一种漆酶-TEMPO法制备丝胶蛋白膜的方法

摘要

本发明公开了一种漆酶‑TEMPO法制备丝胶蛋白膜的方法，以漆酶催化氧化丝胶中酪氨酸残基生成醌类活性基，引发丝胶分子间交联，再加入2,2,6,6‑四甲基哌啶‑氮‑氧化物(TEMPO)和聚赖氨酸，通过氧化丝胶中丝氨酸残基生成醛基，促进丝胶蛋白与聚赖氨酸交联，提高丝胶蛋白膜的成型效果和抗菌性能。具体步骤如下：(1)漆酶催化氧化丝胶分子交联；(2)漆酶‑TEMPO催化丝胶接枝聚赖氨酸；(3)丝胶蛋白膜成型；(4)丝胶蛋白膜醇化后处理。与传统化学交联法制备丝胶蛋白膜相比，本发明中漆酶和TEMPO催化聚赖氨酸接枝的效率高，生物酶处理条件缓和，丝胶蛋白膜成型效果较好，断裂强度和抗菌性能明显增加。

说明书

技术领域

本发明涉及一种漆酶-TEMPO法制备丝胶蛋白膜的方法，特别是一种先以漆酶催化氧化丝胶中酪氨酸残基，引发丝胶分子间交联，再加入2,2,6,6-四甲基哌啶-氮-氧化物(TEMPO)和聚赖氨酸，通过氧化丝胶中丝氨酸残基，促进丝胶蛋白与聚赖氨酸交联，提高丝胶蛋白膜的成型效果和抗菌性能，属于纺织生物技术领域。

背景技术

蚕丝由丝素和覆盖在丝素表面的丝胶两部分组成。其中，丝素蛋白呈线性结构，含较多非极性氨基酸；丝胶为球形蛋白，含较多亲水性氨基酸，以无规卷曲为主，几乎无α螺旋结构，分子结构较松散。在蚕丝脱胶过程中，丝胶溶解于热水，多作为废弃物直接排放到工业废水中，造成了极大的资源浪费和环境压力。丝胶中极性氨基酸残基较多，包括含醇羟基的丝氨酸和苏氨酸、含羧基的谷氨酸和天门冬氨酸、含酚羟基的酪氨酸和含氨基的赖氨酸等。研究表明，丝胶有多种生物活性，可清除活性氧物质、能抗紫外线和抑制黑色素生成，在日化领域有潜在应用。但另一方面，由于丝胶水溶性高，其成型难度较大，不同程度上制约了丝胶再生生物材料的制备及在更广领域的应用。为改善丝胶蛋白材料的成型效果，研究人员采用与其他高分子共混、物理包埋或化学交联(如戊二醛、京尼平等)等方法，制备丝胶基生物材料。其中，化学交联法效率较高，能有效提高丝胶成型性，但也存在一定的不足，如部分交联剂残留会使丝胶材料的生物相容性下降。与之相比，生物酶法具有安全、高效、专一和环境友好等优点，符合生态加工的要求。因此，若借助生物酶进行丝胶改性，通过催化丝胶分子交联降低其水溶性，提高丝胶材料的成型效果，同时催化丝胶接枝外源功能性氨基化合物，还可进一步提升丝胶蛋白材料的应用性能。

对丝胶有作用功效的生物酶品种较多，其中漆酶作为一种多酚氧化酶，不仅能单独催化氧化丝胶中的酪氨酸残基，还可与特殊介体2,2,6,6-四甲基哌啶-氮-氧化物(TEMPO)组成氧化体系，催化丝胶中丝氨酸残基生成反应性醛基。根据漆酶的这一特性，在丝胶蛋白膜制备中，采用如下分步法进行：

第一步，先以漆酶处理丝胶，通过催化氧化丝胶中酪氨酸的酚羟基产生醌类活性基，并与丝胶中氨基反应，引发丝胶分子间交联，增加丝胶蛋白的分子量；

第二步，再在体系中加入TEMPO和聚赖氨酸，通过漆酶-TEMPO体系氧化丝胶中丝氨酸的醇羟基，产生反应性醛基，并与聚赖氨酸的氨基或丝胶分子上的游离氨基发生席夫碱反 应，在提高丝胶分子量和蛋白膜成型效果的同时，还能通过接枝聚赖氨酸，赋予丝胶蛋白膜抗菌性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种漆酶-TEMPO法制备丝胶蛋白膜的方法，旨在改善丝胶材料的成型效果，提高其抗菌性能，拓展丝胶材料的应用。

为解决上述技术问题，本发明先以漆酶催化氧化丝胶中酪氨酸残基，生成醌类活性基，引发丝胶分子间交联，再加入TEMPO和聚赖氨酸，通过氧化丝胶中丝氨酸残基生成醛基，促进丝胶蛋白与聚赖氨酸交联，提高丝胶蛋白膜的成型效果和抗菌性能，具体工艺和步骤如下：

(1)漆酶催化氧化丝胶分子交联：在丝胶溶液中添加漆酶，其中丝胶5～50g/L，漆酶5～50U/mL，处理温度30～60℃，pH 4.0～7.0，时间0.5～10小时；

(2)漆酶-TEMPO催化丝胶接枝聚赖氨酸：在步骤(1)体系中加入TEMPO至2～50g/L，聚赖氨酸2～20g/L，在30～60℃，pH 4.0～7.0条件下处理2～24小时；

(3)丝胶蛋白膜成型：取步骤(2)反应后溶液，通过延流使其在聚四氟乙烯模具内平整铺展，在20～50℃条件下风干成膜，或在-50℃～-20℃条件下真空冷冻干燥成膜；

(4)丝胶蛋白膜醇化后处理：将步骤(3)处理后丝胶蛋白膜浸渍在50～80％(v/v)的乙醇溶液中，在20～25℃处理0.5～2小时，然后在20～50℃条件下烘干。

