诊断，尤其是小于2mm以下癌病灶部位的有效检出，对提高肿瘤治疗效果或根除肿瘤都起着关键作用。

但是常规磁共振成像(MRI)即使使用对比剂也无法检测到早期脑肿瘤。因此，开发一种可通过血脑屏障并与肿瘤组织特异性结合、能检出早期侵袭性肿瘤组织的新型对比剂具有非常重要的临床意义。

许多肿瘤在其细胞表面高度表达白细胞介素13α2受体(IL-13Rα2)，例如上述的脑胶质瘤和直肠癌转移所行成的肝癌等都具有IL-13α2高度表达。

为了提高钆(Gd)造影剂的靶向性，研究人员利用肿瘤细胞表面IL-13Rα2高度表达的特性，让肿瘤细胞表面IL-13Rα2与载有药物的配位体IL-13相结合。当肿瘤细胞上的IL-13Rα2与载有药物的配位体IL-13发生特异性结合后，脂质体所载之载体钆被递送至受体IL-13Rα2高度表达的肿瘤细胞部位，从而达到标靶的作用。

中国专利201110312974.X公开了一种基于生物素化单克隆抗体及链霉亲和素结合包载钆的空间稳定免疫脂质体两种复合物的靶向胶质瘤磁共振对比剂；所述单克隆抗体为Endoglin(CD105)，用于脑胶质瘤新生血管的检测。该对比剂使用时分两步注射，即需先给予生物素化单克隆抗体，再给予链霉亲和素结合包载钆的空间稳定免疫脂质体。

中国专利201410252588.X公开了一种由核酸适配体类似物和包载钆的脂质体构成的磁共振成像对比剂，所述核酸适配体类似物选自巯基修饰的、氨基修饰的或位点修饰的GBI-10、AS1411、A10、MUC1、sgc8、sgc3、sgd3、KH1C1、KD05、S6、AGR0100、A30和STRG2中的一种或多种，用于早期发现肿瘤细胞，其中GBI-10可用于脑胶质瘤的诊断。但是在脂质体制备过程中挤出过膜多达20次。

中国专利201010286508.4公开了一种以多肽为靶向头基，树枝状高分子材料为基础高分子载体，表面连接小分子磁共振成像对比剂，制成肿瘤靶向磁共振成像对比剂，即利用可特异性结合肿瘤细胞表面Tf受体的多肽T7肽修饰高分子材料，连接磁共振成像对比剂制成肿瘤靶向磁共振造影剂。

中国专利200910196477.0公开了一种纳米脂质体化和靶向多肽修饰的钆对比剂，达到肿瘤识别和造影剂延缓，靶向多肽修饰选自GD10多肽分子、F56多肽、K237多肽分子。所述的对比剂粒径在20～200nm，粒度分布宽。

中国专利201080026113.9公开了一种普鲁兰多糖和DTPA(二亚乙基三胺五乙酸二酐)通过酯键形成的普鲁兰多糖-DTPA接合体中钆配位结合于DTPA而形成的钆造影剂，用于肝脏MRI影像。

发明内容

为了提高检测精度，解决现有技术中的上述问题，本发明提供了一种IL-13修饰的含钆螯合物脂质体靶向磁共振成像对比剂。

本发明提供的IL-13修饰的含钆螯合物脂质体靶向磁共振成像对比剂，为包封钆螯合物的脂质体，且脂质体表面经过IL-13修饰。

白细胞介素IL-13修饰了脂质体表面，而脂质体又包封了钆螯合物。白细胞介素IL-13具有高度均质性，可与肿瘤病变部位过度表达的白细胞介素13Rα2受体特异性结合。例如，对于恶性脑肿瘤来说，每一个恶性脑肿瘤细胞约有16000～22000个IL-13Rα2受体结合位点，故该磁共振成像对比剂对高度表达白细胞介素13Rα2受体的癌细胞具有很强的亲和力。

优选地，上述IL-13修饰的含钆螯合物脂质体靶向磁共振成像对比剂中，所述钆螯合物为钆喷酸葡胺或钆特酸葡胺。

钆喷酸葡胺(Gd-DATP)，又名二乙烯三胺五醋酸钆双葡甲胺，是目前最为广泛使用的对比剂。钆特酸葡胺(Gd-DOTA)也是比较常用的钆对比剂，同样适用于本发明。

优选地，上述IL-13修饰的含钆螯合物脂质体靶向磁共振成像对比剂中，所述脂质体的制备原料包括二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)、胆固醇(CHOL)和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺交联物(DSPE-PEG-Mal)。这几种材料混合可以制成多室脂质体，可有效包封钆螯合物，并顺利穿过血脑屏障到达病灶。

