能够结合CD123和CD3的双特异性单价双抗体及其用途

摘要

本发明涉及序列‑优化的能够同时结合CD123和CD3的CD123 x CD3双特异性单价双抗体，并且涉及这种双抗体在血液恶性肿瘤治疗中的用途。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求美国专利申请号61/869,510(2013年8月23日提交；未决)、61/907,749(2013年11月22日提交；未决)、和61/990,475(2014年5月8日提交；未决)以及欧洲专利申请号13198784(2013年12月20日提交)的优先权，其每一篇申请均通过参考以其整体并入本文。

序列表的引用

根据37C.F.R.1.821以及下面的条款，本申请包括一个或多个序列表，所述序列表以纸质或者计算机可读介质的形式公开，并且通过引用将所述纸质公开和计算机可读公开以其整体并入本文。

背景技术

技术领域

本发明涉及能够同时结合CD123和CD3的CD123 x CD3双特异性单价双抗体，并且涉及这种分子在治疗血液恶性肿瘤中的用途。

相关技术的描述

I.CD123

CD123(白介素3受体α，IL-3Ra)是40kDa的分子，并且是白介素3受体复合物的一部分(Stomski，F.C.等(1996)“Human Interleukin-3(IL-3)Induces Disulfide-Linked IL-3 Receptor Alpha-And Beta-Chain Heterodimerization，Which Is Required ForReceptor Activation But Not High-Affinity Binding”,Mol.Cell.Biol.16(6):3035-3046)。白介素3(IL-3)驱动多能干细胞早期分化成祖红细胞、骨髓祖细胞和淋巴祖细胞。CD123在CD34+定型祖先上表达(Taussig,D.C.等(2005)髓细胞样“Hematopoietic StemCells Express Mutiple Myeloid Leukemia:Implications For The Origin AndTargeted Therapy Of Acute Myeloid Leukemia”,Blood 106:4086-4092)，但是不是通过CD34+/CD38正常的造血干细胞被表达。CD123由嗜碱性粒细胞、肥大细胞、浆细胞样树突细胞表达，单核细胞、巨噬细胞和嗜伊红粒细胞表达一些，而嗜中性粒细胞和巨核细胞表达低或不表达。一些非造血组织(胎盘、睾丸间质细胞，某些脑细胞成分和一些内皮细胞)表达CD123；但是表达大部分是细胞质的。

据报道，CD123由白血病胚细胞和白血病干细胞(LSC)表达(Jordan，C.T.等(2000)“The Interleukin-3 Receptor Alpha Chain Is A Unique Marker For Human AcuteMyelogenous Leukemia Stem Cells”,Leukemia 14:1777-1784；Jin，W.等(2009)“Regulation Of Th17 Cell Differentiation And EAE Induction By MAP3K NIK)”,Blood 113:6603-6610)(图1)。在人正常前体群体中，CD123由造血祖细胞(HPC)的亚型表达，而不被正常造血干细胞(HSC)表达。CD123也被浆细胞样树突细胞(pDC)和嗜碱性粒细胞表达，并且，以较低的程度，被单核细胞和嗜伊红粒细胞表达(Lopez，A.F.等(1989)“Reciprocal Inhibition Of Binding Between Interleukin 3And Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor To Human Eosinophils,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)86:7022-7026；Sun，Q.等(1996)“Monoclonal Antibody7G3 Recognizes The N-Terminal Domain Of The Human Interleukin-3(IL-3)ReceptorAlphaChain And Functions As A Specific IL-3 Receptor Antagonist”,Blood 87:83-92；L.等(2001)“Interleukin-3 Receptor Alpha Chain(CD123)Is WidelyExpressed In Hematologic Malignancies“,Haematologica 86(12):1261-1269；Masten，B.J.等(2006)“Characterization Of Myeloid And Plasmacytoid Dendritic Cells InHuman Lung”,J.Immunol.177:7784-7793；Korpelainen，E.I.等(1995)“Interferon-GammaUpregulates Interleukin-3(IL-3)Receptor Expression In Human Endothelial CellsAnd Synergizes With IL-3 In Stimulating Major Histocompatibility ComplexClass II Expression And Cytokine Production.”Blood 86:176-182)。

已经报道CD123在大范围的血液恶性肿瘤的恶性细胞上过表达，所述血液恶性肿瘤包括急性髓细胞样白血病(AML)和骨髓增生异常综合征(MDS)(L.等(2001)“Interleukin-3 Receptor Alpha Chain(CD123)Is Widely Expressed In HematologicMalignancies”,Haematologica 86(12):1261-1269)。CD123的过表达与AML更差的预后相关(Tettamanti，M.S.等(2013)“Targeting Of Acute Myeloid Leukaemia By Cytokine-Induced Killer Cells Redirected With A Novel CD123-Specific Chimeric AntigenReceptor,”Br.J.Haematol.161:389-401)。

认为AML和MDS源自小量的白血病干细胞(LSC)并通过该小量的白血病干细胞(LSC)而得以长期存在，所述白血病干细胞一般是静息的(即，不快速分裂的细胞)，所以抗细胞死亡(细胞凋亡)和常规的化疗剂。LSC特征在于高水平的CD123表达，这不存在于正常人骨髓中相应的正常造血干细胞群体中(Jin，W.等(2009)“Regulation Of Th17 Celldifferentiation And EAE Induction By MAP3K NIK”,Blood 113:6603-6610；Jordan，C.T.等(2000)“The Interleukin-3Receptor Alpha Chain Is A Unique Marker ForHuman Acute Myelogenous Leukemia Stem Cells”,Leukemia 14:1777-1784)。CD123在45％-95％的AML、85％的毛细胞性白血病(HCL)、和40％的急性B成淋巴细胞白血病(B-ALL)中表达。CD123表达也与多种其他恶性肿瘤/前恶性肿瘤(pre-malignancies)相关：慢性髓细胞样白血病(CML)祖细胞(包括胚细胞危象(crisis)CML)、霍奇金里德-斯泰伯格氏(Hodgkin’s Reed Sternberg)(RS)细胞、转化的非霍奇金淋巴瘤(NHL)、一些慢性淋巴细胞性白血病(CLL)(CD11c+)、急性T成淋巴细胞白血病(T-ALL)的亚型(16％，大部分是不成熟的，大部分是成人型(adult))、浆细胞样树突细胞(pDC)(DC2)恶性肿瘤和CD34+/CD38-骨髓增生异常综合征(MDS)髓细胞恶性肿瘤。

AML是一种克隆性(clonal disease)疾病，特征在于骨髓中转化的髓样祖细胞的增殖和积聚，其最终导致造血功能障碍。AML的发病率随着年龄而增加，并且年长患者通常比年轻患者具有更差的治疗结果(Robak,T.等(2009)“Current And Emerging TherapiesFor Acute Myeloid Leukemia”,Clin.Ther.2:2349-2370)。不幸地是，目前，大部分患有AML的成人因他们所患的疾病而死亡。

AML的治疗起初集中在诱导缓解(诱导疗法)。一旦实现缓解，治疗转为致力于巩固这种缓解(缓解后或巩固疗法)，并且在一些情况下，转为维持疗法。针对AML的标准缓解诱导范例是用蒽环类抗生素/阿糖胞苷组合化疗，随后巩固化疗(通常用更高剂量的药物，所述药物与在诱导期间使用的药物相同)或人干细胞移植，这取决于患者耐受强化治疗的能力和单独用化疗治愈的可能性(见，例如，Roboz，G.J.(2012)““Current Treatment OfAcute Myeloid Leukemia,”Curr.Opin.Oncol.24:711-719)。

诱导疗法中频繁使用的剂包括阿糖胞苷和蒽环类抗生素。阿糖胞苷，也称为AraC，通过干扰DNA合成而杀死癌症细胞(和其他快速分裂的正常细胞)。与AraC治疗相关的副作用包括对感染的抗性降低，白细胞产量减少的结果；由于血小板产量减少而出血；和由于红细胞的潜在减少而贫血。其他副作用包括恶心和呕吐。蒽环类抗生素(例如，柔红霉素、多柔比星和伊达比星)具有数个作用模式，包括抑制DNA和RNA合成、破坏DNA更高级结构，和产生损伤细胞的氧自由基。蒽环类抗生素最重要的不利作用是心脏毒性，其相当限制施用的终身剂量和一定程度上限制它们的有用性。

因此，不幸地是，尽管在治疗新诊断的AML中的实质性进步，但是20％至40％的患者未通过标准诱导化学疗法实现缓解，并且50％至70％的进入首次完全缓解期的患者预期在3年内复发。复发时或针对患有抗性疾病的患者的最佳策略仍不确定。干细胞移植已经证实作为处于首次或随后缓解期的AML患者中最有效的抗白血病治疗形式(Roboz，G.J。(2012)“Current Treatment Of Acute Myeloid Leukemia”,Curr.Opin.Oncol.24:711-719)。

II.CD3

CD3是由四条不同的链组成的T细胞共受体(Wucherpfennig，K.W.等(2010)“Structural Biology Of The T-Cell Receptor:Insights Into Receptor Assembly，Ligand Recognition，And Initiation Of Signaling,”Cold SpringHarb.Perspect.Biol.2(4):a005140；1-14页)。哺乳动物中，该复合物包含CD3γ链、CD3δ链和两条CD3ε链。这些链结合称为T细胞受体(TCR)的分子，以便在T淋巴细胞中产生活化信号。在没有CD3的情况下，TCR不能适当装配并且降解(Thomas，S.等(2010)“MolecularImmunology Lessons From Therapeutic T-Cell Receptor Gene Transfer”,Immunology129(2):170–177)。发现CD3结合所有成熟T细胞的膜，并且实际上不结合其他细胞类型的膜(见，Janeway，C.A.等(2005):“Immunobiology:The Immune System In Health AndDisease”,第六版Garland Science Publishing，NY，214-216页；Sun，Z.J.等(2001)“Mechanisms Contributing To T Cell Receptor Signaling And Assembly RevealedBy The Solution Structure Of An Ectodomain Fragment Of CD3ε:γ Heterodimer”,Cell 105(7):913-923；Kuhns，M.S.等(2006)“Deconstructing The Form And FunctionOf The TCR/CD3Complex”,Immunity，2006年2月；24(2):133-139)。

III.双特异性双抗体

完整的未修饰的抗体(例如，IgG)结合抗原的抗原决定部位(表位)的能力取决于免疫球蛋白轻链和重链上存在的可变结构域(即，分别是VL和VH结构域)。双抗体的设计基于单链Fv构建体(scFv)(见，例如，Holliger等(1993)“Diabodies’:Small Bivalent AndBispecific Antibody Fragments”,Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)90:6444-6448；US2004/0058400(Hollinger等)；US 2004/0220388(Mertens等)；Alt等(1999)FEBS Lett.454(1-2):90-94；Lu，D.等(2005)“A Fully Human Recombinant IgG-Like BispecificAntibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-LikeGrowth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,”J.Biol.Chem.280(20):19665-19672；WO 02/02781(Mertens等)；Olafsen，T.等(2004)“Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And RadiolabelingFor Tumor Targeting Applications,”Protein Eng.Des.Sel.17(1):21-27；Wu，A.等(2001)“Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single Chain Fv-Fv FusionProtein Is Mediated Through Variable Domain Exchange,”Protein Engineering 14(2):1025-1033；Asano等(2004)“A Diabody For Cancer Immunotherapy And ItsFunctional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain,”摘要3P-683，J.Biochem.76(8):992；Takemura，S.等(2000)“Construction Of A Diabody(Small RecombinantBispecific Antibody)Using A Refolding System,”Protein Eng.13(8):583-588；Baeuerle，P.A.等(2009)“Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For CancerTherapy,”Cancer Res.69(12):4941-4944)。

