基于双环发夹探针以及酶介导的级联扩增策略检测博来霉素的方法

摘要

本发明公开了一种基于双环发夹探针以及酶介导的级联扩增策略检测博来霉素的试剂盒及其检测方法。通过双环发夹探针能够有效沉默触发序列，抑制非特异性杂交进而降低检测方法的背景信号；酶介导的级联扩增反应能够实现对检测信号的多重放大，从而提高检测方法的灵敏度，实现了对博来霉素的高灵敏检测，线性范围40pM‑10nM，检测限为35pM。灵敏度较之前建立的免标记荧光检测方法提高了近两个数量级，能够满足临床样品检测的需求。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于双环发夹探针以及酶介导的级联扩增策略检测博来霉素的方法。

背景技术

博来霉素是临床常用的一种抗癌药物，其治疗药物浓度监测，对于指导临床合理用药、提高抗癌疗效及降低毒副作用具有重要意义。较早建立的博来霉素检测方法包括微生物分析法、RIA、HPLC和酶免疫分析法等。其中应用较多的方法为RIA以及HPLC。然而上述两种方法都有其自身的缺陷，比如HPLC灵敏度低且操作复杂，RIA放射性同位素危害人体健康。因此，迫切需要探索一种新的、灵敏且特异的检测方法，以实现博来霉素的简单、快速检测。

根据文献报道，博来霉素抗肿瘤作用可能源于其对核酸链的破坏作用。在有氧条件下，博来霉素与亚铁离子形成复合物，选择性绑定并氧化断裂核酸链。根据博来霉素裂解DNA分子的这一性质，研究者建立了简单且灵敏的博来霉素检测方法，比如电化学分析法、电致化学发光法以及荧光法等。其中，荧光分析方法具有简单、快速、样品用量少、灵敏度高以及重现性好的优势。Li课题组利用石墨烯吸附DNA单链并淬灭荧光团的性质建立了一种荧光传感策略，检测限为0.2nM。Kong课题组利用金纳米颗粒淬灭二氧化硅-石墨烯量子点的性质构建了一种新的探针，用于检测博来霉素，检测限为0.2nM。然而，上述方法所使用的DNA识别探针只能将一次裂解事件转化为一次信号输出事件，从而在一定程度上限制了方法灵敏度的提高。为了解决这个问题，Ju课题组构建了一个带有触发序列的DNA识别探针，并利用外切酶III循环消解双标探针的性质，建立了一种高灵敏的荧光检测方法，检测限为0.38pM，灵敏度较之前的检测方法有了显著的提高。然而，该方法需要对DNA分子进行基团标记。DNA标记工作具有一定的缺陷，例如操作复杂费时，检测成本高，荧光探针不完全淬灭产生较高的背景信号，从而限制了这类荧光分析方法的应用。

在先前的研究工作中，我们建立了一种双环发夹探针介导的信号扩增策略，实现了博来霉素的免标记检测。在该方法中，双环发夹探针能够选择性识别博来霉素，释放DNA触发链，然后借助聚合切刻链置换扩增反应对检测信号进行放大，从而实现灵敏检测博来霉素。线性范围2nM-220nM，检测限0.34nM。然而据文献报道，静脉注射给药方式下，博来霉素血药浓度24h内变化范围为1.4nM-2.7μM，该方法仍然不能满足临床样品监测对方法灵敏度的要求。

因此，亟需开发一种灵敏度高且免标记的博来霉素检测方法及其试剂盒，以适应临床样品监测的要求。

发明内容

针对上述现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种基于双环发夹探针以及酶介导的级联扩增策略检测博来霉素的方法，该方法在双环发夹探针选择性识别博来霉素的基础上，利用酶介导的级联扩增策略，实现高灵敏且免标记检测博来霉素。本发明的检测方法的线性范围40pM-10nM，检测限为35pM。灵敏度较之前建立的免标记荧光检测方法提高了近两个数量级，能够满足临床样品检测的需求。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

