一种樟芝偶联固态发酵方法及其制备的樟芝发酵谷物粉

摘要

根据本发明提供的樟芝偶联固态发酵方法，由于将樟芝液态发酵与固态发酵偶联起来，利用液态发酵后离心废弃的上清液进行固态发酵，代替原本固态发酵时浸泡谷物培养基中所用的自来水，一方面上清液中含有利于菌体生长的营养成分，加快了固态发酵过程中菌体生长速度，有利于实现大规模工业化应用；另一方面，该方法节约了生产发酵用水，减少了液态发酵培养基的排放，进而减轻了环境压力，是一种绿色生产技术；根据本发明的偶联固态发酵方法所得到的樟芝谷物粉，和非偶联的固态发酵方法所得到的樟芝谷物粉相比，其中的安卓奎诺尔以及安卓奎诺尔B的含量存在显著提高。

说明书

技术领域

本发明公开了一种樟芝偶联固态发酵方法粉，属于微生物发酵技术领域。

背景技术

樟芝菌，又名牛樟芝，是我国台湾特有的珍稀食用和药用真菌，其子实体寄生于牛樟树树干腐朽的內壁，或倒伏在地上靠近土表的无树皮表面，具有强烈的牛樟树香气，可产三萜、多糖、甾醇、苯环类化合物等多种活性成分。樟芝子实体极难培育，且产量极低，很难满足目前市场需求，因此许多学者开发了人工培养方式。樟芝人工培养物具有保肝、抗癌、调节免疫力、抗炎症等药理活性。尤其是马来酸和琥珀酸衍生物以及泛醌类化合物，在保肝、抗癌方面具有卓越的疗效。

樟芝菌固态发酵，可以利用太空包或是三角瓶等进行培养，培养1-3个月时间，可以得到与子实体相近的成分，但是在特征成分上还是有一定差异。与深层液态发酵法相比，固态发酵条件下，樟芝生长良好，并产生大量的胞外酶以及芳香性成分，产品的性状和得率也得到较好的改善，然而目前樟芝固态发酵还处于起步阶段，诸如培养条件、活性成分与功能的分析、大规模的工业化生产等方面还存在较多问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是是提供一种樟芝偶联固态发酵方法，将樟芝菌液态发酵与固态发酵偶联，培养出的樟芝发酵谷物经简单烘干粉碎即可制成泛醌类活性成分产量显著提高的樟芝谷物粉。

本发明采用了以下技术方案：

本发明提供的樟芝偶联固态发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，液态种子的培养：以樟芝菌株(Antrodia camphorata)S-29为生产菌株，接入到液态种子培养基中培养得到液态种子；

步骤二，液态发酵：将液态种子按一定接入比例接入到液态发酵培养基中，在培养温度28℃的条件下培养8-12天，得到樟芝发酵液；

步骤三，固液分离：将樟芝发酵液进行离心分离，得到上清液以及樟芝菌丝体；

步骤四，谷物固态发酵培养基的浸泡：将上清液与自来水按一定加入比例加入到谷物固态发酵培养基中，在15～30℃的条件下对谷物固态发酵培养基进行浸泡6-20小时，得到混合谷物固态发酵培养基；

步骤五，固态发酵：按步骤一制作新的液态种子，将新的液态种子按一定新的接入比例接入到混合固态发酵培养基中，在温度28℃的条件下，进行15～25天的固态发酵，得到樟芝发酵谷物。

本发明提供的樟芝偶联固态发酵方法，还具有这样的特征，其中，在步骤二中，接入比例为每100ml液态发酵培养基中接入8～20ml的液态种子。

本发明提供的樟芝偶联固态发酵方法，还具有这样的特征，其中，在步骤四中，加入比例为每100g谷物固态发酵培养基中加入总体积为60-100ml的发酵上清夜和自来水，总体积中的上清液和自来水的体积比为1:4～7:1。

本发明提供的樟芝偶联固态发酵方法，还具有这样的特征，其中，其中，在步骤五中，谷物固态发酵培养基的主体物质为粮食谷物类，新的接入比例为每100g粮食谷物类中接入10～40ml的新的液态种子。

