早期筛选中间球海胆良种的SNP引物及筛选方法

摘要

本发明公开一种早期筛选中间球海胆良种的SNP引物及筛选方法，是选用了日本自繁的中间球海胆二代雄性个体(♂)和在中国旅顺龙王塘繁育五代以上的雌性个体(♀)为父母本杂交繁育F1代，构建包含194个F1代个体和2个亲本的作图群体，于同一环境中养殖，经过提取DNA、测序等技术手段，首次发现了中间球海胆的遗传标记并设计出相关引物，可用于早期筛选中间球海胆良种。与现有技术相比，不但可节省人力物力、降低选种成本，而且可确保亲本遗传基因优良，从而保证子代性状良好。

说明书

技术领域

本发明涉及一种中间球海胆良种筛选引物及方法，尤其是一种可节省人力物力、降低选种成本、确保子代性状良好的早期筛选中间球海胆良种的SNP引物及筛选方法。

背景技术

目前，对于中间球海胆的育种大多采用杂交育种、选择育种等传统的育种方法，无论是杂交育种还是选择育种，均是以生长性状良好的海胆为标准选择亲本。这样就需要在海胆成长过程中，定期（如每个月等）测量海胆的壳高、壳径和活体重等指标，以此进行逐级筛选，不仅耗费大量的人力物力，而且还会存在所选亲本遗传基因并不优良的问题，导致优良基因型的子代苗种产出量低下。

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种可节省人力物力、降低选种成本、确保子代性状良好的早期筛选中间球海胆良种的SNP引物及筛选方法。

本发明的技术解决方案是：一种早期筛选中间球海胆良种的SNP引物，其特征在于所述SNP引物DNA序列如下：

上游引物：5'- CAGGTATCCTAAAGCAAT-3'；

下游引物：5'- GTTTGTTGGTAAGCACTG -3'。

一种以上述SNP引物早期筛选中间球海胆良种的方法，其特征在于按照如下步骤进行：

a. DNA模板制备：

取中间球海胆幼苗管足，提取基因组DNA；

b. PCR扩增目标基因：

用所得到的DNA为模板，以所述上游引物和下游引物进行PCR反应；

c.对 PCR产物基因分型：

用HRM 96仪器对所得到的PCR产物进行基因分型，筛选出含有如下DNA序列杂合基因型的中间球海胆幼苗：

5'-CAGGTATCCTAAAGCAATTGTTCGTCCAGTGCTTACCAACAAAC-3'

CAGGTATCCTAAAGCAATTGTTCGTCCAGCGCTTACCAACAAAC

本发明是选用了日本自繁的中间球海胆二代雄性个体(♂)和在中国旅顺龙王塘繁育五代以上的雌性个体(♀)为父母本杂交繁育F1代，构建包含194个F1代个体和2个亲本的作图群体于同一环境中养殖，经过提取DNA、测序等技术手段，首次发现了中间球海胆的遗传标记并设计出相关引物，可用于早期筛选中间球海胆良种。与现有技术相比，不但可节省人力物力、降低选种成本，而且可确保亲本遗传基因优良，从而保证子代性状良好。

附图说明

图1是本发明实施例 PCR产物的4%琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

一．生长性状相关的SNP标记筛选过程：

1．高密度遗传连锁图谱构建

1.1 作图群体构建

采用拟侧交策略，选用日本自繁的中间球海胆二代雄性个体(♂)和在中国旅顺龙王塘繁育五代以上的雌性个体(♀)为父母本杂交繁育F1代，构建包含194个F1代个体和2个亲本的作图群体于同一环境中养殖。

1.2 酶切方案确定

选择紫球海胆基因组为参考基因组序列进行电子酶切预测，最终确定使用RsaI+HaeIII酶进行酶切，酶切片段长度在414-464bp。

1.3 SLAF标签开发及筛选

以海洋动物基因组DNA提取试剂盒提取组织DNA，SLAF-seq技术对作图群体进行简化基因组测序，将测序产生的双端Reads通过Blat软件进行序列比对，按照序列相似度大于90%进行聚类，聚类在一起的序列定义为1个SLAF标签；将含有2-4条tag的SLAF标签定义为多态性SLAF标签。为保证遗传图谱质量，对SLAF标签进行过滤，最终确定上图标记150个个体，得到可用于作图的SLAF标签4678个，通过计算两两标签间重组率和MLOD值，根据MLOD值将标签分为21个连锁群，最终确定上图标记共4387个。

1.4 遗传图谱构建

以连锁群为单位，采用HighMap软件分析连锁群内Marker的线性排列，估算Marker间的遗传距离，最终得到总图距为1907.21cM的遗传图谱，平均图距0.44cM，上图标签完整度99.75%。

2．QTL定位

2.1 生长性状的表型值测量和分析

数显电子游标卡尺（精度为0.01mm）测量最终上图的150个个体的壳高（TH）、壳径（TD）；电子天平（精度为0.01g）测量活体重（BW）。利用SPSS 16.0软件对表型数据进行正态分布检验。

2.2 生长性状的QTL定位

利用中间球海胆21个连锁群的图谱和生长性状表型值进行性状关联分析。通过Permutation检验（1000次）确定每个性状的95%置信区间的显著性水平阈值（LOD）；采用RQTL软件的复合区间作图（CIM）算法和MapQTL软件的区间作图（IM）算法进行壳高、壳径、活体重3个生长性状定位，共定位到97个SLAF标签。

