一种利用草酸青霉半连续发酵生产纤维素酶的方法

摘要

本发明公开了一种利用草酸青霉半连续发酵生产纤维素酶的方法，是将草酸青霉在以木糖渣为主要碳源的廉价培养基中发酵，当发酵液中滤纸酶活达到10IU/mL时放出部分发酵液到储料罐中，同时向发酵罐中补入与放出发酵液相同体积量的初始发酵培养基，在原条件下继续新一轮发酵；当发酵液中滤纸酶活再次达到10IU/mL时，再次放出部分发酵液，并向发酵罐中再补入与放出发酵液相同体积量的初始发酵培养基，在原条件下再进行新一轮发酵，如此重复进行半连续操作获得含纤维素酶的发酵液。本发明方法操作简便，生产成本低，可显著提高生产效率和设备利用率，纤维素酶最高容积生产效率可达158.38IU/L/h。

说明书

技术领域

本发明涉及发酵工程领域，具体涉及一种以草酸青霉Re-10为生产菌株采用半连续发酵工艺生产纤维素酶的方法。

背景技术

由于天然纤维素结构和组成的复杂性，能将其降解的纤维素酶不是一个单体酶，而是一组参与纤维素降解的多组分酶的总称。目前工业上用来生产纤维素酶的微生物主要是具有游离纤维素酶分泌能力的丝状真菌，通常是木霉属、青霉属、曲霉属等属的微生物，有代表性的有里氏木霉(Trichoderma reesei)、草酸青霉(Penicillium oxalicum)、溶纤维素枝顶孢霉(Acremonium cellulolyticus)、勒克瑙金孢(Chrysosporium lucknowense)等。国内纤维素酶的生产厂家常用里氏木霉和草酸青霉作为生产菌株，里氏木霉能产生大量胞外蛋白，且所分泌的酶系纤维素酶活力高，但β-葡萄糖苷酶活力低、各种酶组分所占比例不合理；草酸青霉较里氏木霉能产生更多的β-葡萄糖苷酶、同时生长速度快，能利用麸皮等廉价原料生产纤维素酶。

生产第二代纤维素燃料乙醇所需要的纤维素酶用量非常大，许多科学家提出采用现场生产(on-site production)的方式降低纤维素酶下游提取和运输的成本。采用现场生产方式生产纤维素酶时，容积生产效率是衡量生产能力的一个重要指标，如何高效并低成本的生产纤维素酶，已成为纤维素酶生产的首要任务。

液体深层发酵是目前工业上生产纤维素酶的主要方式，液体深层发酵又可分为分批发酵、补料分批发酵、半连续发酵及连续发酵等形式。枝顶孢酶(Acremonium strictum)被用来以甘蔗渣为原料分批发酵生产纤维素酶，发酵周期192h，滤纸酶活达到10.82IU/mL，容积生产效率56.35IU/L/h。分批发酵操作简便，但在整个生产过程中，生产菌株处于产酶高峰的时间较短，容积生产效率较低。马丽娟等使用里氏木霉(T.Reesei)采用补料发酵的方式培养160h，滤纸酶活达到19.07IU/mL，容积生产效率为119.19IU/L/h。李晨等在补料发酵的基础上，通过阶段控制pH的策略提高了纤维素酶的产量，发酵时间缩短到132h，滤纸酶活达到16.32IU/mL，容积生产效率123.6IU/L/h。补料分批发酵可以显著提高发酵液纤维素酶的产量，但存在的问题是可溶性的诱导物如纤维二糖、槐糖的价格昂贵，而不溶性的诱导物如微晶纤维素、各种纤维素粉等的吸水性都很强，在浓度大于10％时就己丧失流动性，难以进行连续性的补料。

到目前为止工业上还没有半连续发酵生产纤维素酶的实例，经检索后亦未见有利用草酸青霉半连续发酵生产纤维素酶的报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种高容积生产效率、低运行成本、易于 实现工业化应用的利用草酸青霉半连续发酵生产纤维素酶的方法。