本发明提供的樟芝偶联固态发酵方法，还具有这样的特征，其中，粮食谷物类为玉米、黑米、大米、小米、青稞中的任意一种或至少任意两种的组合。

本发明提供的樟芝偶联固态发酵方法，还具有这样的特征，其中，步骤二中得到的樟芝菌丝体，经冷冻干燥，得到樟芝菌丝体产物。

本发明提供的樟芝偶联固态发酵方法，还具有这样的特征，其中，步骤五中得到的樟芝发酵谷物，经烘干粉碎后得到樟芝发酵谷物粉。

本发明还提供一致根据上述的的樟芝偶联固态发酵方法得到的樟芝发酵谷物粉，其特征在于，每1g樟芝发酵谷物粉中含有2.4～4.5mg的安卓奎诺尔、2.1～3.9mg的安卓奎诺尔B。

发明作用与效果

根据本发明提供的樟芝偶联固态发酵方法，由于将樟芝液态发酵与固态发酵偶联起来，利用液态发酵后离心废弃的上清液进行固态发酵，代替原本固态发酵时浸泡谷物培养基中所用的自来水，一方面上清液中含有利于菌体生长的营养成分，加快了固态发酵过程中菌体生长速度，有利于实现大规模工业化应用；另一方面，该方法节约了生产发酵用水，减少了液态发酵培养基的排放，进而减轻了环境压力，是一种绿色生产技术。

另外，根据本发明的偶联固态发酵方法所得到的樟芝谷物粉，和非偶联的固态发酵方法所得到的樟芝谷物粉相比，其中的安卓奎诺尔以及安卓奎诺尔B的含量存在显著提高。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步阐述本发明。对于实施例中所用到的具体方法或材料，本领域技术人员可以在本发明技术思路的基础上，根据已有的技术进行常规的替换选择，而不仅限于本发明实施例的具体记载。

下述实施实例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

对照例

本对照例为对照实施例，采用非偶联发酵方法，进行樟芝谷物粉的制备。包括以下步骤：

步骤一，准备阶段，

斜面培养基：采用麦芽汁琼脂培养基；

液态种子培养基组成为(g/L)：每1L液态培养基中包括葡萄糖20g、胰蛋白胨4g、玉米浆粉2g；

固态发酵培养基：采用以下谷物玉米、黑米、大米、小米、青稞中的任意一种或任意两种以上作为基本料制成谷物固态发酵培养基，本实施例中的固态培养基组成为：每1000ml的锥形瓶中包括玉米100g、大豆蛋白胨0.6g、MgSO₄>2PO₄>

生产菌株：采用牛樟芝菌株(Antrodia camphorata)S-29为生产菌株。该牛樟芝菌株(Antrodia camphorata)S-29已于2014年09月09日保藏于中国普通微生物保藏中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其保藏编号为CGMCC 9590。

步骤二，激活菌种，

将准备好的樟芝菌株在斜面培养基内在温度28℃的条件下培养12天，得到激活的樟芝菌种。

步骤三，培养液态种子，

将步骤二激活得到的樟芝菌种接入到液态种子培养基中，在温度30℃的条件下培养3天得到液态种子。

步骤四，浸泡谷物固态发酵培养基，按以下比例向谷物固态发酵培养基中加入自来水：每100g玉米中加入80ml；

然后在温度25℃的条件下浸泡谷物固态发酵培养基15个小时。

步骤五，进行固态发酵，

将以下接入比例将步骤三得到的液态种子接入自来水浸泡后的谷物固态发酵培养基中：每100g谷物固态发酵培养基中接入20ml的液态种子，在温度28℃的条件下进行20天的固态发酵，得到樟芝发酵谷物。

步骤五，将发酵谷物放入烘箱内，在40℃下烘干，然后经粉碎机粉碎后，得到樟芝发酵谷物粉。

产物成分分析

采用高效液相色谱法(HPLC)对根据本实施例的方法所得到的樟芝发酵谷物粉进行分析，具体分析方法如下：

取烘干粉碎的牛樟芝液态发酵菌粉末0.5g，加入60ml乙醇，50℃，振荡萃取1.5h，静置后取上清经过0.22μm滤膜微滤，进行HPLC分析。分析条件如下：色谱柱：Sepax Amethyst C18(4.6mm×250mm)；流速：1mL/min；检测波长：254nm；流动相A：水/乙酸＝100/0.5，流动相B：乙腈；洗脱梯度如下：0-10min，流动相B 35％-50％；10-35min，流动相B 50％-60％；35-50min，流动相B 60％-80％；50-60min，流动相B 80％-100％。