3．多态性SNP标记的筛选、引物设计和分型

将97个SLAF标签序列与紫球海胆基因组比对，相似度设定阈值为0.9，获得具有基因注释的15个SLAF标签，其中找到能够设计小片段引物的SNP位点8个。利用Primer Premier5.0软件在SNP位点附近设计小片段引物（使Tm值控制在50℃～60℃之间，PCR产物长度为40～120bp，引物只包含一个SNP位点，并且不包含任何插入缺失）进行梯度PCR扩增，4%的琼脂糖凝胶电泳（150V，200mA，20min）检测所有引物，确定最佳退火温度。经HRM检测目的片段的熔解曲线是单一无杂峰，并且分布在高低温内标峰之间的引物用于基因分型。

利用Light Scanner 96分析仪对筛选过的小片段引物在作图群体中（随机挑选的50个个体）进行基因分型，获得3个与中间球海胆生长性状相关的候选SNP标记。

4．中间球海胆生长性状相关SNP标记的验证

选择中间球海胆F5代生长性状差异明显的3个家系（15月龄），每个家系随机取30个个体，提取管足DNA，按照2.1 方法测量待检家系的生长性状，按照上述第3步骤的方法对上述获得的3个SNP标记在家系的90个个体中进行基因分型，通过壳高、壳径、活体重性状与SNP基因型的显著性检验（P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著），SNP-29标记在壳高、壳径、活体重性状上，杂合基因型均极显著大于纯合基因型（P＜0.01），见表1，即杂合基因型为优势基因型。

SNP-29的具体信息如下：

早期筛选中间球海胆良种的SNP引物DNA序列如下：

上游引物：5'- CAGGTATCCTAAAGCAAT-3'；

下游引物：5'- GTTTGTTGGTAAGCACTG -3'。

所属的连锁群编号：LG20；

所属SLAF标签名称：19255；

SNP类型：T/C；

产物长度：44bp；

DNA序列如下：

5'-CAGGTATCCTAAAGCAATTGTTCGTCCAGTGCTTACCAACAAAC-3'

CAGGTATCCTAAAGCAATTGTTCGTCCAGCGCTTACCAACAAAC

*

*表示碱基变异点即SNP位点。

SNP-29位点基因型与性状间的相关检验如表1：

表1 SNP-29位点基因型与性状间的相关检验

注：同一SNP位点的不同基因型与不同性状之间的相关性分析。同一SNP位点的同一行右标大写字母不同表示基因型之间差异极显著（P＜0.01），贡献率（P）=>_t>/>_T>×100%。下同。

二.以SNP-29标记引物早期筛选中间球海胆良种

1．亲本的选择及培育

选择3个家系中生长性状最好的2个家系进行群体繁育，经过中间球海胆生长性状相关SNP标记的验证实验，筛选2个家系中含有SNP-29标记的杂合基因型个体作为育种亲本，得到这2个家系的亲本数分别为16个和14个个体，以避免近亲繁殖为目的，对这2个家系的雌雄进行交叉繁育，子一代编号为A组；从实验室培养的相同两个家系中各随机选取16个和14个个体，未经过SNP-29标记的基因型检测，按雌雄进行交叉繁育，子一代编号为对照组B。放在同一养殖环境中培养至性成熟。

2．人工育苗及生长性状表型值测量

繁殖方法采用中间球海胆健康养殖技术。根据海胆壳径大小适时调整养殖密度，待海胆长到10月龄时从A、B两组中各随机挑选300只海胆测量壳高、壳径、活体重性状。

3. 生长性状相关SNP-29标记的检测及评估

对A、B两组子代按照如下步骤进行筛选，并进行基因分型，结果如表2

a. DNA模板制备：

取中间球海胆幼苗管足，提取基因组DNA；

b. PCR扩增目标基因：

用所得到的DNA为模板，以所述上游引物和下游引物进行PCR反应；

将所得到的PCR产物进行4%琼脂糖凝胶电泳，得到44bp的显示条带，结果如图1；

c.对 PCR产物基因分型：

用HRM 96仪器对所得到的PCR产物进行基因分型，筛选出含有如下DNA序列杂合基因型的中间球海胆幼苗：

5'- CAGGTATCCTAAAGCAATTGTTCGTCCAGTGCTTACCAACAAAC-3'

CAGGTATCCTAAAGCAATTGTTCGTCCAGCGCTTACCAACAAAC

表2 经过SNP-29标记指导的子一代与对照组子一代的差异检验

结果表明：

经过SNP-29标记引物筛选的亲本子一代A组性状值显著大于对照组B，且A组含有SNP-29标记杂合基因型的个体数亦大于对照组B，说明SNP-29标记在子一代A组中聚合效果更佳，进一步证明与生长性状相关的SNP-29标记适用于中间球海胆早期选种。

序列表

<110> 大连海洋大学

<120>早期筛选中间球海胆良种的SNP引物及筛选方法

<160> 4

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400> 1

CAGGTATCCTAAAGCAAT 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400> 2

GTTTGTTGGTAAGCACTG 18

<210> 3

<211> 44

<212> DNA

<213> 中间球海胆

<400> 3

CAGGTATCCTAAAGCAATTGTTCGTCCAGTGCTTACCAACAAAC44

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> 中间球海胆

<400> 4

CAGGTATCCTAAAGCAATTGTTCGTCCAGCGCTTACCAACAAAC44。

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