优选地，上述IL-13修饰的含钆螯合物脂质体靶向磁共振成像对比剂中，二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺交联物的摩尔比为10:5:5:0.5。这一用量配比的材料制备的脂质体，包封率高、成品率高，且被用来抑制脑胶质癌疗效理想。

本发明还提供一种以上任一所述的IL-13修饰的含钆螯合物脂质体靶向磁共振成像对比剂的制备方法，步骤如下：

(1)将二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺交联物溶解于体积比1:1的甲醇氯仿混合溶剂中，40℃旋转真空减压条件下溶剂被挥发而形成薄膜，薄膜在氮气里干燥10～20min，然后被封存于4℃干燥器里14～16h；钆螯合物被加入到含有脂质体薄膜的容器里，在超声波的协助下，脂质体薄膜将钆螯合物包裹以形成含钆螯合物的多室脂质体；该多室脂质体在-80℃条件下被冻融四次，然后被氮气挤压穿过孔径200nm的聚碳酸酯膜四次，再被氮气挤压穿过孔径100nm的聚碳酸酯膜四次；

(2)将IL-13溶解于含有EDTA的磷酸盐缓冲液中，加入终浓度1.4mM的2-亚氨氢氯化硫醇水溶液，然后在4℃条件下搅拌使IL-13硫醇化；将经过硫醇化的IL-13溶液经过G25交联葡聚糖凝胶柱子进行纯化，纯化产物被浓缩到1mL，再被加入到步骤(1)所得产物里，在4℃条件下搅拌12h，得到IL-13修饰的含钆螯合物脂质体靶向磁共振成像对比剂。

IL-13蛋白质硫醇化过程产生的是硫醇化的IL-13和未被硫醇化的自由游离的IL-13的混和物，未除去自由的未硫醇化的IL-13，过G25交联葡聚糖凝胶柱是必不可少的操作。

优选地，上述IL-13修饰的含钆螯合物脂质体靶向磁共振成像对比剂的制备方法，还包括纯化步骤(3)：步骤(2)获得的IL-13修饰的含钆螯合物脂质体靶向磁共振成像对比剂先过琼脂糖CL-2B柱子以除去未结合的硫醇化的IL-13，然后在4℃磷酸盐缓冲液中透析以交换溶剂；透析4h后换一次磷酸盐缓冲液，总透析时间为16～20h；然后，在4℃条件下离心浓缩，即得纯化的IL-13修饰的含钆螯合物脂质体靶向磁共振成像对比剂。

本发明上述的IL-13修饰的含钆螯合物脂质体靶向磁共振成像对比剂在检测肿瘤中的应用，所述肿瘤的IL-13α2表达量高于健康人正常值(例如脑胶质瘤，恶性肠癌转移，肾上腺皮质癌)。

优选地，所述肿瘤为脑胶质瘤、肠癌和/或肾上腺皮质癌。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1.IL-13修饰的含钆螯合物脂质体靶向磁共振成像对比剂可以协助对比剂穿过血脑屏障；

2.IL-13修饰的含钆螯合物脂质体靶向磁共振成像对比剂可将包载的磁共振影像对比剂传递到肿瘤病变部位并与癌细胞产生特异性结合，具备靶向性；

3.IL-13修饰的含钆螯合物脂质体靶向磁共振成像对比剂可以检测到小于2mm肿瘤病灶，可用于肿瘤的早期检测。

附图说明

图1为IL-13-Liposomes-Gd-DTPA扫描电镜照片。

图2为裸鼠静脉注射IL-13-Liposomes-Gd-DTPA MRI检测效果。

图3为裸鼠静脉注射Gd-DTPA MRI检测效果。

图4为裸鼠静脉注射IL-13-Liposomes-Gd-DTPA脑部切片MRI检测效果。

图5为裸鼠静脉注射Gd-DTPA脑部切片MRI检测效果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1 IL-13-liposomes-Gd-DTPA的制备。

将二棕榈酰磷脂酰胆碱80mg、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇13mg、胆固醇20mg和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺交联物10mg(摩尔比为10:5:5:0.5)溶解于40mL甲醇氯仿(二者体积比为1:1)混合溶剂中，40℃旋转真空减压条件下溶剂被挥发而形成薄膜，薄膜在氮气里干燥10～20min，然后被封存于4℃干燥器里14～16h。钆喷酸葡胺被加入到含有脂质体薄膜的容器里，在超声波的协助下，脂质体薄膜将磁共振成像对比剂包裹以形成含磁共振成像对比剂的多室脂质体。该脂质体在-80℃条件下被冻融四次，然后被氮气挤压穿过孔径200nm的聚碳酸酯膜四次，再被氮气挤压穿过孔径100nm的聚碳酸酯膜四次。