抗体轻链和抗体重链的相互作用，特别是其VL和VH结构域的相互作用形成抗体的抗原决定部位结合位点之一。相反，scFv构建体包括单个多肽链中包含的抗体的VL和VH结构域，其中结构域由足够长度的灵活接头分开，以允许两个结构域自装配成功能性抗原决定部位结合位点。在VL和VH结构域的自装配由于不足够长(小于约12个氨基酸残基)的接头而变得不可能的情况下，两个scFv构建体彼此相互作用以形成二价分子，其中一条链的VL结合另一条链的VH(在Marvin等(2005)“Recombinant Approaches To IgG-LikeBispecific Antibodies,”Acta Pharmacol.Sin.26:649-658中被论述)。

天然抗体仅仅能够结合一个抗原决定部位种类(即，单特异性)，虽然它们可结合该种类的多个拷贝(即，展示二价或多价)。现有技术已经指出了产生这样的双抗体的能力，所述双抗体与这类天然抗体的不同之处在于能够结合两个或更多个不同的抗原决定部位种类(即，展示双特异性或多特异性，以及二价或多价)(见，例如，Holliger等(1993)“‘Diabodies’:Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)90:6444-6448；US 2004/0058400(Hollinger等)；US 2004/0220388(Mertens等)；Alt等(1999)FEBS Lett.454(1-2):90-94；Lu，D.等(2005)“A FullyHuman Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal GrowthFactor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For EnhancedAntitumor Activity,”J.Biol.Chem.280(20):19665-19672；WO 02/02781(Mertens等)；Mertens，N.等，“New Recombinant Bi-and Trispecific Antibody Derivatives,”In:Novel Frontiers In The Production Of Compounds For Biomedical Use,A.VanBroekhoven等(Eds.)，Kluwer Academic Publishers，Dordrecht，Netherlands(2001)，195-208页；Wu，A.等(2001)“Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20SingleChain Fv-Fv Fusion Protein Is Mediated Through Variable Domain Exchange,”Protein Engineering 14(2):1025-1033；Asano等(2004)“A Diabody For CancerImmunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain,”摘要3P-683，J.Biochem.76(8):992；Takemura，S.等(2000)“Construction Of A Diabody(Small Recombinant Bispecific Antibody)Using A Refolding System,”ProteinEng.13(8):583-588；Baeuerle，P.A.等(2009)“Bispecific T-Cell Engaging AntibodiesFor Cancer Therapy,”Cancer Res.69(12):4941-4944)。

非单特异性双抗体的供应提供明显的优势：共连接和共定位表达不同抗原决定部位的细胞的能力。双特异性双抗体因此具有广泛的应用，包括治疗和免疫诊断。双特异性使得在各种应用中设计和改造双抗体的具有很大的灵活性，提供对多聚抗原增强的亲和力、不同抗原的交联和依赖于存在两个靶抗原的引导靶向特异性细胞类型。由于它们的价增加、解离速率低和从循环中快速清除(对于～50kDa或低于～50kDa的小尺寸的双抗体)，本领域已知的双抗体分子在肿瘤成像领域中也显示特定的应用(Fitzgerald等(1997)“Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed InPichiapastoris,”Protein Eng.10:1221)。尤其重要的是共连接不同的细胞，例如，使细胞毒性T细胞与肿瘤细胞交联(Staerz等(1985)“Hybrid Antibodies Can Target Sites ForAttack By T Cells,”Nature 314:628-631，和Holliger等(1996)“Specific Killing OfLymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody,”ProteinEng.9:299-305)。

双抗体抗原决定部位结合结构域也可导向任何免疫效应细胞的表面决定簇，所述效应细胞比如CD3、CD16、CD32或CD64，所述结合结构域在T淋巴细胞、天然杀伤(NK)细胞或其他单核细胞上表达。在许多研究中，也发现结合效应细胞决定簇，例如，Fcγ受体(FcγR)的双抗体激活效应细胞(Holliger等(1996)“Specific Killing Of Lymphoma Cells ByCytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody,”Protein Eng.9:299-305；Holliger等(1999)“Carcinoembryonic Antigen(CEA)-Specific T-cell Activation InColon Carcinoma Induced By Anti-CD3 x Anti-CEA Bispecific Diabodies And B7 xAnti-CEA Bispecific Fusion Proteins,”Cancer Res.59:2909-2916；WO 2006/113665；WO 2008/157379；WO 2010/080538；WO 2012/018687；WO 2012/162068)。通常，效应细胞活化通过结合抗原的抗体经Fc-FcγR相互作用与效应细胞的结合而触发；因此，就此而言，双抗体分子可展示Ig样功能性，无论它们是否包括Fc结构域(例如，如本领域已知的或本文示例的任何效应器功能试验(例如，ADCC试验)所验证的)。通过交联肿瘤和效应细胞，双抗体不仅仅使效应细胞接近肿瘤细胞，而且导致有效的肿瘤杀伤(见例如，Cao等(2003)“Bispecific Antibody Conjugates In Therapeutics,”Adv.Drug.Deliv.Rev.55:171-197)。

但是，上述优势是以高成本为代价的。形成此类非单特异性双抗体需要成功装配两个或更多个独特且不同的多肽(即，这种形成需要通过不同多肽链种类的异源二聚化形成双抗体)。该事实与通过相同多肽链的同源二聚化形成的单特异性双抗体形成对比。因为必须提供至少两条不同的多肽(即，两个多肽种类)以便形成非单特异性双抗体，和因为这种多肽的同源二聚化导致失活的分子(Takemura，S.等(2000)“Construction Of ADiabody(Small Recombinant Bispecific Antibody)Using A Refolding System,”Protein Eng.13(8):583-588)，所以产生这种多肽必须以防止相同种类的多肽之间共价键合的方式完成(即，为了预防同源二聚化作用)(Takemura，S.等(2000)“Construction Of ADiabody(Small Recombinant Bispecific Antibody)Using A Refolding System,”Protein Eng.13(8):583-588)。所以，现有技术已经教导了这种多肽的非共价结合(见，例如，Olafsen等(2004)“Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications,”Prot.Engr.Des.Sel.17:21-27；Asano等(2004)“A Diabody For Cancer ImmunotherapyAnd Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain,”摘要3P-683，J.Biochem.76(8):992；Takemura，S.等(2000)“Construction Of A Diabody(SmallRecombinant Bispecific Antibody)Using A Refolding System,”Protein Eng.13(8):583-588；Lu，D.等(2005)“A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific AntibodyTo Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like GrowthFactor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,”J.Biol.Chem.280(20):19665-19672)。

但是，现有技术已经认识到由非共价结合的多肽组成的双特异性双抗体不稳定并且容易解离成非功能单体(见，例如，Lu，D.等(2005)“A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And TheInsulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,”J.Biol.Chem.280(20):19665-19672)。

在面临该挑战的时候，现有技术已经成功开发了稳定的共价结合的异源二聚非单特异性双抗体(见，例如，WO 2006/113665；WO/2008/157379；WO 2010/080538；WO 2012/018687；WO/2012/162068；Johnson，S.等(2010)“Effector Cell Recruitment With NovelFv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor CytolysisAnd In Vivo B-Cell Depletion,”J.Molec.Biol.399(3):436-449；Veri，M.C.等(2010)“Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma ReceptorIIb(CD32B)Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold,”Arthritis Rheum.62(7):1933-1943；Moore，P.A.等(2011)“Application Of DualAffinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell KillingOf B-Cell Lymphoma,”Blood 117(17):4542-4551)。此类方法涉及将一个或多个半胱氨酸残基改造到每个采用的多肽种类中。例如，已经显示将半胱氨酸残基添加至这种构建体的C-末端允许在多肽链之间形成二硫键合，使所得异源二聚物稳定，而不干扰二价分子的结合特征。

尽管有样的成功，但是稳定的功能性异源二聚非单特异性双抗体的产生可以通过仔细考虑和在一个或多个采用的多肽链中布置半胱氨酸残基而得到进一步优化。可以以更高的产率产生这种优化的双抗体，并且活性比非优化的双抗体更高。因此，本发明涉及提供多肽的问题，所述多肽尤其被设计和优化以形成异源二聚双抗体。本发明通过提供示例性的优化CD123 x CD3双抗体解决了该问题。

发明内容

本发明涉及CD123 x CD3双特异性双抗体，其能够同时结合CD123和CD3，并且涉及这种分子在治疗疾病，尤其是血液恶性肿瘤中的用途。

本发明的CD123 x CD3双特异性双抗体包括至少两条不同的多肽链，其彼此以异源二聚方式结合以形成对CD123的抗原决定部位特异的一个结合位点和对CD3抗原决定部位特异的一个结合位点。因此，本发明的CD123 x CD3双抗体是单价的，在于其仅仅能够结合一个拷贝的CD123的抗原决定部位和仅仅能够结合一个拷贝的CD3的抗原决定部位，但是是双特异性的，在于单个双抗体能够同时结合CD123的抗原决定部位和结合CD3的抗原决定部位。双抗体的各个多肽链彼此共价结合，例如通过位于每条多肽链内的半胱氨酸残基的二硫键合。在具体的实施方式中，本发明的双抗体进一步具有免疫球蛋白Fc结构域或白蛋白结合结构域以延长体内半衰期。

具体地，本发明也提供了序列-优化的CD123 x CD3双特异性单价双抗体，其能够特异性结合CD123的抗原决定部位和结合CD3的抗原决定部位，其中双抗体包括彼此共价结合的第一多肽链和第二多肽链，其中：

A.第一多肽链在从N-末端至C-末端方向上包括：

i.结构域1，其包括：

(1)亚结构域(1A)，其包括能够结合CD3的单克隆抗体的VL结构域(VL_CD3)(SEQ>

(2)亚结构域(1B)，其包括能够结合CD123的单克隆抗体的VH结构域(VH_CD123)(SEQID>

其中亚结构域1A和1B彼此通过肽接头(连接体，linker)(SEQ ID NO:29)分开；

ii.结构域2，其中结构域2是E-螺旋(coil)结构域(SEQ ID NO:34)或K-螺旋结构域(SEQ ID NO:35)，其中结构域2通过肽接头(SEQ ID NO:30)与结构域1分开；和

B.第二多肽链在从N-末端至C-末端方向上包括：

i.结构域1，其包括：

(1)亚结构域(1A)，其包括能够结合CD123的单克隆抗体的VL结构域(VL_CD123)(SEQID>

(2)亚结构域(1B)，其包括能够结合CD3的单克隆抗体的VH结构域(VH_CD3)(SEQ>

其中亚结构域1A和1B彼此通过肽接头(SEQ ID NO:29)分开；

ii.结构域2，其中结构域2是K-螺旋结构域(SEQ ID NO:35)或E-螺旋结构域(SEQID NO:34)，其中结构域2通过肽接头(SEQ ID NO:30)与结构域1分开；和其中第一和第二多肽链的结构域2不都是E-螺旋结构域或不都是K-螺旋结构域；

和其中：

(a)所述第一多肽链的所述VL结构域和所述第二多肽链的所述VH结构域形成抗原结合结构域，其能够特异性结合CD3的抗原决定部位；和

(b)所述第二多肽链的所述VL结构域和所述第一多肽链的所述VH结构域形成抗原结合结构域，其能够特异性结合CD123的抗原决定部位。

本发明也提供非序列-优化的CD123 x CD3双特异性单价双抗体，其能够特异性结合CD123的抗原决定部位和结合CD3的抗原决定部位，其中双抗体包括彼此共价结合的第一多肽链和第二多肽链，其中：

