一株利用甲醇制备高赖氨酸单细胞蛋白的多形汉逊酵母菌及其应用

摘要

本发明涉及一株利用甲醇制备高赖氨酸单细胞蛋白的多形汉逊酵母菌及其应用，所述菌株分类命名为多形汉逊酵母（Hansenula polymorpha）AP23，已于2016年4月5日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCC NO:M 2016173。本发明利用等离子体诱变技术，以甲醇作为唯一碳源筛选出能生产富含赖氨酸的单细胞蛋白的菌株，在此基础上进一步结合甲醇梯度筛选获得高效利用甲醇的多形汉逊酵母菌。利用本发明的菌株能够实现高密度发酵，利用5 L发酵罐进行甲醇蛋白生产，最终菌体湿重达到350‑400 g/L，甲醇蛋白干重达到115‑130 g/L，蛋白质含量达到68%，其中赖氨酸含量高达60 mg/g。本发明对动物饲料蛋白添加剂的发展具有重大的社会意义和经济价值。

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程领域，特别是一株利用甲醇生产富含赖氨酸单细胞蛋白的多形汉逊酵母菌及其应用。

背景技术

蛋白质资源短缺是全世界面临的重大课题，各国都在重视加强开发新型蛋白资源的研究。其中，工业化最快的是单细胞蛋白生产，并被认为是解决人类蛋白质资源匮乏最有效的途径之一。

单细胞蛋白（single cell protein, SCP），是指酵母菌、霉菌、真菌、非致病性细菌等单细胞微生物体内所产生的菌体蛋白质，其蛋白质含量一般占菌体干物质的40%~60%。以工业甲醇为原料生产出来的甲醇蛋白被称之为第二代单细胞蛋白，与天然蛋白相比，其粗蛋白含量在70%以上，比鱼粉和大豆都要高，且含有丰富的必需氨基酸、矿物质和维生素，可以部分替代鱼粉、大豆、骨粉、肉类以及脱脂奶粉，且具有不依靠耕地、不受气候影响、蛋白质质量稳定等优点。

从20世纪60年代开始，就有不少国家开展了甲醇蛋白的研究，并发展成为世界性的热门研究课题。其中占领先地位的要属英国ICI公司，1980年便有规模为10万t/a的装置建成投产。ICI公司生产的甲醇蛋白商品名为“Pruteen”。“Pruteen”产品中含有72%的粗蛋白，蛋氨酸和赖氨酸含量与鱼粉非常相近，作为富含热量、维生素、矿物质及高蛋白的饲料在市场上销售。1983年美国Phillips石油公司又开发出甲醇蛋白生产新工艺，改进发酵罐热交换和氧传递条件，可生产高密度甲醇蛋白。随后，德国Hoechst-Uhde、日本三菱瓦斯化学、瑞典Norprotein和法国IFP等公司也建立了中试装置。20世纪70年代以来，我国也开始甲醇蛋白的研究。但到目前为止，甲醇蛋白的产业化在我国仍处于起步阶段，国内还没有工业化的甲醇蛋白生产装置，一些单位也停止了对甲醇蛋白的研究开发。

甲醇是一种平台化工品，其来源广泛，我国的甲醇产能已经超过4500 万 t/a，并呈继续增加趋势，而国内的甲醇需求量仅为1000万 t/a，多数甲醇企业生存难以为继，急需开发甲醇下游产品，而以甲醇为原料生产蛋白资源，可以缓解甲醇的供需矛盾。目前，甲醇价格低廉，甲醇蛋白生产成本低，以甲醇蛋白代替传统的鱼粉和豆类等蛋白，将会降低饲料成本，提高饲养效率，加速我国饲料工业的发展，同时也是解决目前蛋白饲料短缺，依赖进口这一矛盾的有效途径。

甲醇蛋白生产菌株有细菌和酵母等，酵母菌的耐酸性能非常好，可以减少大规模培养时污染的风险，在廉价的合成或半合成培养基上能高密度生长，此外多形汉逊酵母又具有相对较高的最优生长温度，可以提高生长速度，缩短发酵时间，同时降低对发酵设备的制冷要求，从而有利于大规模发酵生产。但是如何能够利用酵母菌实现高效利用甲醇生产富含某种氨基酸的单细胞蛋白还未有报道。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一株利用甲醇制备高赖氨酸单细胞蛋白的多形汉逊酵母菌。