本发明的第一方面，提供一种基于双环发夹探针以及酶介导的级联扩增策略检测博来霉素的试剂盒，包含：

双环发夹探针，所述双环发夹探针用于博来霉素特异性识别，并释放DNA触发序列；

模板链HP₁，所述模板链HP₁的粘性末端能够与所述DNA触发序列结合，并在聚合酶的作用下发生链延伸，打开模板链HP₁并形成一个切刻内切酶的识别位点，在切刻酶和聚合酶的作用下，进行链置换反应，实现第一步扩增，产生DNA产物I；

模板链HP₂，所述模板链HP₂能够与DNA产物I结合，发生聚合、切刻以及链置换反应，扩增产物与DNA产物I具有相同的碱基序列，扩增产物作为新的引物链与模板链HP₂结合，触发新的聚合、切刻以及链置换反应，实现指数增长；

模板链HP₃，所述模板链HP₃的粘性末端能够与DNA产物I结合，发生聚合、切刻以及链置换的反应，最终产生大量的G-四链体序列，实现第三步扩增反应。

所述双环发夹探针的结构和序列记载在本发明人的在先申请(CN105385770A)中，所述双环发夹探针包括：两个环部、识别位点和触发位点，所述两个环部为：具有一个DNA臂的末端环和具有两个DNA臂的颈凸环，所述识别位点位于双环发夹的颈部，所述触发序列用于触发后续扩增放大反应，所述触发序列中的碱基参与构成双环发夹探针的DNA臂和颈凸环。所述双环发夹探针的序列为TCC TTC CCT CTC AAA ACC TCG CAC CAA AAG GTG CGAGGAAGAAGAGAG>

所述模板链HP₁的核苷酸序列为以下之一：

(1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或

(2)与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列具有90％以上同源性且功能相同的核苷酸序列。

优选的，所述模板链HP₁的核苷酸序列如SEQ>

GGA CGA TTG GCA CGA AAA GAT CCA ATC GTC CTT CCC TCT CTT CTT CCT C(SEQ ID NO.1)；

所述模板链HP₂的核苷酸序列为以下之一：

(1)SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；或

(2)与SEQ ID No.2所示的核苷酸序列具有90％以上同源性且功能相同的核苷酸序列。

优选的，所述模板链HP₂的核苷酸序列如SEQ>

GGA CGA TTG GCA CGG CGG TCA GAT CCT GGA CGA TTG GCA CGA ATC TGACCG CCG TGC CAA TCG TCC AAA AAA AA(SEQ ID NO.2)；

所述模板链HP₃的核苷酸序列为以下之一：

(1)SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；或

(2)与SEQ ID No.3所示的核苷酸序列具有90％以上同源性且功能相同的核苷酸序列。

优选的，所述模板链HP₃的核苷酸序列如SEQ>

CCC AAC CCG CCC TAC CCT GGT AAG ATC CAG GGT AGG GCG GGT TGG GAAGGA CGA TTG GCA CGA AAA AAA(SEQ ID NO.3)；

进一步的，上述试剂盒中还包含：切刻酶、聚合酶和NMM。

优选的，所述切刻酶为Nt.AlwI；所述聚合酶为KF聚合酶。

上述试剂盒在检测博来霉素中的应用也是本发明的保护范围。

本发明的第二方面，提供一种利用上述试剂盒检测博来霉素的方法，当目标物博来霉素存在时，博来霉素能够切割双环发夹探针，并释放DNA触发序列，触发酶介导的级联扩增反应；所述酶介导的级联扩增反应按第一步聚合切刻链置换扩增、第二步指数扩增以及第三步聚合切刻链置换扩增的顺序依次触发，产生大量的G-四链体序列；游离状态的G-四链体序列与核酸染料NMM结合，产生>20倍增强的荧光信号，通过检测到的荧光信号对博来霉素进行定量检测。