A.第一多肽链在从N-末端至C-末端方向上包括：

i.结构域1，其包括：

(1)亚结构域(1A)，其包括能够结合CD3的单克隆抗体的VL结构域(VL_CD3)(SEQ>

(2)亚结构域(1B)，其包括能够结合CD123的单克隆抗体的VH结构域(VH_CD123)(SEQID>

其中亚结构域1A和1B彼此通过肽接头(SEQ ID NO:29)分开；

ii.结构域2，其中结构域2是E-螺旋结构域(SEQ ID NO:34)或K-螺旋结构域(SEQID NO:35)，其中结构域2通过肽接头(SEQ ID NO:30)与结构域1分开；和

B.第二多肽链在从N-末端至C-末端方向上包括：

i.结构域1，其包括：

(1)亚结构域(1A)，其包括能够结合CD123的单克隆抗体的VL结构域(VL_CD123)(SEQID>

(2)亚结构域(1B)，其包括能够结合CD3的单克隆抗体的VH结构域(VH_CD3)(SEQ>

其中亚结构域1A和1B彼此通过肽接头(SEQ ID NO:29)分开；

ii.结构域2，其中结构域2是K-螺旋结构域(SEQ ID NO:35)或E-螺旋结构域(SEQID NO:34)，其中结构域2通过肽接头(SEQ ID NO:30)与结构域1分开；和其中第一和第二多肽链的结构域2不都是E-螺旋结构域或不都是K-螺旋结构域；

和其中：

(a)所述第一多肽链的所述VL结构域和所述第二多肽链的所述VH结构域形成抗原结合结构域，其能够特异性结合CD3的抗原决定部位；和

(b)所述第二多肽链的所述VL结构域和所述第一多肽链的所述VH结构域形成抗原结合结构域，其能够特异性结合CD123的抗原决定部位。

本发明另外提供上述双特异性单价双抗体的实施方式，其中第一或第二多肽链另外包括白蛋白结合结构域(SEQ ID NO:36)，其经肽接头(SEQ ID NO:31)C-末端连接至结构域2或N-末端连接至结构域1。

本发明另外提供上述双特异性单价双抗体的实施方式，其中第一或第二多肽链另外包括结构域3，其包括免疫球蛋白IgG Fc结构域的CH2和CH3结构域(SEQ ID NO:37)，其中结构域3经肽接头(SEQ ID NO:33)N-末端连接至结构域1A。

本发明另外提供上述双特异性单价双抗体的实施方式，其中第一或第二多肽链另外包括结构域3，其包括免疫球蛋白IgG Fc结构域的CH2和CH3结构域(SEQ ID NO:37)，其中结构域3经肽接头(SEQ ID NO:32)C-末端连接至结构域2。

本发明另外提供任何上述双特异性单价双抗体的实施方式，其中第一多肽链的结构域2是K-螺旋结构域(SEQ ID NO:35)和第二多肽链的结构域2是E-螺旋结构域(SEQ IDNO:34)。

本发明另外提供任何上述双特异性单价双抗体的实施方式，其中第一多肽链的结构域2是E-螺旋结构域(SEQ ID NO:34)和第二多肽链的结构域2是K-螺旋结构域(SEQ IDNO:35)。

本发明另外提供双特异性单价双抗体的实施方式，其能够特异性结合CD123的抗原决定部位和结合CD3的抗原决定部位，其中双抗体包括彼此共价结合的第一多肽链和第二多肽链，其中所述双特异性双抗体包括：

A.第一多肽链，具有氨基酸序列SEQ ID NO:1；和

B.第二多肽链，具有氨基酸序列SEQ ID NO:3；

其中所述第一和所述第二多肽链通过二硫键彼此共价结合。

本发明的双抗体展示出人意料的增强的功能活性，如下进一步描述。

本发明的双抗体优选地能够与人和灵长类CD123和CD3蛋白，优选食蟹猴(cynomolgus monkey)CD123和CD3蛋白交叉反应。

在体外细胞基试验中，本发明的双抗体优选地能够消耗来自初级PBMC培养物的浆细胞样树突细胞(pDC)，IC50为约1ng/ml或更小，约0.8ng/ml或更小，约0.6ng/ml或更小，约0.4ng/ml或更小，约0.2ng/ml或更小，约0.1ng/ml或更小，约0.05ng/ml或更小，约0.04ng/ml或更小，约0.03ng/ml或更小，约0.02ng/ml或更小或约0.01ng/ml或更小。优选地，IC50是约0.01ng/ml或更小。在上述试验中，初级PBMC的培养物可来自食蟹猴，在该情况下所述消耗是食蟹猴浆细胞样树突细胞(pDC)的消耗。任选地，如上所述，本发明的双抗体能够消耗来自PBMC原代培养物的浆细胞样树突细胞(pDC)，其中试验通过或根据本文所述实施例14的方案进行，或通过本领域技术人员理解的对这种试验的改进而进行，或通过本领域技术人员已知的其他方式进行。

本发明的双抗体优选地在体外Kasumi-3试验中展示细胞毒性，EC50为约0.05ng/ml或更小。优选地，EC50是约0.04ng/ml或更小，约0.03ng/ml或更小，约0.02ng/ml或更小，或约0.01ng/ml或更小。任选地，如上所述，本发明的双抗体可展示细胞毒性，其中试验通过或根据如本文描述的实施例3的方案进行，或通过本领域技术人员理解的对这种试验的改进而进行，或通过本领域技术人员已知的其他方式进行。

本发明的双抗体优选地在体外Molm-13试验中展示细胞毒性，EC50为约5ng/ml或更小。优选地，EC50是约3ng/ml或更小，约2ng/ml或更小，约1ng/ml或更小，约0.75ng/ml或更小，或约0.2ng/ml或更小。任选地，如上所述，本发明的双抗体可展示细胞毒性，其中试验通过或根据如本文描述的实施例3的方案进行，或通过本领域技术人员理解的这种试验的改进而进行，或通过本领域技术人员已知的其他方式进行。

本发明的双抗体优选地能够抑制小鼠中MOLM-13肿瘤异种移植物的生长。优选地，本发明的双抗体能够以下述浓度抑制小鼠中MOLM-13肿瘤异种移植物的生长，所述浓度为至少约20μg/kg，至少约4μg/kg，至少约0.8μg/kg，至少约0.6μg/kg或至少约0.4μg/kg。本发明优选的抗体在一段时间之后将抑制小鼠中MOLM-13肿瘤异种移植物的生长至少25％，但是可能至少约40％或更多，至少约50％或更多，至少约60％或更多，至少约70％或更多，至少约80％或更多，至少约90％或更多，或甚至完全抑制MOLM-13肿瘤生长，或造成肿瘤退化或消失。该抑制将发生在至少NSG小鼠品系中。任选地，本发明的双抗体能够通过或根据如本文描述的实施例6的方案、或通过本领域技术人员理解的对这种试验的改进、或通过本领域技术人员已知的其他方式，以上述方式抑制小鼠中MOLM-13肿瘤异种移植物的生长。

本发明的双抗体优选地能够抑制小鼠中RS4-11肿瘤异种移植物的生长。优选地，本发明的双抗体能够以下述浓度抑制小鼠中RS4-11肿瘤异种移植物的生长，所述浓度为至少约0.5mg/kg，至少约0.2mg/kg，至少约0.1mg/kg，至少约0.02mg/kg或至少约0.004mg/kg。本发明优选的抗体将在一段时间之后抑制小鼠中RS4-11肿瘤异种移植物的生长至少约25％，但可能至少约40％，至少约50％，至少约60％，至少约70％，至少约80％，至少约90％，或甚至完全抑制RS4-11肿瘤生长，或造成肿瘤退化或消失。该抑制将发生在至少NSG小鼠品系中。任选地，本发明的双抗体能够通过或根据如本文描述的实施例6的方案、或通过本领域技术人员理解的对这种试验的改进、或通过本领域技术人员已知的其他方式，以上述方式抑制小鼠中RS4-11肿瘤异种移植物的生长。

本发明的双抗体优选地能够体外消耗AML骨髓细胞的原代培养物中的白血病母细胞。优选地，本发明的双抗体能够以下述浓度体外消耗AML骨髓细胞的原代培养物中的白血病母细胞，所述浓度为至少约0.01ng/ml，至少约0.02ng/ml，至少约0.04ng/ml，至少约0.06ng/ml，至少约0.08ng/ml或至少约0.1ng/ml。优选地，任选地在用双抗体温育(incubate)原代培养物约120小时之后，本发明的双抗体能够以下述双抗体浓度体外消耗AML骨髓细胞的原代培养物中的白血病母细胞至小于初级白血病母细胞的总群体的20％，所述双抗体浓度为至少约0.01ng/ml，至少约0.02ng/ml，至少约0.04ng/ml，至少约0.06ng/ml，至少约0.08ng/ml或至少约0.1ng/ml。优选地，在用双抗体温育原代培养物约120小时之后，以下述双抗体浓度将AML骨髓细胞的原代培养物中的白血病母细胞体外消耗至小于初级白血病母细胞的总群体的20％，所述双抗体浓度为约0.01ng/ml或0.1ng/ml。

本发明的双抗体优选地能够体外诱导AML骨髓细胞的原代培养物中T细胞群体的扩展(expansion)。优选地，这种扩展可达可在试验中扩展的最大T细胞群体的约70％或更多。优选地，可选地在用双抗体温育原代培养物约120小时之后，本发明的双抗体能够将AML骨髓细胞的原代培养物中T细胞群体的扩展体外诱导至可在试验中扩展的最大T细胞群体的70％或更多，双抗体浓度为至少约0.01ng/ml，至少约0.02ng/ml，至少约0.04ng/ml，至少约0.06ng/ml，至少约0.08ng/ml或至少约0.1ng/ml。优选地，在用双抗体温育原代培养物约120小时之后，AML骨髓细胞的原代培养物中的T细胞群体体外扩展至在试验中可扩展的最大T细胞群体的约70％或更多，双抗体浓度为约0.01ng/ml或约0.1ng/ml。

本发明的双抗体优选地能够体外诱导AML骨髓细胞的原代培养物中的T细胞群体的活化。任选地用双抗体温育原代培养物约72小时之后，这种活化可发生在至少约0.01ng/ml，至少约0.02ng/ml，至少约0.04ng/ml，至少约0.06ng/ml，至少约0.08ng/ml或至少约0.1ng/ml的双抗体浓度下。这种活化可通过T细胞活化标记物，比如CD25的表达测量。优选地，用双抗体温育原代培养物约72小时之后，如通过CD25的表达所测量的，AML骨髓细胞的原代培养物中T细胞群体的体外活化可发生在约0.01ng/ml或约0.1ng/ml的双抗体浓度下。

任选地在用双抗体温育原代培养物约120小时之后，本发明的双抗体优选地能够体外消耗AML骨髓细胞的原代培养物中的白血病母细胞至小于初级白血病母细胞的总群体的20％，并且同时体外诱导AML骨髓细胞的原代培养物中的T细胞群体扩展至试验中可扩展的最大T细胞群体的约70％或更多，双抗体浓度为至少约0.01ng/ml，至少约0.02ng/ml，至少约0.04ng/ml，至少约0.06ng/ml，至少约0.08ng/ml或至少约0.1ng/ml。优选地，双抗体浓度为约0.01ng/ml或约0.1ng/ml和原代培养物用双抗体温育约120小时。

通过或根据如本文描述的实施例8的方案、或通过本领域技术人员理解的对这种试验的改进、或通过本领域技术人员已知的其他方式，本发明的双抗体能够以上述方式体外消耗AML骨髓细胞的原代培养物中的白血病母细胞和/或体外诱导AML骨髓细胞的原代培养物中T细胞群体的扩展和/或体外诱导AML骨髓细胞的原代培养物中的T细胞群体的活化。