本发明所述利用草酸青霉半连续发酵生产纤维素酶的方法，是将草酸青霉(Penicilliumoxalicum)的种子液按体积百分比2～10％的接种量接入装有以木糖渣为主要碳源的廉价培养基的发酵罐中，以温度为25～35℃，搅拌转速为150～400r/min，通风比为0.4～1.2vvm的条件进行发酵培养，当发酵液中滤纸酶活达到10IU/mL时放出部分发酵液到储料罐中，同时向发酵罐中补入与放出发酵液相同体积量的初始发酵培养基，在原条件下继续新一轮发酵；当发酵液中滤纸酶活再次达到10IU/mL时，再次放出部分发酵液，同时再向发酵罐中补入与放出发酵液相同体积量的初始发酵培养基，在原条件下再进行新一轮发酵，如此重复进行半连续操作获得含纤维素酶发酵液；

其特征在于：

所述以木糖渣为主要碳源的廉价培养基的组成为：木糖渣10～50g/L，微晶纤维素1～10g/L，麸皮20～100g/L，豆饼粉5～20g/L，硫酸铵1～5g/L，硝酸钠1～5g/L，尿素0.5～2g/L，磷酸二氢钾1～5g/L，硫酸镁0.2～1g/L，蒸馏水定容到1L；

所述当测得发酵液中滤纸酶活达到10IU/mL时对应的发酵时间为96～120h；

所述放出部分发酵液的体积量是初始装液体积量的30～70％；

所述新一轮发酵时，当发酵液中滤纸酶活再次达到10IU/mL时对应的发酵时间为12～48h；

所述重复半连续发酵的轮次为1～10轮。

上述利用草酸青霉半连续发酵生产纤维素酶的方法中，

所述以木糖渣为主要碳源的廉价培养基的组成优选为木糖渣18～22g/L，微晶纤维素5～7g/L，麸皮45～50g/L，豆饼粉8～12g/L，硫酸铵2～4g/L，硝酸钠2～3g/L，尿素0.5～1g/L，磷酸二氢钾2～4g/L，硫酸镁0.4～0.6g/L，蒸馏水定容到1L。

上述木糖渣是玉米芯提取木糖后剩余的残渣，该木糖渣中以重量百分比计纤维素成分不少于65％，半纤维素成分不多于2％，木质素成分不多于5％，灰分及其他成分不多于28％。，

所述放出部分发酵液的体积量是初始装液体积量的50％。

本发明公开的以木糖渣为主要碳源的廉价培养基是申请人通过对来自工业生产中的废弃纤维素如玉米芯提取木糖或糠醛后的残渣、造纸厂抄纸后的细小纤维等进行实验室筛选优化后得到，具有价格廉价、来源广泛及诱导产酶效果较好等特点。

本发明公开的利用草酸青霉半连续发酵生产纤维素酶的方法，克服了补料发酵过程中可溶性诱导物如纤维二糖、槐糖的价格昂贵及不溶性诱导物难以进行连续性的补料等缺点。本发明采用半连续发酵方式生产纤维素酶，这种生产方式发酵液中的菌体浓度较高，微生物对发酵液较为适应，在补充新鲜培养基之后几乎没有延滞期，故可使菌株较长时间保持在产酶高峰，从而获得了高产量和高生产强度；半连续发酵的操作简便，设备复杂性不高，容易实现生产的自动化操作；同分批发酵相比，半连续发酵清洗、灭菌、种子培养等阶段占总生产 时间的比重较低，因而能够极大地提高生产效率和设备利用率。

附图说明

图1分批发酵过程中产酶、溶氧及pH的变化曲线。

图2以30％比例进行半连续发酵过程中产酶、溶氧及pH的变化曲线。

图3以50％比例进行半连续发酵过程中产酶、溶氧及pH的变化曲线。

图4以60％比例进行半连续发酵过程中产酶、溶氧及pH的变化曲线。

图5以50％比例进行4次补料半连续发酵过程中产酶、溶氧及pH的变化曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明保护内容作进一步阐述。实施例中所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制本发明权利要求所述的保护范围。

实施例1：分批发酵。

将草酸青霉(Penicillium oxalicum)Re-10在麸皮斜面上培养4天后用无菌水洗下孢子，孢子按10⁶个/mL的比例接种到种子培养基后，在30℃条件下培养36h，制得草酸青霉(Penicillium>

其中：所述的草酸青霉(Penicillium oxalicum)Re-10菌株已记载在中国专利CN103911296A中，该菌株已于2014年3月17日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏编号为CGMCC No.8922。所述种子培养基的组成为：葡萄糖10g/L，硫酸铵2g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁0.5g/L，蛋白胨10g/L，木糖渣10g/L，麸皮10g/L。