所述酶介导的级联扩增反应中，第一步聚合切刻链置换扩增的具体步骤为：

DNA触发序列与模板HP₁的粘性末端结合，并在聚合酶的作用下发生链延伸，形成切刻内切酶的识别位点，然后在聚合酶和切刻酶的作用下，发生链置换扩增反应，实现第一步扩增，产生DNA产物I；

所述酶介导的级联扩增反应中，第二步指数扩增的具体步骤为：

DNA产物I与模板链HP₂结合，发生聚合、切刻以及链置换反应，扩增产生的产物同DNA产物I具有相同的碱基序列，进而其产物可以作为新的引物链与模板链HP₂结合，触发新的聚合、切刻以及链置换扩增反应。如此，一条DNA产物I经过第二步扩增实现了一变二、二变四的指数增长。

所述酶介导的级联扩增反应中，第三步聚合切刻链置换扩增的具体步骤为：

DNA产物I同模板链HP₃的粘性末端结合，发生聚合、切刻以及链置换的反应，最终产生大量的G-四链体序列，实现第三步扩增反应(Strand>

在本发明的一个具体实施方式中，博来霉素切割双环发夹探针的具体步骤为：

将博来霉素和新鲜配置的氯化亚铁溶液等按照1:1混合，活化。取活化的博来霉素和上述退火以后的双环发夹探针充分混合，37℃恒温箱中孵育30min，使得博来霉素充分裂解双环发夹探针。

在本发明的一个具体实施方式中，所述酶介导的级联扩增反应的具体步骤为：

向博来霉素充分裂解双环发夹探针后的反应液中加入1μL 10mM dNTPs，1.2μL模板链HP₁，0.6μL模板链HP₂，2μL>2,50mM>3，继续反应20min。

上述方法中，荧光信号检测的光谱条件为：最大激发波长399nm，发射波长扫描范围550-680nm，激发和发射的狭缝宽度分别为10nm和10nm，实时电压700V。

上述方法，通过构建的荧光强度与博来霉素浓度之间的线性方程来对博来霉素进行定量检测，所述线性方程为F-F₀＝7041.32+671.81log(C)；F和F₀分别为博来霉素存在和不存在条件下的荧光强度值，C为博来霉素的浓度。

上述线性方程的线性范围为40pM-10nM。

本发明的基于双环发夹探针以及酶介导的级联扩增策略检测博来霉素的原理为：

本发明基于双环发夹探针以及酶介导的级联扩增策略构建了一种高灵敏且免标记的荧光传感平台。具体实验原理如图1所示：首先，博来霉素切割双环发夹探针，产生一个带有颈凸环的双螺旋产物。由于颈凸环的存在，双螺旋产物处于亚稳定状态。随后，双螺旋发生解旋并释放DNA触发序列，触发酶介导的级联扩增反应。扩增反应的具体步骤如下：首先触发链与模板HP₁的粘性末端结合，并在聚合酶的作用下发生链延伸，打开HP₁并形成一个切刻内切酶的识别位点；切刻酶在识别位点处切刻DNA链，形成一个KF聚合酶可以识别的缺口；然后聚合酶在缺口处继续进行链延伸，并将先前延伸过程产生的DNA链置换下来，如此，聚合、切刻以及链置换过程不断循环实现第一步扩增(Strand>2结合，发生第二步扩增(Exponential>2结合，发生聚合、切刻以及链置换反应。同第一步扩增不同的是，该扩增产生的产物同DNA产物I具有相同的碱基序列，进而其产物可以作为新的引物链与模板链HP₂结合，触发新的聚合、切刻以及链置换扩增反应。如此，一条DNA产物I经过第二步扩增实现了一变二、二变四的指数增长。然后，DNA产物I同模板链HP₃的粘性末端结合，发生聚合、切刻以及链置换的反应，最终产生大量的G-四链体序列，实现第三步扩增反应(Strand>