为了避免任何怀疑，本发明的双抗体可展示本文所述的一个、两个、三个、大于三个或所有的功能特性。因此本发明的双抗体可展示本文所述的功能特性的任何组合。

本发明的双抗体可用作药物。优选地，双抗体用于治疗与CD123的表达相关或特征在于CD123的表达的疾病或病况(condition)。本发明也涉及本发明的双抗体在制造药学组合物——优选地用于治疗与CD123的表达相关或特征在于CD123的表达的疾病或病况——的中的用途，如本文进一步限定的。

与CD123的表达相关或特征在于CD123的表达的疾病或病况可以是癌症。例如，癌症可选自：急性髓细胞样白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)，包括CML的母细胞危象(blastic crisis)和与CML相关的Abelson癌基因(Bcr-ABL易位)、骨髓增生异常综合征(MDS)、急性B成淋巴细胞白血病(B-ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)，包括Richter综合症或CLL的Richter转化(transformation)、毛细胞白血病(HCL)、母细胞性浆细胞样树突细胞赘生物(BPDCN)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)，包括套细胞白血病(MCL)，和小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、霍奇金淋巴瘤、系统性肥大细胞增多症、和伯基特(Burkitt’s)淋巴瘤。

与CD123的表达相关或特征在于CD123的表达的疾病或病况可以是炎症病况。例如，炎症病况可选自：自身免疫狼疮(SLE)、过敏症、哮喘和类风湿性关节炎。

本发明另外提供了药学组合物，其包括任何上述双抗体和生理学上可接受的载体。

本发明另外提供了上述药学组合物在治疗与CD123的表达相关或特征在于CD123的表达的疾病或病况中的用途。

本发明尤其涉及这种用途的实施方式，其中与CD123的表达相关或特征在于CD123的表达的疾病或病况是癌症(尤其选自下述的癌症：急性髓细胞样白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)，包括母细胞危象CML和与CML相关的Abelson癌基因(Bcr-ABL易位)、骨髓增生异常综合征(MDS)、急性B成淋巴细胞白血病(B-ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)，包括Richter综合症或CLL的Richter转化、毛细胞性白血病(HCL)、母细胞性浆细胞样树突细胞赘生物(BPDCN)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)，包括套细胞白血病(MCL)，和小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、霍奇金淋巴瘤、系统性肥大细胞增多症，和伯基特淋巴瘤)。

本发明也尤其涉及这种用途的实施方式，其中与CD123的表达相关或特征在于CD123的表达的疾病或病况是炎症病况(尤其选自下述的炎症病况：自身免疫狼疮(SLE)、过敏症、哮喘和类风湿性关节炎)。

术语，比如“约”的意思应是指定值10％，更优选地5％以内，除非上下文另外要求。

附图简述

图1显示已知CD123表达在白血病干细胞上。

图2阐释本发明的双链CD123 x CD3双特异性单价双抗体的第一和第二多肽链的结构。

图3A和3B阐释本发明的三链CD123 x CD3双特异性单价Fc双抗体的第一、第二和第三多肽链的两种形式(version)的结构(形式1，图3A；形式2，图3B)。

图4(图A-E)显示不同的CD123 x CD3双特异性双抗体介导T细胞重定向(redirected)的杀伤展示不同量CD123的靶细胞的能力。该图提供剂量响应曲线，其指示在以10:1的E:T(效应器：靶)比例下，在多个靶细胞类型：RS4-11(图A)；TF-1(图B)；Molm-13(图C)；Kasumi-3(图D)；和THP-1(图E)中，具有白蛋白结合结构域的序列-优化的CD123 xCD3双特异性双抗体(“DART-A”)(具有ABD的DART-A“w/ABD”)显示比对照双特异性双抗体(对照DART)或非序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体(“DART-B”)更大的细胞毒性。

图5(图A-D)显示序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体(DART-A)，具有白蛋白结合结构域的序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体(具有ABD的DART-A“w/ABD”)和具有免疫球蛋白IgG Fc结构域的序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体(具有Fc的DART-A“w/Fc”)重定向杀伤靶细胞期间介导T细胞活化的能力。该图示出剂量响应曲线，其显示DART-A、DART-A w/ABD和DART-A w/Fc在Kasumi-3(图A)和THP-1(图B)细胞和纯化CD8T细胞中以10:1的E:T(效应细胞:靶细胞)比介导的细胞毒性(18小时温育)。图C和D显示在存在(图D)和没有(图C)靶细胞的情况下，使用CD8T细胞上标记物CD25的T细胞活化的剂量响应曲线。

图6(图A-B)显示以10:1的E:T比，在存在Kasumi-3靶细胞和静息T细胞的情况下，在用序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体(DART-A)(图A)或对照双特异性双抗体(对照DART)(图B)处理之后CD4和CD8T细胞中的粒酶B和穿孔蛋白水平。

图7(图A-B)显示以纳克每千克剂量水平，序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体(DART-A)的体内抗肿瘤活性。MOLM-13细胞(中等CD123表达)与T细胞共混合并且在NSG小鼠中皮下注入(T:E 1:1)。注入开始时，每天静脉内处理一次共8天(QDx8)。各种浓度的DART-A与对照双特异性双抗体(对照DART)比较。图A显示单独Molm-13细胞或与T细胞一起，和各种剂量的DART-A对甚至至超过30天时间时肿瘤体积的影响。图B显示增加剂量的DART-A对接收MOLM-13细胞和T细胞(T:E 1:1)共0-18天时间段的NSG小鼠中观察到的肿瘤体积的影响。

图8显示序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体(DART-A)对RS4-11细胞(具有单核细胞特征的ALL)的体内抗肿瘤活性。细胞与T细胞共混合并且在NSG小鼠中皮下注入(T:E 1:1)。注入开始时，每天静脉内处理一次共4天(QDx4)。各种浓度的DART-A与对照双特异性双抗体(对照DART)比较。

图9(图A-B)显示来自AML患者1(图A)的骨髓单核细胞(BM MNC)和外周血单核细胞(PBMC)中的CD123+胚细胞与Kasumi-3AML细胞系(图B)的比较。

图10(图A-C)显示能力序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体(DART-A)以下的能力：在120h时介导原发性AML中胚细胞下降(图A)、在120h时驱动原发性AML中的T细胞扩展(图B)和在48h和72h时诱导AML中T细胞活化(图C)。

图11(图A-H)显示在ALL PBMC的初级样品中CD123+胚细胞群体的鉴定。图A和E显示正常PBMC(图A)和ALL PBMC(图E)的输入群体的正向分散(scatter)和侧向分散。图B和F显示作为主要B细胞(图B)和白血病胚细胞(图F)的淋巴细胞群体的鉴定。图C和G显示作为CD123+的淋巴细胞的群体的鉴定。图D和H显示CD19+细胞和CD123+细胞的鉴定。

图12(图A-B)显示ALL PBMC的初级样品中T细胞的CD4和CD8群体的鉴定。图A显示输入ALL PBMC的正向分散和侧向分散。图B显示样品中存在的T细胞的CD4或CD8群体。数字指示CD4T细胞占ALL PBMC样品中存在的总细胞的约0.5％和CD8T细胞占总细胞的约0.4％。

图13(图A-H)显示序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体(DART-A)用自体CTL介导ALL胚细胞消耗的能力。图A和E显示正常PBMC(图A)和ALL PBMC(图E)的输入群体的正向分散和侧向分散。PBMC未处理(图B和F)、用对照双特异性双抗体(对照DART)处理(图C和G)或用DART-A处理(图D和H)，并且温育7天随后对CD34和CD19染色。

图14(图A-L)显示序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体(DART-A)在正常PBMC(图A-F)和ALL PBMC(图G-L)中介导T细胞扩展(图A、B、C、G、H和I)和活化(图D、E、F、J、K和L)的能力。细胞未处理(图A、D、G和J)、或用对照双特异性双抗体(对照DART)(图B、E、H和K)或DART-A(图C、F、I和L)处理7天。

图15(图A-C)显示原发性AML样品中AML胚细胞群体和T细胞的鉴定。图A显示输入AML PBMC的正向分散和侧向分散。图B显示AML样品中AML胚细胞群体的鉴定。图C显示AML样品中T细胞群体的鉴定。

图16(图A-C)显示序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体(DART-A)用自体CTL介导AML胚细胞消耗和T细胞扩展的能力。用PBS、对照双特异性双抗体(对照DART)或DART-A温育来自患者2的原发性AML PBMC达144h。计数胚细胞(图A)、CD4T细胞(图B)和CD8T细胞(图C)。

图17(图A-D)显示序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体(DART-A)介导AML中T细胞活化的能力。用对照双特异性双抗体(对照DART)或具有自体PBMC的DART-A温育之后，测定来自AML患者2的CD4和CD8T细胞的CD25(图A)和Ki-67(图B)表达。用对照DART或具有自体PBMC的DART-A的温育之后，测定来自AML患者2的CD4和CD8T细胞的穿孔蛋白(图C)和粒酶B(图D)的水平。

图18(图A-D)显示序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体(DART-A)能够与人和灵长类CD123和CD3蛋白交叉反应。图显示为了评估DART-A结合人(图A和C)和非人灵长类(图B和D)CD3(图A和B)和CD123(图C和D)蛋白质能力而进行的分析结果的BIACORE^TM传感迹线图(sensogram>

图19(图A-B)显示序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体(DART-A)用人和食蟹猴PBMC体外介导自体单核细胞消耗的能力。图呈现通过初级人PBMCs(图A)或食蟹猴PBMC(图B)的DART-A介导的细胞毒性剂量响应曲线的结果。

图20(图A-N)显示序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体(DART-A)在没有全身细胞因子诱导的情况下介导食蟹猴中pDC消耗的能力。图A-D显示用媒介和载体在4h和4d获得的对照结果。图E-H显示用对照双特异性双抗体(对照DART)在4h和4d获得的对照结果。图I-N显示以10ng/kg/d在4h和4d获得的结果和用30ng/kg/d的DART-A在4d获得的结果。

图21(图A-D)显示序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体(DART-A)介导食蟹猴中pDC的剂量依赖性消耗的能力。食蟹猴以0.1、1、10、30、100、300或1000ng/kg剂量施用DART-A。在指定的时间评估PBMC并且计数总B细胞(图A)、单核细胞(图B)、NK细胞(图C)和pDC(图D)。

图22(图A-D)显示序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体(DART-A)间歇地调节食蟹猴中T细胞的能力。食蟹猴以0.1、1、10、30、100、300或1000ng/kg的剂量施用DART-A。在指定的时间评估PBMC并且计数总T细胞(图A)、CD4T细胞(图B)、CD69细胞(图C)和CD8T细胞(图D)。

图23显示在还原(左)和非还原(右)条件下，纯化DART-A蛋白的SDS-PAGE分析。

图24A-24B显示纯化DART-A的物理化学表征。图24A：校准的TSK G3000SWxL柱上DART-A蛋白的SEC图谱(profile)。图24B：DART-A蛋白的质谱。

图25A-25D显示结合固定的人或食蟹猴CD123和CD3的DART-A的SPR分析。虚线表示对以0、6.25、12.5、25、50或100nM的DART-A浓度获得的实验结合曲线(连续的线)的1:1Langmuir模型的整体拟合。数据是三个独立实验的代表。