分析表明本实施例得到的每1g樟芝发酵谷物粉中含有2.2mg的安卓奎诺尔、1.5mg的安卓奎诺尔B。

实施例1

本实施例提供的樟芝偶联固态发酵，包括以下步骤：

步骤一，准备阶段，

斜面培养基：采用麦芽汁琼脂培养基；

液态种子培养基组成为：每1L液态培养基中包括葡萄糖20g、胰蛋白胨4g、玉米浆粉2g；

液态发酵培养基组成为：每1L液态发酵培养基中包括葡萄糖

40g、胰蛋白胨5g、玉米浆粉2g、K₂HPO₄>4>

所用液态发酵培养基需在115℃下灭菌20min；

固态发酵培养基：采用以下谷物玉米、黑米、大米、小米、青稞中的任意一种或任意两种以上作为基本料制成谷物固态发酵培养基，本实施例中的固态培养基组成为：每1000ml的锥形瓶中包括玉米100g、大豆蛋白胨0.6g、MgSO₄>2PO₄>

生产菌株：采用牛樟芝菌株(Antrodia camphorata)S-29为生产菌株。该牛樟芝菌株(Antrodia camphorata)S-29已于2014年09月09日保藏于中国普通微生物保藏中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其保藏编号为CGMCC 9590。

步骤二，激活菌种，

将准备好的樟芝菌株在斜面培养基内在温度28℃的条件下培养12天，得到激活的樟芝菌种。

步骤三，培养液态种子，

将步骤一激活得到的樟芝菌种接入到液态种子培养基中，在温度30℃的条件下培养3天得到液态种子。

步骤四，液态发酵，

将液态种子按如下接入比例接入到液态发酵培养基中：每100ml液态发酵培养基中接入8ml的液态种子，

之后在培养温度28℃的条件下培养8天，得到樟芝发酵液。

步骤五，固液分离，

将樟芝发酵液进行离心分离，得到上清液以及樟芝菌丝体；

另外，将该步骤中得到的樟芝菌丝体经冷冻干燥，可得到樟芝菌丝体产物。

步骤六，谷物固态发酵培养基的浸泡，

将上清液与自来水按如下加入比例加入到谷物固态发酵培养基中：每100g谷物固态发酵培养基中加入总体积为60ml的发酵上清夜和自来水，并且总体积中的发酵上清液和自来水的体积比为1:4；

然后在15℃的条件下对谷物固态发酵培养基进行浸泡10小时，得到混合谷物固态发酵培养基。

步骤七，进行固态发酵，

按步骤一制作新的液态种子，将新的液态种子按如下的新的接入比例接入到混合固态发酵培养基中：每100g混合固态发酵培养基中接入10ml的新的液态种子；

然后在温度28℃的条件下，进行15天的固态发酵，得到樟芝发酵谷物。

步骤八，将步骤七得到的樟芝发酵谷物放入烘箱内，在40℃下烘干，然后经粉碎机粉碎后，能得到樟芝发酵谷物粉。

产物成分分析

采用高效液相色谱法(HPLC)对根据本实施例的方法所得到的樟芝发酵谷物粉进行分析，具体分析方法如下：

取烘干粉碎的牛樟芝液态发酵菌粉末0.5g，加入60ml乙醇，50℃，振荡萃取1.5h，静置后取上清经过0.22μm滤膜微滤，进行HPLC分析。分析条件如下：色谱柱：Sepax Amethyst C18(4.6mm×250mm)；流速：1mL/min；检测波长：254nm；流动相A：水/乙酸＝100/0.5，流动相B：乙腈；洗脱梯度如下：0-10min，流动相B 35％-50％；10-35min，流动相B 50％-60％；35-50min，流动相B 60％-80％；50-60min，流动相B 80％-100％。