一种漆酶-TEMPO法制备丝胶蛋白膜的方法，所述丝胶包括来源于桑蚕丝或柞蚕丝，并借助纯碱法、皂碱法、蛋白酶法或100～125℃高温法获取的丝胶；所述漆酶来源于动物、植物或微生物；所述聚赖氨酸包括不同分子量的ε-聚赖氨酸或α-聚赖氨酸。

本发明借助于漆酶、TEMPO和聚赖氨酸，通过漆酶催化氧化丝胶，引发丝胶分子间交联，结合TEMPO体系氧化丝胶中丝氨酸残基接枝聚赖氨酸，制备具有抗菌效果的丝胶蛋白膜。与传统化学交联法制备丝胶蛋白膜相比，本发明具有以下优点：

(1)漆酶和TEMPO催化效率高，漆酶不仅可单独催化氧化丝胶中酪氨酸残基，引发丝胶自交联，而且可通过漆酶-TEMPO体系氧化丝胶中的丝氨酸产生醛基，促进含氨基的聚赖氨酸在丝胶蛋白分子表面接枝，提高了丝胶蛋白膜的成型效果；

(2)生物酶处理条件缓和，在低温和近中性条件下进行丝胶蛋白漆酶催化改性加工，具有能耗低、处理工艺安全的优点，避免了化学交联法反应易造成环境污染、丝胶易产生蛋白变性等诸多方面的缺陷；

(3)丝胶蛋白经漆酶处理、漆酶-TEMPO催化接枝聚赖氨酸后，其丝胶蛋白膜的水溶性 显著下降，成型效果改善，结合催化接枝聚赖氨酸后，丝胶膜机械强力增加，抗菌性能也得到提高。

具体实施方式

采用漆酶、TEMPO和聚赖氨酸制备丝胶蛋白膜，具体实施例如下：

实施例1

采用桑蚕丝经纯碱法脱胶后得到的丝胶，以本发明述及的方法制备丝胶蛋白膜，具体工艺步骤如下：

(1)漆酶催化氧化丝胶分子交联：在丝胶溶液中添加漆酶，其中丝胶20g/L，漆酶5U/mL，处理温度45℃，pH 5，时间2小时；

(2)漆酶-TEMPO催化丝胶接枝聚赖氨酸：在步骤(1)体系中加入TEMPO至10g/L，ε-聚赖氨酸(分子量3000)5g/L，在45℃，pH 5条件下处理12小时；

(3)丝胶蛋白膜成型：取步骤(2)反应后溶液，通过延流使其在聚四氟乙烯模具内平整铺展，在30℃条件下风干成膜；

(4)丝胶蛋白膜醇化后处理：将步骤(3)处理后丝胶蛋白膜浸渍在60％(v/v)的乙醇溶液中，在25℃处理0.5小时，然后在30℃条件下烘干。

试样1：丝胶未经漆酶、TEMPO和ε-聚赖氨酸处理，仅经丝胶蛋白膜成型和醇化后处理；

试样2：丝胶仅以漆酶处理，然后经丝胶蛋白膜成型和醇化后处理；

试样3：经步骤(1)、(2)、(3)和(4)；

经上述工艺处理后，分别测定丝胶蛋白膜试样1～3的热水溶失率(30℃水中浸渍1小时)、试样断裂强度、对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌率；结果表明，试样1的热水溶失率为39.0％，断裂强度为4.1MPa，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌率分别为10％和8％；试样2的热水溶失率为12.1％，断裂强度为4.9MPa，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌率分别为8％和9％；试样3的热水溶失率为7.5％，断裂强度为7.8MPa，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌率分别为95％和96％。

实施例2

采用桑蚕丝经120℃条件下脱胶后得到的丝胶，以本发明述及的方法制备丝胶蛋白膜，具体工艺步骤如下：

(1)漆酶催化氧化丝胶分子交联：在丝胶溶液中添加漆酶，其中丝胶25g/L，漆酶15U/mL，处理温度50℃，pH 5.5，时间2小时；

(2)漆酶-TEMPO催化丝胶接枝聚赖氨酸：在步骤(1)体系中加入TEMPO至12.5g/L， ε-聚赖氨酸(分子量3600)7.5g/L，在50℃，pH 5.5条件下处理10小时；

(3)丝胶蛋白膜成型：取步骤(2)反应后溶液，通过延流使其在聚四氟乙烯模具内平整铺展，在-50℃条件下真空冷冻干燥成膜；

(4)丝胶膜醇化后处理：将步骤(3)处理后的丝胶蛋白膜浸渍在65％(v/v)的乙醇溶液中，在25℃醇化处理1小时，然后在30℃条件下烘干。

试样4：未经漆酶、TEMPO和ε-聚赖氨酸处理，仅经丝胶蛋白膜成型；

试样5：未经漆酶、TEMPO和ε-聚赖氨酸处理，仅经丝胶蛋白膜成型和醇化后处理；

试样6：丝胶仅以漆酶处理，然后经丝胶蛋白膜成型和醇化后处理；；

试样7：经步骤(1)、(2)、(3)和(4)；

经上述工艺处理后，分别测定丝胶蛋白膜试样4～7的热水溶失率(30℃水中浸渍1小时)、断裂强度、对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌率。结果表明，试样4的热水溶失率为80.3％，断裂强度为1.9MPa，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌率分别为2％和5％；试样5的热水溶失率为42.6％，断裂强度为4.1MPa，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌率分别为5％和4％；试样6的热水溶失率为10.5％，断裂强度为5.2MPa，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌率分别为7％和6％；试样7的热水溶失率为6.8％，断裂强度为7.1MPa，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌率分别为94％和97％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。