图26A-26E显示DART-A能够同时结合CD3和CD123二者。图26A-26B提供双功能ELISA的结果并且表明同时结合DART-A的两个靶抗原。用人CD123(图26A)或食蟹猴CD123(图26B)涂覆ELISA板。用滴定法测量DART-A和对照DART浓度，然后用人CD3-生物素进行检测。图26C-26E显示CD123+Molm-13靶细胞(图26C)、人T细胞(图26D)和食蟹猴T细胞(图26E)上DART-A的细胞-表面结合。通过FACS分析使用对DART-A或对照DART分子的E-螺旋和K-螺旋区域特异的单克隆抗体检测结合。

图27A-27H显示DART-A介导通过人或猴子抗CD123+Kasumi-3白血病细胞系的效应细胞重定向的靶细胞杀伤的能力，表明分子结合正常循环的白细胞，包括pDC和单核细胞的亚型的能力和表明分子消耗CD14-CD123^高细胞(pDC和嗜碱性粒细胞)而不影响单核细胞(CD14+细胞)的能力。图27A显示如通过QFACS分析测定的U937和Kasumi-3白血病细胞系上相关的抗CD123-PE结合位点。图27B显示DART-A或对照DART介导的对AML细胞系(U937细胞)的相对低百分数的细胞毒性，所述AML细胞系，如图27A中所显示，具有相对少的CD123结合位点)。图27C显示DART-A或对照DART在存在纯化的人T细胞(作为效应细胞)的情况下介导的对AML细胞系(Kasumi-3细胞)的细胞毒性百分数，所述AML细胞系，如图27A中所显示，具有许多CD123结合位点。在图27B-27C中，E:T比是10:1。图27D显示DART-A或对照DART在存在纯化食蟹猴PBMC(作为效应细胞)的情况下介导的对Kasumi-3细胞的细胞毒性的百分数(E:T比是15:1)，并且表明DART-A可结合食蟹猴T细胞。图27E显示Kasumi-3细胞、人单核细胞、人浆细胞样树突细胞(“pDC”)、食蟹猴单核细胞和食蟹猴浆细胞样树突细胞上的相关抗CD123-PE结合位点，如通过QFACS分析测定的。图27F显示DART-A消耗CD14^–CD123^低细胞的能力。图27G显示DART-A消耗人CD14^–CD123^高细胞的能力。图27H显示DART-A消耗食蟹猴CD14^–CD123^高细胞的能力。通过LDH释放测定细胞毒性，使用GraphPad软件测定EC50值。

图28显示评估DART-A的药物代谢动力学参数的二室模型(two-compartmentmodel)的用途。数据显示在以100ng/kg/天、300ng/kg/天、600ng/kg/天和1000ng/kg/天剂量接收96-小时输注之后，食蟹猴中DART-A的输注结束(EOI)血清浓度。每个点表示个体动物；水平线表示剂量组的平均值。

图29A-29C显示DART-A输注对细胞因子IL-6产量的影响。输注DART-A的猴子中血清IL-6水平(平均值±SEM)由处理组显示。食蟹猴在第1天用媒介对照处理，随后每4周一次输注媒介(组1)(图29A)或DART-A，所述DART-A在第8、15、22和29天开始以每周4天输注施用(组2-5)(图29B)或在第8天开始以7天/周输注共4周(组6)(图29C)。处理间隔由填充的灰色条指示。

图30A-30F显示DART-A输注对CD14-/CD123+细胞(图30A-30C)和CD303+细胞(图30D-30F)消耗的影响。按研究天数和组显示CD14-/CD123+(图30A-30C)或CD303+(图30D-30F)的循环水平的平均值±SEM。在第1天用媒介对照处理食蟹猴，随后每4周一次输注媒介(组1)(图30A和30D)或DART-A，所述DART-A在第8、15、22和29天开始以每周4天输注施用(组2-5)(图30A和30E)或在第8天开始以7天/周输注共4周(组6)(图30C和30F)。处理间隔由填充的灰色条指示。

图31A-31I显示观察的接收在第8、15、22和29天开始的4-天输注施用的DART-A的T细胞群体(图31A-31C)、CD4+细胞群体(图31D-31F)和CD8+细胞群体(图31G-31I)的改变。图例：CD25+(灰色正方形)；CD69+(灰色三角形)，PD-1+(白色三角形)；Tim-3+(白色正方形)。经CD4和CD8标记物，而不是经规范的CD3对T细胞计数，以消除对DART-A可能的干扰。在第1天用媒介对照处理食蟹猴，随后每4周1次输注媒介(组1)或DART-A，所述DART-A在第8、15、22和29天开始以每周4天输注施用(组5)或在第8天开始以7天/周输注共4周(组6)。处理间隔由填充的灰色条指示。按研究天数和组显示总循环T细胞的绝对数的平均值±SEM(图31A-31C)。按研究天数和组显示CD4(图31D-31E)或CD8T细胞(图31F-31H)的CD25+、CD69+、PD-1+和Tim-3+的相对值(平均百分数±SEM)。

图32A-32F显示观察的连续7-天输注DART-A期间和之后T CD4+细胞群体(图32A-32C)和CD8+细胞群体(图32D-32F)的改变。按研究天数针对组2、3和4显示CD4(图32A-32C)或CD8(图32D-32F)T细胞上CD25+、CD69+、PD-1+和Tim-3+的平均值±SEM百分数。处理间隔由填充的灰色条指示。图例：CD25+(灰色正方形)；CD69+(灰色三角形)，PD-1+(白色三角形)；Tim-3+(白色正方形)。

图33A-33F显示连续7-天输注DART-A期间和之后观察的T CD4+细胞群体(图33A-33C)和CD8+细胞群体(图33D-33F)的改变。按研究天数针对组2、3和4显示CD4+群体(图33A-33C)或CD8群体(图33D-33F)中CD4+幼稚(CD95-/CD28+)、CMT(CD95+/CD28+)和EMT(CD95+/CD28-)T细胞的平均值±SEM百分数。在第1天用媒介对照处理食蟹猴，随后每4周1次输注或DART-A，所述DART-A在第8、15、22和29天开始以每周4-天输注施用(组2-4)。处理间隔由填充的灰色条指示。图例：幼稚(白色三角形)；CMT(黑色三角形)，EMT(灰色正方形)。

图34显示通过来自用多次输注的DART-A处理的幼稚猴子或猴子的PBMC的DART-A介导的对Kasumi-3细胞的细胞毒性。

图35A-35F显示DART-A暴露以对应的幼稚T细胞群体为代价增加中心记忆CD4细胞和效应器记忆CD8+细胞的相对频率。按研究天数和组显示CD4+群体(图35A-35C)或CD8+群体(图35D-35F)中CD4+幼稚(CD95-/CD28+)、CMT(CD95+/CD28+)和EMT(CD95+/CD28-)T细胞的平均值±SEM百分数。在第1天用媒介对照处理食蟹猴，随后每4周1次输注媒介(组1)或DART-A，所述DART-A在第8、15、22和29天开始以每周4-天输注施用(组5)或在第8天开始以7-天/周输注共4周(组6)。处理间隔由填充的灰色条指示。图例：幼稚(白色三角形)；CMT(黑色三角形)，EMT(灰色正方形)。

图36A-36F显示DART-A对已经接收分子输注的猴子中红细胞参数的影响。显示在指定的时间点从用DART-A处理的猴子收集的样品中循环RBC(图36A-36C)或网状细胞(图36D-36F)水平(平均值±SEM)。

图37A-37B显示在指定的时间点从用DART-A处理的猴子收集的骨髓样品中Lin-细胞群体中CD123+细胞(图37A)或HSC(CD34+/CD38-/CD45-/CD90+细胞)(图37B)的频率(平均百分数±SEM)。在第1天用媒介对照处理食蟹猴，随后每4周1次输注媒介(组1)或DART-A，所述DART-A在第8、15、22和29天开始以每周4-天输注施用(组2-5)或在第8天开始以7-天/周输注共4周(组6)。

发明详述

本发明涉及序列-优化的能够同时结合CD123和CD3的CD123 x CD3双特异性单价双抗体，并且涉及这种分子在治疗血液恶性肿瘤中的用途。尽管非优化的CD123 x CD3双特异性双抗体功能完整，与通过密码子优化的基因表达中获得的改善类似(见，例如，Grosjean，H。等(1982)“Preferential Codon Usage In Prokaryotic Genes:The OptimalCodon-Anticodon Interaction Energy And The Selective Codon Usage InEfficiently Expressed Genes,”Gene 18(3):199-209)，但可能通过修饰或改善它们的序列进一步增强CD123 x CD3双特异性双抗体的稳定性和/或功能。

本发明的优选的CD123 x CD3双特异性双抗体由至少两条多肽链组成，所述至少两条多肽链彼此结合以形成对CD123的抗原决定部位特异的一个结合位点和对CD3抗原决定部位特异的一个结合位点(图2)。双抗体的各条多肽链彼此共价结合，例如通过位于每条多肽链内的半胱氨酸残基的二硫键合。每条多肽链均包含轻链可变结构域的抗原结合结构域、重链可变结构域的抗原结合结构域和异源二聚化结构域。间插接头肽(接头1)将轻链可变结构域的抗原结合结构域与重链可变结构域的抗原结合结构域分开。第一多肽链的轻链可变结构域的抗原结合结构域与第二多肽链的重链可变结构域的抗原结合结构域相互作用以便形成对第一抗原(即，CD123或CD3)特异的第一功能抗原结合位点。同样地，第二多肽链的轻链可变结构域的抗原结合结构域与第一多肽链的重链可变结构域的抗原结合结构域相互作用以便形成对第二抗原(即，CD123或CD3，取决于对第一抗原的确定)特异性的第二功能抗原结合位点。因此，第一和第二多肽链的轻链可变结构域的抗原结合结构域和重链可变结构域的抗原结合结构域的选择是协调的，使得两条多肽链总共包括能够结合CD123和CD3的轻链和重链可变结构域的抗原结合结构域。

第一和第二多肽链的异源二聚体的形成可通过异源二聚化结构域驱动。这种结构域包括一条多肽链上的GVEPKSC(SEQ ID NO:50)(或VEPKSC；SEQ ID NO:51)和另一条多肽链上的GFNRGEC(SEQ ID NO:52)(或FNRGEC；SEQ ID NO:53)(US2007/0004909)。可选地，这种结构域可可被改造以包含相反电荷的螺旋。一条多肽链的异源二聚化结构域包括具有至少六个、至少七个或至少八个带正电荷氨基酸的序列，另一条多肽链的异源二聚化结构域包括具有至少六个、至少七个或至少八个带负电荷氨基酸的序列。例如，第一或第二异源二聚化结构域优选地包括具有八个带正电荷的氨基酸的序列，而异源二聚化结构域中的另一个优选地包括具有八个带负电荷的氨基酸的序列。带正电荷的氨基酸可以是赖氨酸、精氨酸、组氨酸等和/或带负电荷的氨基酸可以是谷氨酸、天冬氨酸等。带正电荷的氨基酸优选地是赖氨酸和/或带负电荷的氨基酸优选地是谷氨酸。

本发明的CD123 x CD3双特异性双抗体被改造，从而这种第一和第二多肽链沿着它们的长度经半胱氨酸残基彼此共价键合。这种半胱氨酸残基可引入至间插接头，所述间插接头将多肽的VL和VH结构域分开。可选地，和更优选地，第二肽(接头2)被引入至每条多肽链，例如，在多肽链的氨基-末端或在异源二聚化结构域和轻链可变结构域或重链可变结构域的抗原结合结构域之间布置接头2的位置。