在7.5L发酵罐中装入4.5L发酵培养基，121℃灭菌30min后接入0.5L草酸青霉Re-10种子液进行发酵培养，温度控制在30℃，通风比0～12h控制在0.5，12～24h后控制在0.75，24～36h后控制在1，搅拌转速控制在300r/min。

其中：所述发酵培养基的组成为：木糖渣20g/L，微晶纤维素6g/L，麸皮46.5g/L，豆饼粉10g/L，硫酸铵2g/L，硝酸钠2.8g/L，尿素1g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁0.5g/L。

每隔12h取样测定发酵液的滤纸酶活、内切纤维素酶活、外切纤维素酶活、β-葡萄糖苷酶活以及蛋白浓度、还原糖浓度等指标。

纤维素酶总活力以滤纸酶活(FPA)来表征，定义为：1g固体酶(或1mL液体酶)，在50±0.1℃，pH 4.8条件下1h水解Whatman 1号滤纸底物，产生出相当于1μmol葡萄糖的还原糖量定义为1个酶活力单位(IU)。

内切纤维素酶活力(EG)的测定：以2mL 0.667％的羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液为底物，与0.5mL适当稀释的酶液混匀，50℃反应30min，用DNS法测定还原糖的生成量，在上述条件下每分钟水解产生1μmol葡萄糖所需的酶量定义为1个酶活力单位(IU)。

外切纤维素酶(ρNPCase)：以50μL浓度为1mg/mL的4-nitrophenyl-β-D-cellobioside(ρNPC)为底物(底物中加入1mg/mL的δ-葡萄糖酸内酯抑制β-葡萄糖苷酶的活力)，与100μL适当稀释的酶液混匀，50℃反应30min，用150μL浓度为10％的Na₂CO₃终止反应， 每分钟水解产生产生1μmol对硝基酚所需的酶量定义为1个酶活力单位(IU)。

β-葡萄糖苷酶(ρNPGase)：以50μL浓度为1mg/mL的4-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside(ρNPG)为底物，与100μL适当稀释的酶液混匀，50℃反应30min，用150μL浓度为10％的Na₂CO₃终止反应，每分钟水解产生产生1μmol对硝基酚所需的酶量定义为1个酶活力单位(IU)。

发酵过程中酶活及蛋白浓度、还原糖等指标的变化见图1。在发酵120h时FPA酶活达到最高为12.69IU/mL，发酵结束时获得纤维素酶液5L，FPA的容积生产效率为105.75IU/L/h。

实施例2：以30％比例进行单次半连续发酵。

将草酸青霉(Penicillium oxalicum)Re-10在麸皮斜面上培养4天后用无菌水洗下孢子，孢子按10⁶个/mL的比例接种到种子培养基后，在30℃条件下培养36h。

其中，所述种子培养基的组成为：葡萄糖10g/L，硫酸铵2g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁0.5g/L，蛋白胨10g/L，木糖渣10g/L，麸皮10g/L。

在7.5L发酵罐中装入4.5L发酵培养基，121℃灭菌30min后接入0.5L草酸青霉Re-10种子进行发酵培养，温度控制在30℃，通风比0～12h控制在0.5，12～24h后控制在0.75，24～36h后控制在1，搅拌转速控制在300r/min。

其中，所述发酵培养基的组成为：木糖渣20g/L，微晶纤维素6g/L，麸皮46.5g/L，豆饼粉10g/L，硫酸铵2g/L，硝酸钠2.8g/L，尿素1g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁0.5g/L。

每隔12h取样测定发酵液的滤纸酶活、内切纤维素酶活、外切纤维素酶活、β-葡萄糖苷酶活以及蛋白浓度、还原糖浓度等指标。

发酵108h时滤纸酶活活力达到11.06IU/mL，放出总发酵体积30％的发酵液，罐中留存70％发酵液，同时补充30％培养基继续进行发酵。

发酵过程中酶活及蛋白浓度、还原糖等指标的变化见图2。在进行半连续操作36h后，发酵液酶活达到最高点，此时FPA为12.43IU/mL，发酵周期为144h，此时放罐可累计获得发酵液6.5L，容积生产效率为110.47IU/L/h。