本发明的有益效果：

(1)本发明通过双环发夹探针能够有效沉默触发序列，抑制非特异性杂交进而降低检测方法的背景信号；酶介导的级联扩增反应能够实现对检测信号的多重放大，从而提高检测方法的灵敏度，实现了对博来霉素的高灵敏检测，线性范围40pM-10nM，检测限为35pM。灵敏度较之前建立的免标记荧光检测方法提高了近两个数量级，能够满足临床样品检测的需求。

(2)本发明的检测方法具有免标记的优势，从而降低了检测成本，并避免了复杂繁琐的DNA链标记等操作。此外，对博来霉素、柔红霉素、放线菌素以及丝裂霉素四种抗癌药物的选择性实验表明，该方法只对博来霉素有较强的荧光响应，具有良好的选择性。此外，人血清回收率实验表明，该方法在博来霉素药物分析以及临床应用中具有较大的应用潜力。

附图说明

图1：酶介导的级联扩增策略用于免标记且高灵敏检测博来霉素原理图；

图2：荧光光谱验证级联扩增反应；a-f曲线分别代表SDA2阴性，EXPAR+SDA2阴性，SDA1+EXPAR+SDA2阴性，SDA2阳性，EXPAR+SDA2阳性，SDA1+EXPAR+SDA2阳性，反应条件：Primer₁/Primer₂:1.0×10^-8mol/L；HP₁:1.0×10^-8mol/L；HP₂:2.0×10^-8mol/L；HP₃:2.0×10^-7mol/L；KF:1U；Nt.AlwI:4U；NMM:2.0×10^-6mol/L；

图3：整体实验荧光光谱；反应条件：C_BLM＝1.0×10-⁸mol/L；C_BHP＝1.0×10-⁸mol/L；C_HP1＝1.0×10^-8mol/L；C_HP2＝5.0×10^-8mol/L；C_HP3＝2.5×10^-7mol/L；C_NMM＝2.0×10^-6mol/L；KFpolymerase＝1U；Nt.AlwI＝4U；Reaction>

图4A：不同博来霉素浓度下的荧光光谱曲线；a-h曲线对应的博来霉素浓度分别为0mol/L；4.0×10^-11mol/L；5.0×10^-11mol/L；1.0×10^-10mol/L；4.0×10^-10mol/L；1.0×10^-9mol/L；5.0×10^-9mol/L；1.0×10^-8mol/L；

图4B：博来霉素浓度同荧光强度之间的线性关系；

图5：基于双环发夹探针以及酶介导的级联扩增策略检测博来霉素的选择性考察结果。

具体实施方式

结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

实验试剂和仪器：

本发明实施例中所用到的实验试剂和仪器如下：

所有寡核苷酸序列均是由Sangon Biotechnology Co.,Ltd.(上海，中国)合成和纯化，纯化方法为HPLC。博来霉素、丝裂霉素以及柔红霉素购自中国食品药品检定研究院。放线菌素D购自Melone Pharmaceutical Co.,Ltd.(大连，中国)。氯化亚铁(FeCl₂^●H₂O)购自天津光复精细化工研究所。Klenow>2PO₄^●2H₂O(分析纯，天津市广成化学试剂厂，天津)；Na₂HPO₄^●12H₂O(分析纯，天津市广成化学试剂厂，天津)；临床血清样品取自山东大学附属医院。所有其他的化学试剂均为分析纯。实验中所用水溶液均用超纯水配置(电阻率>18.25MΩ^●cm)。

15mM磷酸盐缓冲液：13.4mM Na₂HPO₄,1.6mM>2PO₄和50mM>

荧光光谱是利用荧光仪Hitachi F-2500(Japan)在室温条件下扫描获得。激发波长399nM，扫描范围550nM-680nM。激发和发射狭缝宽度均为10nM。实时电压700V。

实施例1：双环发夹探针以及酶介导的级联扩增策略检测博来霉素

具体方法如下：

(1)博来霉素切割双环发夹探针

将双环发夹探针用15mM PBS稀释，置于金属浴中95℃变性5min，然后缓慢降温至约25℃，取出，离心，备用。将博来霉素和新鲜配置的氯化亚铁溶液等按照1:1混合，活化。取活化的博来霉素和上述退火以后的双环发夹探针充分混合，37℃恒温箱中孵育30min，使得博来霉素充分裂解双环发夹探针。