分析表明本实施例得到的每1g樟芝发酵谷物粉中含有2.4mg的安卓奎诺尔2.1mg的安卓奎诺尔B。

实施例2

本实施例提供的樟芝固态偶联发酵，包括以下步骤：

步骤一，准备阶段，

斜面培养基：采用麦芽汁琼脂培养基；

液态种子培养基组成为：每1L液态培养基中包括葡萄糖20g、胰蛋白胨4g、玉米浆粉2g；

液态发酵培养基组成为：每1L液态发酵培养基中包括葡萄糖

40g、胰蛋白胨5g、玉米浆粉2g、K₂HPO₄>4>

所用液态发酵培养基需在115℃下灭菌20min；

固态发酵培养基：采用以下谷物玉米、黑米、大米、小米、青稞中的任意一种或任意两种以上作为基本料制成谷物固态发酵培养基，本实施例中的固态培养基组成为：每1000ml的锥形瓶中包括玉米100g、大豆蛋白胨0.6g、MgSO₄>2PO₄>

生产菌株：采用牛樟芝菌株(Antrodia camphorata)S-29为生产菌株。该牛樟芝菌株(Antrodia camphorata)S-29已于年月日保藏于中国普通微生物保藏中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其保藏编号为CGMCC 9590。

步骤二，激活菌种，

将准备好的樟芝菌株在斜面培养基内在温度28℃的条件下培养12天，得到激活的樟芝菌种。

步骤三，培养液态种子，

将步骤一激活得到的樟芝菌种接入到液态种子培养基中，在温度30℃的条件下培养3天得到液态种子。

步骤四，液态发酵，

将液态种子按如下接入比例接入到液态发酵培养基中：每100ml液态发酵培养基中接入14ml的液态种子，

之后在培养温度28℃的条件下培养10天，得到樟芝发酵液。

步骤五，固液分离，

将樟芝发酵液进行离心分离，得到上清液以及樟芝菌丝体；

另外，将该步骤中得到的樟芝菌丝体经冷冻干燥，可得到樟芝菌丝体产物。

步骤六，谷物固态发酵培养基的浸泡，

将上清液与自来水按如下加入比例加入到谷物固态发酵培养基中：每100g谷物固态发酵培养基中加入总体积为80ml的发酵上清夜和自来水，并且总体积中的发酵上清液和自来水的体积比为1:1；

然后在25℃的条件下对谷物固态发酵培养基进行浸泡15小时，得到混合谷物固态发酵培养基。

步骤七，进行固态发酵，

按步骤一制作新的液态种子，将新的液态种子按如下的新的接入比例接入到混合固态发酵培养基中：每100g混合固态发酵培养基中接入25ml的新的液态种子；

然后在温度28℃的条件下，进行20天的固态发酵，得到樟芝发酵谷物。

步骤八，将步骤七得到的樟芝发酵谷物放入烘箱内，在40℃下烘干，然后经粉碎机粉碎后，能得到樟芝发酵谷物粉。

产物成分分析

采用高效液相色谱法(HPLC)对根据本实施例的方法所得到的樟芝发酵谷物粉进行分析，具体分析方法如下：

取烘干粉碎的牛樟芝液态发酵菌粉末0.5g，加入60ml乙醇，50℃，振荡萃取1.5h，静置后取上清经过0.22μm滤膜微滤，进行HPLC分析。分析条件如下：色谱柱：Sepax Amethyst C18(4.6mm×250mm)；流速：1mL/min；检测波长：254nm；流动相A：水/乙酸＝100/0.5，流动相B：乙腈；洗脱梯度如下：0-10min，流动相B 35％-50％；10-35min，流动相B 50％-60％；35-50min，流动相B 60％-80％；50-60min，流动相B 80％-100％。

分析表明本实施例得到的每1g樟芝发酵谷物粉中含有4.5mg的安卓奎诺尔3.9mg的安卓奎诺尔B。

实施例3

本实施例提供的樟芝偶联固态发酵，包括以下步骤：

步骤一，准备阶段，

斜面培养基：采用麦芽汁琼脂培养基；

液态种子培养基组成为：每1L液态培养基中包括葡萄糖20g、胰蛋白胨4g、玉米浆粉2g；

液态发酵培养基组成为：每1L液态发酵培养基中包括葡萄糖40g、胰蛋白胨5g、玉米浆粉2g、K₂HPO₄>4>

固态发酵培养基：采用以下谷物玉米、黑米、大米、小米、青稞中的任意一种或任意两种以上作为基本料制成谷物固态发酵培养基，本实施例中的固态培养基组成为：每1000ml的锥形瓶中包括玉米100g、大豆蛋白胨0.6g、MgSO₄>2PO₄>