将IL-13蛋白质2mg溶解于6mL含有0.67mM乙二胺四乙酸二钠(EDTA)的磷酸盐缓冲液中，再加入最终浓度为1.4mM的2-亚氨氢氯化硫醇水溶液，然后在4℃条件下搅拌30min，使IL-13蛋白质硫醇化。硫醇化后的IL-13蛋白质通过G-25交联葡聚糖凝胶柱以分离自由游离的IL-13，得到纯硫醇化的IL-13，纯硫醇化的IL-13洗脱液浓缩至1mL。将硫醇化IL-13加入到含有钆喷酸葡胺的脂质体里，在4℃条件下搅拌12h，得到IL-13修饰的脂质体对比剂。

所制备的IL-13修饰的脂质体对比剂先过琼脂糖CL-2B柱子以除去未结合的硫醇化的IL-13，然后在4℃磷酸盐缓冲液中透析以交换溶剂。透析4h后换一次磷酸盐缓冲液，总透析时间为16～20h。然后，在4℃离心浓缩至8.0mL，即得，命名为IL-13-liposomes-Gd-DTPA。

所制备的IL-13-liposomes-Gd-DTPA呈球形，大小尺寸为80～140nm，平均尺寸为131nm，脂质体多分散性指数(PDI)为0.1～0.2nm，见图1。

实施例2 IL-13-liposomes-Gd-DTPA可穿过血脑屏障

为证明的IL-13修饰的含钆螯合物脂质体靶向磁共振成像对比剂IL-13-liposomes-Gd-DTPA可穿过血脑屏障，我们选用正常的、无脑癌的裸鼠为模型进行实验。结果显示，无脑癌的裸鼠注射给予马根维显对比剂(Magnevist)Gd-DTPA 30min后，裸鼠脑垂体信号噪声比(信噪比)提高了25％，相反，脑实质信噪比却保持不变。表明马根维显对比剂无法穿过活裸鼠的血脑屏障以到达脑实质区域。相比之下，无脑癌的裸鼠注射给予IL-13-liposomes-Gd-DTPA 30min后，不但裸鼠脑垂体部位的信噪比增加了20％，与此同时，脑实质信噪比也增加了15％。这是由于IL-13-liposomes-Gd-DTPA可穿过活体无胸腺裸鼠血脑屏障，并渗透到大脑实质区域。证明脂质体作为药物载体可以协助对比剂穿越完整的血脑屏障到达脑实质脑组织。

实施例3 IL-13-liposomes-Gd-DTPA的靶向性

用异硫氰酸荧光素氰基标记IL-13修饰的脂质体磁共振对比剂(FITC-IL-13-liposomes-Gd-DTPA)与不含IL-13脂质体造影剂(FITC-liposomes-Gd-DTPA)，以便在神经胶质瘤U251和GSC T3691细胞胞浆中观察细胞吸收对比剂的效果，我们做了细胞吸收实验。生物细胞组织学结果表明，在胶质癌干细胞GSC T3691胞浆中观察到细胞吸收了更多的IL-13修饰的FITC-IL-13-liposomes-Gd-DTPA。其提示IL-13与GSC T3691细胞中的IL-13Rα2受体具有高度的亲和性，可最大程度地促进特定肿瘤细胞对IL-13-liposomes-Gd-DTPA的吸收。

实施例4 IL-13-lipsomes-Gd-DTPA检测肿瘤细胞的效果

为证明IL-13修饰的IL-13-liposomes-Gd-DTPA可检测到幼小脑胶质瘤，为此进行相关实验研究，正常裸鼠被接种脑胶质瘤U251细胞，四周后，裸鼠脑内生长出成熟的和早期的脑胶质瘤，以此作为脑内胶质瘤动物模型。给予含有脑内胶质瘤裸鼠注射马根维显对比剂(Magnevist)Gd-DTPA，通过加权7T核磁共振仪获取图像，见图3。24h后给予同一只裸鼠注射IL-13-liposomes-Gd-DTPA，通过加权7T核磁共振仪获取图像，见图2。结果显示，IL-13-liposomes-Gd-DTPA可以检测到裸鼠成熟期病灶以外，微小病灶的浸润性胶质瘤也可被显示出来，而马根维显对比剂则仅显示了大脑部位成熟的肿瘤，因为此时血脑屏障已遭破坏，故磁共振对比剂可以进入脑组织以显示被病变破坏的脑组织而不是肿瘤细胞组织本身。

为了进一步确定检测结果，对静脉注射Gd-DTPA(Magnevist)和IL-13-liposomes-Gd-DTPA后的裸鼠进行脑部更深层次切片检测。深层次切片结果显示，静脉注射Gd-DTPA后，裸鼠微小病灶无法显示，见图5；静脉注射IL-13-liposomes-Gd-DTPA的裸鼠同一大脑部位浸润性幼小脑癌被清晰显示，见图4。因此，高灵敏度的IL-13-liposomes-Gd-DTPA对比剂用于肿瘤的早期检测、早期治疗至关重要。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。