为实现本发明的第一目的，本发明采用的技术方案如下：

一株高效利用甲醇生产富含赖氨酸单细胞蛋白的多形汉逊酵母，其分类命名为多形汉逊酵母Hansenula polymorphaAP23，其保藏编号为：CCTCC NO: M 2016173。保藏日是2016年4月5日。

本发明所述的多形汉逊酵母Hansenula polymorphaAP23的筛选方法为，将多形汉逊酵母出发菌株（ATCC34438）经等离子体诱变后，以甲醇作为唯一碳源，利用高浓度甲醇平板筛选得到甲醇耐受能力较强的菌株，再经摇瓶发酵筛选获得高含量蛋白和高含量赖氨酸的菌株，最后经高浓度甲醇驯化，获得能高效利用甲醇生产富含赖氨酸单细胞蛋白的多形汉逊酵母。

多形汉逊酵母Hansenula polymorphaAP23的筛选具体步骤如下：

（1）等离子体诱变：将多形汉逊酵母原始菌株活化培养，100 ml 三角瓶装液量为20ml，37℃摇床中200 rpm振荡培养24 h，得到处于对数生长期的菌液，将培养的细胞稀释至OD₆₀₀=3-4，滴加在灭菌冷却后的载片上，用无菌空气吹干；以氦气为放电气体，以80-120W作为射频功率，以10-30SLM作为气体流量，以10-1800s作为辐照时间对菌株进行等离子体诱变。

（2）高浓度甲醇平板初筛：将诱变后的载片置于装有1-2 mL生理盐水的具塞试管中，剧烈震荡，将载片上的菌株洗脱，稀释成不同浓度涂布于含500 mM甲醇的培养基平板上，37℃培养2-3天，挑选出生长旺盛的菌落。

（3）富含赖氨酸单细胞蛋白菌株的筛选：选取生长旺盛的单菌落分别接种于包含500 mM甲醇的200 ml发酵培养基中，37℃，200 rpm培养48h，离心收集菌体蛋白，检测菌体中蛋白的含量以及赖氨酸的含量，选择蛋白含量和赖氨酸含量均较高的菌株。

（4）高浓度甲醇驯化：选取步骤（3）中的蛋白含量和赖氨酸含量均较高的菌株继续接种至含500 mM甲醇的选择培养基上，待其生长至对数期后，转接至含1M甲醇的选择培养基上；之后按同样方法转接至含1.5 M的选择培养基上，最后再将菌液转移到含2 M甲醇的选择培养基中，重复驯化2次后，取0.2 ml菌液涂布在包含2 M甲醇的选择培养基平板上，37℃恒温培养，获取多形汉逊酵母Hansenula polymorphaAP23。

本发明的第二目的在于多形汉逊酵母Hansenula polymorphaAP23在制备高赖氨酸单细胞蛋白中的应用。本发明提供了一种利用多形汉逊酵母Hansenula polymorphaAP23在制备高赖氨酸单细胞蛋白中应用的方法，具体步骤如下：

（1）多形汉逊酵母菌AP23在5 L发酵罐中高密度发酵：多形汉逊酵母菌AP23在5 L发酵罐中采用发酵培养基进行菌体蛋白生产，其中，发酵培养基装液量为2L，121℃灭菌15 min，同时对接种管道、氨水及甲醇流加管道、取样口管道、空气过滤器进行灭菌，待发酵培养基降至37℃左右时，用氨水调节pH至5.0，加入种子液进行发酵，发酵温度为37℃，控制溶氧20%-60%，搅拌转速250-500 rpm；24小时后，培养基中甘油耗尽，开始流加甲醇，用气相监测甲醇浓度，使其控制在0.5%-2%之间，每8个小时取样测定菌体OD₆₀₀和湿重，96-100小时后，发酵结束，收集发酵液。