(2)酶介导的级联扩增反应

上述反应完成以后，加入1μL 10mM dNTPs，1.2μL模板链HP₁，0.6μL模板链HP₂，2μL>2,50mM>3，继续反应20min。

(3)荧光测量

向上述反应所得溶液中加入1.2μL NMM，4.8μL氯化钾以及4μL 1×NEBuffer 2，混合均匀，置于37℃恒温培养箱中孵育30min后，进行荧光光谱扫描。荧光光谱扫描参数：最大激发波长399nm，发射波长扫描范围550-680nm，激发和发射的狭缝宽度分别为10nm和10nm，实时电压700V。构建荧光强度与博来霉素浓度之间的线性方程，对待测样品，可通过测定样品的荧光强度，代入线性方程，计算待测样品的博来霉素浓度。

实施例2：本发明的检测方法的可行性研究

为了验证本发明的检测方法的可行性和扩增能力，考察了不同情况下反应体系的荧光发射光谱。结果如图2所示，a、b和c曲线分别代表SDA2、EXPAR+SDA2以及SDA1+EXPAR+SDA2三次反应的空白试验，可以看到所得荧光信号强度依次增加，说明随着扩增反应数目的增多，扩增体系的背景信号越高，但荧光信号均不超过250a.u.。d、e和f曲线分别代表上述三种扩增反应的阳性实验，d曲线较a曲线荧光强度实现了一定程度的增长，说明实验发生了聚合切刻链置换扩增(SDA2)；e曲线较d曲线荧光强度实现了约1400a.u.的增长，说明实验在SDA2扩增的基础上进一步发生EXPAR反应，且扩增效果明显；f曲线较e曲线有一定程度上的增长，f曲线较c曲线实现了约10倍的增长，说明实验在发生了级联扩增，产生了大量的G-四链体序列。

本发明还进行了整体实验的荧光光谱扫描，结果如图3所示，阴、阳性具有显著差异。

以上实验结果说明，本发明构建的酶介导的级联扩增策略具有可行性。

实施例3：检测条件的优化

本发明选择对检测性能影响比较大的参数条件进行了优化，包括模板链的浓度和酶介导的级联扩增反应各个阶段的反应时间等，进行了优化考察。结果表明：

模板链HP₂最佳浓度为20nM；模板链HP₃最佳浓度为200nM；阶段一(SDA1+EXPAR)和阶段二(SDA2)最佳反应时间分别为30min和20min。

实施例4：本发明的检测方法的灵敏度考察

图4A为不同浓度下博来霉素浓度的荧光光谱。随着博来霉素浓度的增加，检测体系的荧光强度值逐渐增强。这是由于博来霉素浓度增加，切割产生的触发序列增多，通过酶介导的级联扩增反应，产生的G-四链体序列越多。实验结果说明，该检测体系对博来霉素浓度具有良好的荧光响应。图4B为博来霉素浓度同荧光强度之间的线性关系。线性范围40pM-10nM，相关系数为0.9976。根据3倍的空白试验标准偏差计算，得检测方法的检测限为35pM。该方法的灵敏度优于传统的检测方法以及其他的荧光检测方法，且具有较宽的线性范围。该方法能够满足临床样品监测对灵敏度的要求。

实施例5：本发明的检测方法的选择性考察

选择性是评价检测方法的重要指标，本发明选取博来霉素、丝裂霉素、柔红霉素以及放线菌素D分别作为目标物进行考察。结果如图5所示，在相同的实验条件下，检测体系只对博来霉素表现出较强的响应信号，表明该检测方法具有较好的特异性。

实施例6：回收率考察

为了考察本方法的实际应用能力，我们进行了人血清回收率实验。实验结果在95％-100％之间，说明该方法在人血清检测体系中具有良好的准确性，具有潜在的临床应用能力。

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