实施例3：以50％比例进行单次半连续发酵。

将草酸青霉(Penicillium oxalicum)Re-10在麸皮斜面上培养4天后用无菌水洗下孢子，孢子按10⁶个/mL的比例接种到种子培养基后，在30℃条件下培养36h。

其中，所述种子培养基的组成为：葡萄糖10g/L，硫酸铵2g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁0.5g/L，蛋白胨10g/L，木糖渣10g/L，麸皮10g/L。

在7.5L发酵罐中装入4.5L发酵培养基，121℃灭菌30min后接入0.5L草酸青霉Re-10种子进行发酵培养，温度控制在30℃，通风比0～12h控制在0.5，12～24h后控制在0.75， 24～36h后控制在1，搅拌转速控制在300r/min。

其中，所述发酵培养基的组成为：木糖渣20g/L，微晶纤维素6g/L，麸皮46.5g/L，豆饼粉10g/L，硫酸铵2g/L，硝酸钠2.8g/L，尿素1g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁0.5g/L。

每隔12h取样测定发酵液的滤纸酶活、内切纤维素酶活、外切纤维素酶活、β-葡萄糖苷酶活以及蛋白浓度、还原糖浓度等指标。

发酵108h时滤纸酶活活力达到10.99IU/mL，放出总发酵体积50％的发酵液，罐中留存50％发酵液，同时补充50％培养基继续进行发酵。

发酵过程中酶活及蛋白浓度、还原糖等指标的变化见图3。在进行半连续操作36h后，发酵液酶活达到最高点，此时FPA为12.33IU/mL，发酵周期为144h，此时放罐可累计获得发酵液7.5L，容积生产效率为123.78IU/L/h。

实施例4：以60％比例进行单次半连续发酵。

将草酸青霉(Penicillium oxalicum)Re-10在麸皮斜面上培养4天后用无菌水洗下孢子，孢子按10⁶个/mL的比例接种到种子培养基后，在30℃条件下培养36h。

其中，所述种子培养基的组成为：葡萄糖10g/L，硫酸铵2g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁0.5g/L，蛋白胨10g/L，木糖渣10g/L，麸皮10g/L。

在7.5L发酵罐中装入4.5L发酵培养基，121℃灭菌30min后接入0.5L草酸青霉Re-10种子进行发酵培养，温度控制在30℃，通风比0～12h控制在0.5，12～24h后控制在0.75，24～36h后控制在1，搅拌转速控制在300r/min。

其中，所述发酵培养基的组成为：木糖渣20g/L，微晶纤维素6g/L，麸皮46.5g/L，豆饼粉10g/L，硫酸铵2g/L，硝酸钠2.8g/L，尿素1g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁0.5g/L。

每隔12h取样测定发酵液的滤纸酶活、内切纤维素酶活、外切纤维素酶活、β-葡萄糖苷酶活以及蛋白浓度、还原糖浓度等指标。

发酵108h时滤纸酶活活力达到10.96IU/mL，放出总发酵体积60％的发酵液，罐中留存40％发酵液，同时补充60％培养基继续进行发酵。

发酵过程中酶活及蛋白浓度、还原糖等指标的变化见图4。在进行半连续操作48h后，发酵液酶活才达到最高点，此时FPA为10.35IU/mL，发酵周期明显延迟，达到156h，此时放罐可累计获得发酵液8L，容积生产效率为108.50IU/L/h。

实施例5：以50％比例进行多次半连续发酵。

在7.5L发酵罐中装入4.5L培养基，121℃灭菌30min后接入0.5L草酸青霉(Penicilliumoxalicum)Re-10种子进行发酵培养，温度控制在30℃，通风量0～8h控制在2L，8～16h控制在3L，16h后控制在4L，搅拌转速300r/min；

每隔12h取样测定发酵液的滤纸酶活、内切纤维素酶活、外切纤维素酶活、β-葡萄糖苷 酶活以及蛋白浓度、还原糖浓度等指标。

发酵108h时FPA活力达到11.20IU/mL，此时放出2.5L发酵液，罐中留存2.5L发酵液，同时补充2.5L初始发酵液进行培养；

继续发酵24h后放出2.5L发酵液，罐中留存2.5L发酵液，同时再补充2.5L初始发酵液进行培养；如此反复进行5轮次。

发酵过程中酶活及蛋白浓度、还原糖等指标的变化见图5。发酵周期为216h，总共获得发酵液15L，容积生产效率为158.38IU/L/h。