（2）富含赖氨酸甲醇蛋白的提取：将上述步骤（1）在5 L发酵罐中收集的发酵液经离心机5000r/min连续离心浓缩获得菌体，用清水洗涤菌体后称量其湿重；将收集的菌体于55℃烘干至质量恒定，收集干粉即为单细胞甲醇蛋白。

本发明的有益效果在于：

本发明采用等离子体诱变多形汉逊酵母，利用甲醇平板筛选出蛋白含量和赖氨酸含量较高的菌株，在此基础上利用高浓度甲醇驯化，使得该菌株能高效地利用甲醇生产单细胞蛋白。在5L发酵罐中，利用甘油30 g/L，甲醇500 ml/L可生产115-130g/L菌体蛋白，其中赖氨酸含量可达60mg/g，并且获得的甲醇蛋白干粉中不含甲醇，是替代饲料蛋白的理想原料，具有重大的社会意义和经济价值。

生物材料说明

本发明所述的生物材料，其分类命名为多形汉逊酵母（Hansenula polymorpha）AP23，已保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），保藏编号为CCTCC NO：M 2016173，保藏日期为：2016年4月5日，保藏地址为：中国. 武汉. 武汉大学。

具体实施方式

下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。

实施例1

本实施例说明将多形汉逊酵母原始菌株进行第一步等离子体诱变的方法。

多形汉逊酵母原始菌株进行第一步等离子体诱变的方法如下：

将多形汉逊酵母原始菌株活化培养，100 ml 三角瓶装液量为20 ml，37℃摇床中200rpm振荡培养24 h，得到生长旺盛、菌体粗壮的菌液；取新鲜培养的细胞稀释至细胞浓度OD₆₀₀=3-4，滴加在灭菌冷却后的载片上，用无菌空气吹干；以氦气为放电气体，以100W作为射频功率，以10SLM作为气体流量，以10-1800s作为辐照时间对菌株进行等离子体诱变，诱变后，将载体上的菌膜洗脱下来，计算存活率。实验结果表明450>

实施例2

本实例说明筛选高效利用甲醇生产富含赖氨酸单细胞蛋白的多形汉逊酵母的方法。

其中，所使用的培养基配方：

（1）种子培养基：酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，其余为水。

（2）选择培养基：甲醇500 mM，硫酸铵1 g/L，磷酸二氢钾1 g/L，硫酸镁0.7 g/L，氯化钙0.4 g/L，酵母膏1 g/L，琼脂粉 1.5 g/L，其余为水，pH自然。

（3）发酵培养基：85% 磷酸26.7 ml/L，二水硫酸钙0.93 g/L，硫酸钾18.2 g/L，二水硫酸镁14.9 g/L，氢氧化钾4.13 g/L，甘油30 g/L，微量元素溶液4 ml/L，水1 L；

（4）发酵培养基2：85% 磷酸26.7 ml/L，二水硫酸钙0.93 g/L，硫酸钾18.2 g/L，二水硫酸镁14.9 g/L，氢氧化钾4.13 g/L，甲醇20ml/L，微量元素溶液4 ml/L，水1 L，培养时每24h添加 20ml/L甲醇。

所述的微量元素溶液为：五水硫酸铜6 g/L，碘化钾0.088 g/L，一水硫酸锰3 g/L，二水钼酸钠0.2 g/L，硼酸0.02 g/L，六水氯化钴0.5 g/L，氯化锌20 g/L，七水硫酸亚铁65g/L，生物素0.2 g/L，质量浓度为98 %的浓硫酸5 ml/L，其余为水。

筛选步骤具体如下：

（1）高浓度甲醇平板初筛：

将实施例1中诱变后的载片置于装有1-2ml生理盐水的具塞试管中，剧烈震荡，将载片上的菌株洗脱，稀释成不同浓度涂布于含500mM甲醇的选择培养基平板上，37℃培养3-4天，挑选出生长旺盛的菌落。

（2）富含赖氨酸单细胞蛋白菌株的筛选：选取生长旺盛的单菌落分别接种于包含500 mM甲醇的200 ml发酵培养基中，37℃，200 rpm培养48h，离心收集菌体蛋白，检测菌体中蛋白的含量以及赖氨酸的含量，选择蛋白含量和赖氨酸含量均较高的菌株。