生产菌株：采用牛樟芝菌株(Antrodia camphorata)S-29为生产菌株。该牛樟芝菌株(Antrodia camphorata)S-29已于2014年09月09日保藏于中国普通微生物保藏中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其保藏编号为CGMCC 9590

步骤二，激活菌种，

将准备好的樟芝菌株在斜面培养基内在温度28℃的条件下培养12天，得到激活的樟芝菌种。

步骤三，培养液态种子，

将步骤一激活得到的樟芝菌种接入到液态种子培养基中，在温度30℃的条件下培养3天得到液态种子。

步骤四，液态发酵，

将液态种子按如下接入比例接入到液态发酵培养基中：每100ml液态发酵培养基中接入20ml的液态种子，

之后在培养温度28℃的条件下培养12天，得到樟芝发酵液。

步骤五，固液分离，

将樟芝发酵液进行离心分离，得到上清液以及樟芝菌丝体；

另外，将该步骤中得到的樟芝菌丝体经冷冻干燥，可得到樟芝菌丝体产物。

步骤六，谷物固态发酵培养基的浸泡，

将上清液与自来水按如下加入比例加入到谷物固态发酵培养基中：每100g谷物固态发酵培养基中加入总体积为100ml的发酵上清夜和自来水，并且总体积中的发酵上清液和自来水的体积比为7:1；

然后在30℃的条件下对谷物固态发酵培养基进行浸泡20小时，得到混合谷物固态发酵培养基。

步骤七，进行固态发酵，

按步骤一制作新的液态种子，将新的液态种子按如下的新的接入比例接入到混合固态发酵培养基中：每100g混合固态发酵培养基中接入40ml的新的液态种子；

然后在温度28℃的条件下，进行25天的固态发酵，得到樟芝发酵谷物。

步骤八，将步骤七得到的樟芝发酵谷物放入烘箱内，在40℃下烘干，然后经粉碎机粉碎后，能得到樟芝发酵谷物粉。

产物成分分析

采用高效液相色谱法(HPLC)对根据本实施例的方法所得到的樟芝发酵谷物粉进行分析，具体分析方法如下：

取烘干粉碎的牛樟芝液态发酵菌粉末0.5g，加入60ml乙醇，50℃，振荡萃取1.5h，静置后取上清经过0.22μm滤膜微滤，进行HPLC分析。分析条件如下：色谱柱：Sepax Amethyst C18(4.6mm×250mm)；流速：1mL/min；检测波长：254nm；流动相A：水/乙酸＝100/0.5，流动相B：乙腈；洗脱梯度如下：0-10min，流动相B 35％-50％；10-35min，流动相B 50％-60％；35-50min，流动相B 60％-80％；50-60min，流动相B 80％-100％。

分析表明本实施例得到的每1g樟芝发酵谷物粉中含有4.0mg的安卓奎诺尔3.6m g的安卓奎诺尔B。

实施例作用与效果

实施例1至实施例3提供的樟芝固态偶联的方法，将樟芝液态发酵与固态发酵偶联起来，与对照例中的不与液态发酵偶联得方法相比，由于固态偶联的方法利用了采用樟芝液态发酵进行制备生产产生的发酵液体代替自来水作为固态发酵固态培养基的浸泡用水，而常规液态发酵的产生的发酵液体作为废弃液体排出，这样节省发酵时间、节省了固态发酵用水，并不再排出废弃液体，使得生产效率高且绿色环保节约；而且，采用樟芝固态偶联的制备方法制备的产物樟芝发酵谷物经烘干粉碎制备而成的樟芝发酵谷物粉，经检测，每1g樟芝发酵谷物粉中含有的安奎诺尔高达4.5mg、含有的安卓奎诺尔B高达3.9mg，而非偶联固态发酵制备的樟芝发酵谷物粉中，每1g樟芝发酵谷物粉中含有的安卓奎诺尔平均为2.2mg、含有的安卓奎诺尔B平均1.5mg，可见本发明提供的固态偶联方法制备的樟芝发酵谷物粉中的安卓奎诺尔高达和安卓奎诺尔B的含量均得到了显著的提高。