（3）耐高浓度甲醇的驯化：选取步骤2中的蛋白含量和赖氨酸含量均较高的菌株继续接种至含500 mM甲醇的选择培养基上，待其生长至对数期后，转接至含1M甲醇的选择培养基上；之后按同样方法转接至含1.5 M的选择培养基上，最后再将菌液转移到含2 M甲醇的选择培养基中，重复驯化2次后，取0.2 ml菌液涂布在包含2 M甲醇的选择培养基平板上，37℃恒温培养，获取多形汉逊酵母Hansenula polymorphaAP23。

（4）摇瓶发酵筛选：

将步骤（3）获取的菌株AP23和原始菌株接入种子培养基扩大培养，培养温度37℃，100mL 三角瓶装液量20 mL，培养时间24 h。然后在发酵培养基中发酵，接种量10%（v/v），发酵温度37℃，1L三角瓶装液量200 mL，培养24h后，静置过夜，更换发酵培养基2，发酵时间72 h后检测各菌株的蛋白含量和赖氨酸含量如表1所示：

表1

实施例3

本实施例说明实施例2的多形汉逊酵母AP23的遗传稳定性测试，菌株传代发酵实验如下所示。

利用摇瓶发酵，检测突变株AP23的传代稳定性。菌株AP23传代发酵试验结果如表2所示：

表2菌株AP23传代发酵试验结果

从表中可以看出，经过7次传代，菌株AP23蛋白和赖氨酸含量稳定，传代稳定性良好。

实施例4

本实施例说明多形汉逊酵母AP23高效利用甲醇生产富含赖氨酸单细胞蛋白的应用。

其中，所使用的培养基配方：

（1）种子斜面培养基：酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂粉 20 g/L，其余为水。

（2）选择培养基：甲醇500 mM，硫酸铵1 g/L，磷酸二氢钾1 g/L，硫酸镁0.7 g/L，氯化钙0.4 g/L，酵母膏1 g/L，其余为水，pH自然。

（3）发酵培养基：85% 磷酸26.7 ml/L，二水硫酸钙0.93 g/L，硫酸钾18.2 g/L，二水硫酸镁14.9 g/L，氢氧化钾4.13 g/L，甘油30 g/L，微量元素溶液4 ml/L，水1 L；

所述的微量元素溶液为：五水硫酸铜6 g/L，碘化钾0.088 g/L，一水硫酸锰3 g/L，二水钼酸钠0.2 g/L，硼酸0.02 g/L，六水氯化钴0.5 g/L，氯化锌20 g/L，七水硫酸亚铁65 g/L，生物素0.2 g/L，质量浓度为98 %的浓硫酸5 ml/L，其余为水。

多形汉逊酵母AP23菌株在5 L发酵罐中高密度发酵生产甲醇蛋白的方法，步骤如下：

（1）种子的培养：将多形汉逊酵母AP23菌株用划线法接种至种子斜面培养基上，37℃培养48小时，取1支培养好的斜面种子，用3 mL无菌水将种子冲洗下来，接种至包含200 mL选择培养基的1 L三角瓶中，37℃，220 rpm振荡培养约24小时至OD=9-10。

（2）5 L发酵罐中高密度发酵：多形汉逊酵母AP23菌株在5 L发酵罐中采用发酵培养基进行菌体蛋白生产，其中，发酵培养基装液量为2L，121℃灭菌15 min，同时对接种管道、氨水及甲醇流加管道、取样口管道、空气过滤器进行灭菌，待发酵培养基降至37℃左右时，用氨水调节pH至5.0，加入种子液进行发酵，发酵温度为37℃，控制溶氧20%-60%，搅拌转速250-500 rpm；24小时后，培养基中甘油耗尽，开始流加甲醇，用气相监测甲醇浓度，使其控制在0.5%-2%之间，每8个小时取样测定菌体OD₆₀₀和湿重，96-100小时后，发酵结束，收集发酵液。随后将发酵液经离心机5000>

最终菌体湿重达到350-400 g/L，甲醇蛋白干重达到115-130 g/L，蛋白质含量达到68%，其中赖氨酸含量高达60 mg/g。