在具体的实施方式中，本发明的序列-优化的CD123 x CD3双特异性单价双抗体进一步具有免疫球蛋白Fc结构域或白蛋白结合结构域以延长体内半衰期。

本发明的包括免疫球蛋白Fc结构域的CD123 x CD3双特异性单价双抗体(即，CD123 x CD3双特异性单价Fc双抗体)由第一多肽链、第二多肽链和第三多肽链组成。第一和第二多肽链彼此结合以形成对CD123的抗原决定部位特异的一个结合位点和对CD3抗原决定部位特异的一个结合位点。第一多肽链和第三多肽链彼此结合以形成免疫球蛋白Fc结构域(图3A和图3B)。双特异性单价Fc双抗体的第一和第二多肽链彼此共价结合，例如通过位于每条多肽链内的半胱氨酸残基的二硫键合。

第一和第三多肽链彼此共价结合，例如通过位于每条多肽链内的半胱氨酸残基的二硫键合。第一和第二多肽链各包含轻链可变结构域的抗原结合结构域、重链可变结构域的抗原结合结构域和异源二聚化结构域。间插接头肽(接头1)将轻链可变结构域的抗原结合结构域与重链可变结构域的抗原结合结构域分开。第一多肽链的轻链可变结构域的抗原结合结构域与第二多肽链的重链可变结构域的抗原结合结构域相互作用以便形成对第一抗原(即，CD123或CD3)特异的第一功能抗原结合位点。同样地，第二多肽链的轻链可变结构域的抗原结合结构域与第一多肽链的重链可变结构域的抗原结合结构域相互作用以便形成对第二抗原(即，CD3或CD123，取决于对第一抗原的确认)特异性的第二功能抗原结合位点。因此，第一和第二多肽链的轻链可变结构域的抗原结合结构域和重链可变结构域的抗原结合结构域的选择是协调的，使得两条多肽链总共包括能够结合CD123和CD3的轻链和重链可变结构域的抗原结合结构域。第一和第三多肽链每个包含完整免疫球蛋白Fc结构域的一些或所有的CH2结构域和/或一些或所有的CH3结构域以及包含半胱氨酸的肽。一些或所有的CH2结构域和/或一些或所有的CH3结构域结合，以形成本发明的双特异性单价Fc双抗体的免疫球蛋白Fc结构域。本发明的双特异性单价Fc双抗体的第一和第三多肽链彼此共价结合，例如通过位于多肽链的包含半胱氨酸的肽中的半胱氨酸残基的二硫键合。

I.序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体，“DART-A”

本发明提供序列-优化的双特异性双抗体，其能够同时和特异性结合CD123的抗原决定部位和结合CD3的抗原决定部位(“CD123 x CD3”双特异性双抗体或DART-A)。如下所讨论，发现DART-A相对于类似组成的其他非序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体显示增强的功能活性，并且因此被称为“序列-优化的”CD123 x CD3双特异性双抗体。

序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体(DART-A)包括第一多肽链和第二多肽链。双特异性双抗体的第一多肽链在从N-末端至C-末端方向上包括N-末端、能够结合CD3的单克隆抗体的轻链可变结构域(VL结构域)(VL_CD3)、间插接头肽(接头1)、能够结合CD123的单克隆抗体重链可变结构域(VH结构域)(VH_CD123)和C-末端。这种VL_CD3结构域的优选的序列是SEQ>

QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPWTPARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLG

VL_CD3的抗原结合结构域包括CDR1>

这种接头1优选的序列是SEQ ID NO:29:GGGSGGGG。这种VH_CD123结构域的优选的序列是SEQ>

EVQLVQSGAELKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMKWVRQAPGQGLEWIGDIIPSNGATFYNQKFKGRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHLLRASWFAYWGQGTLVTVSS

VH_CD123的抗原结合结构域包括CDR1>

第二多肽链在从N-末端至C-末端方向上包括N-末端、能够结合CD123的单克隆抗体的VL结构域(VL_CD123)、间插接头肽(例如，接头1)、能够结合CD3的单克隆抗体的VH结构域(VH_CD3)、和C-末端。这种VL_CD123结构域的优选的序列是SEQ>

DFVMTQSPDSLAVSLGERVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPYTFGQGTKLEIK

VL_CD123的抗原结合结构域包括CDR1>

这种VH_CD3结构域的优选的序列是SEQ>

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS

VH_CD3的抗原结合结构域包括CDR1>

本发明的序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体被改造，从而这种第一和第二多肽沿着它们的长度经半胱氨酸残基彼此共价键合。这种半胱氨酸残基可引入至间插接头(例如，接头1)，所述间插接头将多肽的VL和VH结构域分开。可选地，和更优选地，第二肽(接头2)引入至每条多肽链，例如，在这种多肽链的VL结构域的N-末端至或VH结构域的C-末端的位置。这种接头2的优选的序列是SEQ ID NO:30:GGCGGG。

可通过进一步改造这类多肽链驱动异源二聚体的形成，以包含相反电荷的多肽螺旋。因此，在优选的实施方式中，多肽链之一可被改造以包含“E-螺旋”结构域(SEQ ID NO:34:EVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEK)，其残基在pH>KVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE)，其残基在pH>

为第一或第二多肽链提供哪种螺旋不重要。但是，本发明的优选的序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体(“DART-A”)具有第一多肽链，所述第一多肽链具有下述序列(SEQ ID NO:1):

QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPWTPARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGGGGSGGGGEVQLVQSGAELKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMKWVRQAPGQGLEWIGDIIPSNGATFYNQKFKGRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHLLRASWFAYWGQGTLVTVSSGGCGGGEVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEK

DART-A链1由下述组成:SEQ ID NO:21─SEQ ID NO:29─SEQ ID NO:26─SEQ IDNO:30─SEQ ID NO:34。编码多核苷酸的DART-A链1是SEQ ID NO:2:

caggctgtggtgactcaggagccttcactgaccgtgtccccaggcggaactgtgaccctgacatgcagatccagcacaggcgcagtgaccacatctaactacgccaattgggtgcagcagaagccaggacaggcaccaaggggcctgatcgggggtacaaacaaaagggctccctggacccctgcacggttttctggaagtctgctgggcggaaaggccgctctgactattaccggggcacaggccgaggacgaagccgattactattgtgctctgtggtatagcaatctgtgggtgttcgggggtggcacaaaactgactgtgctgggagggggtggatccggcggcggaggcgaggtgcagctggtgcagtccggggctgagctgaagaaacccggagcttccgtgaaggtgtcttgcaaagccagtggctacaccttcacagactactatatgaagtgggtcaggcaggctccaggacagggactggaatggatcggcgatatcattccttccaacggggccactttctacaatcagaagtttaaaggcagggtgactattaccgtggacaaatcaacaagcactgcttatatggagctgagctccctgcgctctgaagatacagccgtgtactattgtgctcggtcacacctgctgagagccagctggtttgcttattggggacagggcaccctggtgacagtgtcttccggaggatgtggcggtggagaagtggccgcactggagaaagaggttgctgctttggagaaggaggtcgctgcacttgaaaaggaggtcgcagccctggagaaa

DART-A的第二多肽链具有下述序列(SEQ ID NO:3):

DFVMTQSPDSLAVSLGERVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPYTFGQGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSGGCGGGKVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE

DART-A链2由下述组成:SEQ ID NO:25─SEQ ID NO:29─SEQ ID NO:22─SEQ IDNO:30─SEQ ID NO:35。编码多核苷酸的DART-A链2是SEQ ID NO:4:

gacttcgtgatgacacagtctcctgatagtctggccgtgagtctgggggagcgggtgactatgtcttgcaagagctcccagtcactgctgaacagcggaaatcagaaaaactatctgacctggtaccagcagaagccaggccagccccctaaactgctgatctattgggcttccaccagggaatctggcgtgcccgacagattcagcggcagcggcagcggcacagattttaccctgacaatttctagtctgcaggccgaggacgtggctgtgtactattgtcagaatgattacagctatccctacactttcggccaggggaccaagctggaaattaaaggaggcggatccggcggcggaggcgaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtccagcctggagggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagcacatacgctatgaattgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggttggaaggatcaggtccaagtacaacaattatgcaacctactatgccgactctgtgaaggatagattcaccatctcaagagatgattcaaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgaaaaccgaggacacggccgtgtattactgtgtgagacacggtaacttcggcaattcttacgtgtcttggtttgcttattggggacaggggacactggtgactgtgtcttccggaggatgtggcggtggaaaagtggccgcactgaaggagaaagttgctgctttgaaagagaaggtcgccgcacttaaggaaaaggtcgcagccctgaaagag

如下所讨论，发现序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体(DART-A)具有同时结合如人和猴子细胞具备的(arrayed)CD123和CD3的能力。发现DART-A的提供使得T细胞活化、介导胚细胞下降、驱动T细胞扩展、诱导T细胞活化和造成靶癌症细胞的重定向杀伤。

II.相当的(comparative)非序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体，“DART-B”

DART-B是非序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体，其具有与DART-A的结构类似的大体结构。DART-B的第一多肽链在从N-末端至C-末端方向上包括N-末端、能够结合CD3的单克隆抗体的VL结构域(VL_CD3)、间插接头肽(接头1)、能够结合CD123的单克隆抗体的VH结构域(VH_CD123)、间插接头2、E-螺旋结构域、和C-末端。DART-B的第一多肽链的VL_CD3结构域具有下述序列(SEQ>

DIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELK

DART-B的第一多肽链的VH_CD123结构域具有下述序列(SEQ>

QVQLVQSGAELKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMKWVRQAPGQGLEWIGDIIPSNGATFYNQKFKGRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHLLRASWFAYWGQGTLVTVSS

因此，DART-B链1由下述组成：SEQ ID NO:23─SEQ ID NO:29─SEQ ID NO:28─SEQ ID NO:30─SEQ ID NO:34。DART-B的第一多肽链的序列是(SEQ ID NO:5):

DIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKGGGSGGGGQVQLVQSGAELKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMKWVRQAPGQGLEWIGDIIPSNGATFYNQKFKGRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHLLRASWFAYWGQGTLVTVSSGGCGGGEVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEK

编码多核苷酸的DART-B链1是SEQ ID NO:6:

gacattcagctgacccagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggagaaggtcaccatgacctgcagagccagttcaagtgtaagttacatgaactggtaccagcagaagtcaggcacctcccccaaaagatggatttatgacacatccaaagtggcttctggagtcccttatcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcatactctctcacaatcagcagcatggaggctgaagatgctgccacttattactgccaacagtggagtagtaacccgctcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaaggaggcggatccggcggcggaggccaggtgcagctggtgcagtccggggctgagctgaagaaacccggagcttccgtgaaggtgtcttgcaaagccagtggctacaccttcacagactactatatgaagtgggtcaggcaggctccaggacagggactggaatggatcggcgatatcattccttccaacggggccactttctacaatcagaagtttaaaggcagggtgactattaccgtggacaaatcaacaagcactgcttatatggagctgagctccctgcgctctgaagatacagccgtgtactattgtgctcggtcacacctgctgagagccagctggtttgcttattggggacagggcaccctggtgacagtgtcttccggaggatgtggcggtggagaagtggccgcactggagaaagaggttgctgctttggagaaggaggtcgctgcacttgaaaaggaggtcgcagccctggagaaa

DART-B的第二多肽链在从N-末端至C-末端方向上包括N-末端、能够结合CD123的单克隆抗体的VL结构域(VL_CD123)、间插接头肽(接头1)和能够结合CD3的单克隆抗体的VH结构域(VH_CD3)、间插接头2、K-螺旋结构域和C-末端。

DART-B的第二多肽链的VL_CD123结构域具有下述序列(SEQ>

DFVMTQSPDSLAVSLGERVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPYTFGQGTKLEIK

DART-B的第二多肽链的VH_CD3结构域具有下述序列(SEQ>

DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSS

因此，DART-B链2由下述组成：SEQ ID NO:27─SEQ ID NO:29─SEQ ID NO:24─SEQ ID NO:30─SEQ ID NO:35。DART-B的第二多肽链的序列是(SEQ ID NO:7):

DFVMTQSPDSLAVSLGERVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPYTFGQGTKLEIKGGGSGGGGDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGCGGGKVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE

编码多核苷酸的DART-B链2是SEQ ID NO:8:

gacttcgtgatgacacagtctcctgatagtctggccgtgagtctgggggagcgggtgactatgtcttgcaagagctcccagtcactgctgaacagcggaaatcagaaaaactatctgacctggtaccagcagaagccaggccagccccctaaactgctgatctattgggcttccaccagggaatctggcgtgcccgacagattcagcggcagcggcagcggcacagattttaccctgacaatttctagtctgcaggccgaggacgtggctgtgtactattgtcagaatgattacagctatccctacactttcggccaggggaccaagctggaaattaaaggaggcggatccggcggcggaggcgatatcaaactgcagcagtcaggggctgaactggcaagacctggggcctcagtgaagatgtcctgcaagacttctggctacacctttactaggtacacgatgcactgggtaaaacagaggcctggacagggtctggaatggattggatacattaatcctagccgtggttatactaattacaatcagaagttcaaggacaaggccacattgactacagacaaatcctccagcacagcctacatgcaactgagcagcctgacatctgaggactctgcagtctattactgtgcaagatattatgatgatcattactgccttgactactggggccaaggcaccactctcacagtctcctccggaggatgtggcggtggaaaagtggccgcactgaaggagaaagttgctgctttgaaagagaaggtcgccgcacttaaggaaaaggtcgcagccctgaaagag

III.序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体(DART-A)的修饰变体

A.具有白蛋白结合结构域的序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体(具有ABD的DART-A“w/ABD”)

在本发明的第二实施方式中，序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体(DART-A)在双抗体的一条或两条多肽链上包括一个或多个白蛋白结合结构域(“ABD”)(具有ABD的DART-A“w/ABD”)。

如WO 2012/018687中公开，为了改善双抗体的体内药物代谢动力学性质，可修饰双抗体，以在双抗体的一个或多个末端包含血清结合蛋白的多肽部分。最优选地，这种血清结合蛋白的多肽部分安置在双抗体的C-末端。为了该目的，尤其优选的血清结合蛋白的多肽部分是来自链球菌蛋白质G的白蛋白结合结构域(ABD)。链球菌属(Streptococcus)菌株G148的蛋白质G的白蛋白结合结构域3(ABD3)是尤其优选的。

链球菌属菌株G148的蛋白质G的白蛋白结合结构域3(ABD3)由形成稳定三-螺旋束并且具有广泛白蛋白结合特异性的46个氨基酸残基组成(Johansson，M.U。等(2002)“Structure，Specificity，And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin-BindingModules,”J.Biol.Chem.277(10):8114-8120)。白蛋白是血浆中最丰富的蛋白质，并且在人中的半衰期为19天。白蛋白具有数个小分子结合位点，其允许它非共价结合其他蛋白质，从而延长它们的血清半衰期。

因此，这种具有白蛋白结合结构域的序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体的第一多肽链包含第三接头(接头3)，其将这种多肽链的E-螺旋(或K-螺旋)与白蛋白结合结构域分开。这种接头3的优选的序列是SEQ ID NO:31:GGGS。优选的白蛋白结合结构域(ABD)具有下述序列(SEQ ID NO:36):LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLIDNAKSAEGVKALIDEILAALP。

因此，具有白蛋白结合结构域的序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体的优选的第一链具有下述序列(SEQ ID NO:9):

QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPWTPARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGGGGSGGGGEVQLVQSGAELKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMKWVRQAPGQGLEWIGDIIPSNGATFYNQKFKGRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHLLRASWFAYWGQGTLVTVSSGGCGGGEVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEKGGGSLAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLIDNAKSAEGVKALIDEILAALP

具有白蛋白结合结构域的序列-优化的CD123 x CD3双抗体由下述组成:SEQ IDNO:21─SEQ ID NO:29─SEQ ID NO:26─SEQ ID NO:30─SEQ ID NO:34─SEQ ID NO:31─SEQ ID NO:36。编码这种具有白蛋白结合结构域衍生物的序列-优化的CD123 x CD3双抗体的多核苷酸是SEQ ID NO:10:

caggctgtggtgactcaggagccttcactgaccgtgtccccaggcggaactgtgaccctgacatgcagatccagcacaggcgcagtgaccacatctaactacgccaattgggtgcagcagaagccaggacaggcaccaaggggcctgatcgggggtacaaacaaaagggctccctggacccctgcacggttttctggaagtctgctgggcggaaaggccgctctgactattaccggggcacaggccgaggacgaagccgattactattgtgctctgtggtatagcaatctgtgggtgttcgggggtggcacaaaactgactgtgctgggagggggtggatccggcggcggaggcgaggtgcagctggtgcagtccggggctgagctgaagaaacccggagcttccgtgaaggtgtcttgcaaagccagtggctacaccttcacagactactatatgaagtgggtcaggcaggctccaggacagggactggaatggatcggcgatatcattccttccaacggggccactttctacaatcagaagtttaaaggcagggtgactattaccgtggacaaatcaacaagcactgcttatatggagctgagctccctgcgctctgaagatacagccgtgtactattgtgctcggtcacacctgctgagagccagctggtttgcttattggggacagggcaccctggtgacagtgtcttccggaggatgtggcggtggagaagtggccgcactggagaaagaggttgctgctttggagaaggaggtcgctgcacttgaaaaggaggtcgcagccctggagaaaggcggcgggtctctggccgaagcaaaagtgctggccaaccgcgaactggataaatatggcgtgagcgattattataagaacctgattgacaacgcaaaatccgcggaaggcgtgaaagcactgattgatgaaattctggccgccctgcct

具有白蛋白结合结构域的这种序列-优化的CD123 x CD3双抗体的第二多肽链具有上述序列(SEQ ID NO:3)并且由具有SEQ ID NO:4的序列的多核苷酸编码。

B.具有IgG Fc结构域的序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体(具有Fc的DART-A“w/Fc”)

在第三种实施方式中，本发明提供由三条多肽链组成并且具有IgG>

为了形成这种IgG Fc结构域，双抗体的第一和第三多肽链在N-末端至C-末端方向上包含含半胱氨酸的肽，(最优选地，具有氨基酸序列(SEQ ID NO:55):DKTHTCPPCP的肽1)、完整免疫球蛋白Fc结构域的一些或所有的CH2结构域和/或一些或所有的CH3结构域、和C-末端。一些或所有的CH2结构域和/或一些或所有的CH3结构域结合，以形成本发明含双特异性单价Fc结构域的双抗体的免疫球蛋白Fc结构域。本发明的双特异性单价Fc双抗体的第一和第二多肽链彼此共价结合，例如通过位于多肽链的包含半胱氨酸的肽中的半胱氨酸残基的二硫键合。

第一多肽和第三多肽的CH2和/或CH3结构域不必相同，且有利的是，将它们修饰成促进这两条多肽之间的复合。例如，可以将氨基酸取代(优选用包含形成‘突出物(knob)’的大侧基的氨基酸，例如色氨酸，进行的取代)引入CH2或CH3结构域中，从而使得空间干扰会防止与类似突变的结构域的相互作用，并且会迫使突变的结构域与这样的结构域配对：在所述结构域中，改造进了互补或适应性突变，即‘孔(hole)’，(例如用甘氨酸进行取代)。这类突变组可以被改造进任何包含双特异性单价Fc双抗体分子的多肽对中，并且进一步改造进所述对的多肽链的任何部分中。偏爱异源二聚化而不喜欢同源二聚化的蛋白质工程的方法在本领域中是熟知的，特别是相对于免疫球蛋白样分子的改造而言，并且包括在本文中(见例如，Ridgway等(1996)“‘Knobs-Into-Holes’Engineering Of Antibody CH3 DomainsFor Heavy Chain Heterodimerization,”Proteins Engr.9:617-621，Atwell等(1997)“Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A HomodimerUsing A Phage Display Library,”J.Mol.Biol.270:26-35，和Xie等(2005)“A NewFormat Of Bispecific Antibody:Highly Efficient Heterodimerization，ExpressionAnd Tumor Cell Lysis,”J.Immunol.Methods 296:95-101；其每一篇通过参考以其整体并入本文)。优选将‘突出物’改造到第一多肽链的CH2-CH3结构域中，并将‘孔’改造到第三多肽链的CH2-CH3结构域中。因此‘突出物’会有助于防止第一多肽链通过其CH2和/或CH3结构域同源二聚化。因为第三多肽链优选含有‘孔’取代，其会与第一多肽链异源二聚化以及与自身同源二聚化。通过将天然IgG Fc结构域修饰为含有修饰T366W，产生优选的突出物。通过将天然IgG Fc结构域修饰为含有修饰T366S、L368A以及Y407V，产生优选的孔。为了有助于从最终的包含第一多肽链、第二多肽链以及第三多肽链的双特异性单价Fc双抗体中纯化第三多肽链同源二聚体，第三多肽链的CH2和CH3结构域的蛋白A结合位点优选通过位置435(H435R)的氨基酸取代而突变。因此，第三多肽链同源二聚体不会结合蛋白A，而双特异性单价Fc双抗体会保留其通过第一多肽链上的蛋白A结合位点结合蛋白A的能力。

第一多肽链中存在的抗体Fc结构域的CH2和CH3结构域的优选的序列是(SEQ IDNO:56):

APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

第三多肽链中存在的抗体Fc结构域的CH2和CH3结构域的优选的序列是(SEQ IDNO:11):

APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRYTQKSLSLSPGK

C.DART-A w/Fc形式1构建体

为了阐释这种Fc双抗体，本发明提供了DART-A w/Fc形式1构建体。DART-A w/Fc形式1构建体的第一多肽在从N-末端至C-末端方向上包括N-末端、能够结合CD123的单克隆抗体的VL结构域(VL_CD123)、间插接头肽(接头1)、能够结合CD3的单克隆抗体的VH结构域(VH_CD3)、接头2、E-螺旋结构域、接头5、肽1，包含Fc结构域的CH2和CH3结构域的多肽和C-末端。优选的接头5具有下述序列(SEQ>

APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

因此，这种DART-A w/Fc形式1构建体的第一多肽由下述组成：SEQ ID NO:25─SEQID NO:29─SEQ ID NO:22─SEQ ID NO:30─SEQ ID NO:34─SEQ ID NO:32─SEQ ID NO:55─SEQ ID NO:37。

这种DART-A w/Fc形式1构建体的第一多肽的优选的序列具有下述序列(SEQ IDNO:13):

DFVMTQSPDSLAVSLGERVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPYTFGQGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSGGCGGGEVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEKGGGDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

编码这种多肽的优选的多核苷酸是(SEQ ID NO:14):

gacttcgtgatgacacagtctcctgatagtctggccgtgagtctgggggagcgggtgactatgtcttgcaagagctcccagtcactgctgaacagcggaaatcagaaaaactatctgacctggtaccagcagaagccaggccagccccctaaactgctgatctattgggcttccaccagggaatctggcgtgcccgacagattcagcggcagcggcagcggcacagattttaccctgacaatttctagtctgcaggccgaggacgtggctgtgtactattgtcagaatgattacagctatccctacactttcggccaggggaccaagctggaaattaaaggaggcggatccggcggcggaggcgaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtccagcctggagggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagcacatacgctatgaattgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggttggaaggatcaggtccaagtacaacaattatgcaacctactatgccgactctgtgaaggatagattcaccatctcaagagatgattcaaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgaaaaccgaggacacggccgtgtattactgtgtgagacacggtaacttcggcaattcttacgtgtcttggtttgcttattggggacaggggacactggtgactgtgtcttccggaggatgtggcggtggagaagtggccgcactggagaaagaggttgctgctttggagaaggaggtcgctgcacttgaaaaggaggtcgcagccctggagaaaggcggcggggacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgcggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgtggtgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa

这种DART-A w/Fc形式1构建体的第二链在从N-末端至C-末端方向上包括N-末端、能够结合CD3的单克隆抗体的VL结构域(VL_CD3)、间插接头肽(接头1)、能够结合CD123的单克隆抗体的VH结构域(VH_CD123)、接头2、K-螺旋结构域和C-末端。因此，这种DART-A>

qavvtqepsltvspggtvtltcrsstgavttsnyanwvqqkpgqaprgliggtnkrapwtparfsgsllggkaaltitgaqaedeadyycalwysnlwvfgggtkltvlggggsggggevqlvqsgaelkkpgasvkvsckasgytftdyymkwvrqapgqglewigdiipsngatfynqkfkgrvtitvdkststaymelsslrsedtavyycarshllraswfaywgqgtlvtvssggcgggkvaalkekvaalkekvaalkekvaalke

编码这种多肽的优选的多核苷酸具有下述序列(SEQ ID NO:16):

caggctgtggtgactcaggagccttcactgaccgtgtccccaggcggaactgtgaccctgacatgcagatccagcacaggcgcagtgaccacatctaactacgccaattgggtgcagcagaagccaggacaggcaccaaggggcctgatcgggggtacaaacaaaagggctccctggacccctgcacggttttctggaagtctgctgggcggaaaggccgctctgactattaccggggcacaggccgaggacgaagccgattactattgtgctctgtggtatagcaatctgtgggtgttcgggggtggcacaaaactgactgtgctgggagggggtggatccggcggcggaggcgaggtgcagctggtgcagtccggggctgagctgaagaaacccggagcttccgtgaaggtgtcttgcaaagccagtggctacaccttcacagactactatatgaagtgggtcaggcaggctccaggacagggactggaatggatcggcgatatcattccttccaacggggccactttctacaatcagaagtttaaaggcagggtgactattaccgtggacaaatcaacaagcactgcttatatggagctgagctccctgcgctctgaagatacagccgtgtactattgtgctcggtcacacctgctgagagccagctggtttgcttattggggacagggcaccctggtgacagtgtcttccggaggatgtggcggtggaaaagtggccgcactgaaggagaaagttgctgctttgaaagagaaggtcgccgcacttaaggaaaaggtcgcagccctgaaagag

这种DART-A w/Fc形式1的第三多肽链包括IgG Fc结构域的CH2和CH3结构域。优选的多肽由肽1(SEQ ID NO:55)和Fc结构域的CH2和CH3结构域(SEQ ID NO:11)组成并且具有SEQ ID NO:54的序列:

DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRYTQKSLSLSPGK

编码这种多肽的优选的多核苷酸具有下述序列(SEQ ID NO:12):

gacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgcggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgagttgcgcagtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctcgtcagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccgctacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa

D.DART-A w/Fc形式2构建体

作为这种DART-A w/Fc双抗体的第二个实施例，本发明提供了三链双抗体，“DART-A w/Fc双抗体形式2”(图3B)。

这种DART-A w/Fc形式2构建体的第一多肽在从N-末端至C-末端方向上包括N-末端、肽接头(肽1)、包含Fc结构域的CH2和CH3结构域的多肽，其(经接头4)连接至能够结合CD123的单克隆抗体的VL结构域(VL_CD123)、间插接头肽(接头1)、能够结合CD3的单克隆抗体的VH结构域(VH_CD3)、接头2、K-螺旋结构域和C-末端。

优选的包含Fc结构域的CH2和CH3结构域的多肽具有下述序列(SEQ ID NO:37):

APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

“接头4”优选地包括氨基酸序列(SEQ ID NO:57):APSSS。优选的“接头4”具有序列(SEQ ID NO:33):APSSSPME。因此，这种DART-A w/Fc形式2构建体的第一多肽由下述组成：SEQ ID NO:55─SEQ ID NO:37─SEQ ID NO:33─SEQ ID NO:25─SEQ ID NO:29─SEQ IDNO:22─SEQ ID NO:30─SEQ ID NO:35。具有这种序列的多肽是(SEQ ID NO:17):

DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKAPSSSPMEDFVMTQSPDSLAVSLGERVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPYTFGQGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSGGCGGGKVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE

编码这种多肽的优选的多核苷酸具有下述序列(SEQ ID NO:18):

gacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgcggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgtggtgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaagccccttccagctcccctatggaagacttcgtgatgacacagtctcctgatagtctggccgtgagtctgggggagcgggtgactatgtcttgcaagagctcccagtcactgctgaacagcggaaatcagaaaaactatctgacctggtaccagcagaagccaggccagccccctaaactgctgatctattgggcttccaccagggaatctggcgtgcccgacagattcagcggcagcggcagcggcacagattttaccctgacaatttctagtctgcaggccgaggacgtggctgtgtactattgtcagaatgattacagctatccctacactttcggccaggggaccaagctggaaattaaaggaggcggatccggcggcggaggcgaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtccagcctggagggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagcacatacgctatgaattgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggttggaaggatcaggtccaagtacaacaattatgcaacctactatgccgactctgtgaaggatagattcaccatctcaagagatgattcaaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgaaaaccgaggacacggccgtgtattactgtgtgagacacggtaacttcggcaattcttacgtgtcttggtttgcttattggggacaggggacactggtgactgtgtcttccggaggatgtggcggtggaaaagtggccgcactgaaggagaaagttgctgctttgaaagagaaggtcgccgcacttaaggaaaaggtcgcagccctgaaagag

这种DART-A w/Fc形式2构建体的第二多肽链在从N-末端至C-末端方向上包括能够结合CD3的单克隆抗体的VL结构域(VL_CD3)、间插接头肽(接头1)和能够结合CD123的单克隆抗体的VH结构域(VH_CD123)。分子的该部分(经接头2)连接至E-螺旋结构域。因此，这种DART-A>

第三多肽链包括IgG Fc结构域的CH2和CH3结构域。优选的多肽由肽1(SEQ ID NO:55)和Fc结构域的CH2和CH3结构域(SEQ ID NO:11)组成并且具有SEQ ID NO:54的序列。

为了评估上面提到的CD123 x CD3双特异性双抗体(DART-A、DART-A w/ABD、DART-A w/Fc、DART-B)的活性，产生对照双特异性双抗体(对照DART)。对照DART能够同时结合FITC和CD3。其两条多肽链各具有下述序列：

对照DART链1(SEQ ID NO:19):

DVVMTQTPFSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLRWYLQKPGQSPKVLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSGGCGGGEVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEK

对照DART链2(SEQ ID NO:20):

QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPWTPARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGGGGSGGGGEVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSGGCGGGKVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE

IV.药学组合物

本发明的组合物包括可用于制造药物组合物(例如不纯的或非无菌的组合物)和药物组合物(即适合施用于受试者或患者的组合物)的散装(bulk)药物组合物，其可用来制备单位剂型。这类组合物包含预防有效量或者治疗有效量的本发明序列-优化的CD123 xCD3双特异性双抗体，或这类剂以及药学上可接受的载体的组合。优选地，本发明的组合物包括预防或治疗有效量的本发明的序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体和药学上可接受的载体。

本发明也包括药学组合物，其包括本发明的序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体，和对具体癌症抗原特异的第二治疗性抗体(例如，肿瘤特异性单克隆抗体)，以及药学上可接受的载体。

在具体实施方式中，术语“药学上可接受的”表示获得联邦政府或州政府管理结构的许可或列于美国药典(U.S.Pharmacopeia)或其他通常获得认可的药典中，供用于动物，特别是用于人类。术语“载体”指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂(例如弗氏佐剂(完全和不完全)、赋形剂或媒介。这类药用载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动物油、植物油或合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用药物组合物时，水是优选的载体。盐水溶液和含水右旋糖以及甘油溶液可以用作液体载体，特别是对于可注射溶液而言。合适的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、滑石粉(chalk)、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉(dried skim milk)、甘油、丙烯、1,2-乙二醇、水、乙醇等。若需要，组合物也可以含有小量湿润剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可以采用溶液、悬浮剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、缓释制剂等形式。

通常，本发明组合物的成分被单独提供或以单位剂型的形式混合在一起，例如作为标明活性剂量的密封容器中的冻干粉或无水浓缩物，所述容器如安剖或袋(sachette)。当通过输注施用组合物时，其可以用含有无菌的药物级水或盐水的输注瓶分配。如果通过注射施用所述组合物，则可以提供一安剖注射用无菌水或盐水，以便可以在施用前混合所述组分。

可以将本发明的组合物配制为中性或盐形式。药学上可接受的盐包括但不限于用阴离子形成的盐，所述阴离子例如来源于盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的阴离子，以及用阳离子形成的盐，所述阳离子例如来自氢氧化纳、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。

本发明还提供了药物包装或试剂盒，其包含一个或多个容器，所述容器填充以单独的本发明的序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体或填充以所述双抗体和这类药学上可接受的载体。另外，用于治疗疾病的一种或多种其他预防性或治疗性剂也可以包括于所述药物包装或试剂盒中。本发明还提供了药物包装或试剂盒，其包含一个或多个容器，所述容器填充以本发明药物组合物的一种或多种成分。任选地与这类容器关联的可以是采用管理药物或生物产品的制造、使用或销售的政府机构规定的形的布告(notice)，所述布告反映了管理机构许可制造、使用或销售，供施用于人类。

本发明提供可用于上述方法的试剂盒。试剂盒可包括本发明的序列-优化的CD123x CD3双特异性双抗体。试剂盒可在一个或多个容器中进一步包括用于治疗癌症的一种或多种其他预防剂和/或治疗剂；和/或试剂盒可进一步包括结合与癌症相关的一种或多种癌症抗原的一种或多种细胞毒抗体。在某些实施方式中，其他预防剂或治疗剂是化疗剂。在其他实施方式中，预防剂或治疗剂是生物或激素治疗剂。

V.施用方法

通过向受试者施用有效量的本发明的融合蛋白或缀合分子或包括本发明融合蛋白或缀合分子的药物组合物，可以提供所述本发明的组合物用来治疗、预防和改善与疾病、病症或感染相关的一种或多种症状。在优选的方面，这类组合物基本上是纯的(即基本上不含限制其效果或产生不期望的副作用的物质)。在具体实施方式中，受试者是动物，优选哺乳动物，如非灵长类(例如牛、马、猫科动物、犬科动物、啮齿动物等)或灵长类(例如，猴子，如食蟹猴、人等)。在优选的实施方式中，受试者是人。

各种送递系统是已知的，并且可以用于施用本发明的组合物，例如封装于脂质体中、微粒、微胶囊、能表达抗体或融合蛋白的重组细胞、受体介导的内吞作用(见，例如，Wu等(1987)“Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNACarrier System,”J.Biol.Chem.262:4429-4432)，构建核酸作为逆转录病毒或其他载体的一部分等。

施用本发明分子的方法包括但不限于胃肠外施用(例如真皮内、肌肉内、腹腔内、静脉内以及皮下)、硬膜外以及粘膜(例如鼻内和口腔途径)。在具体实施方式中，肌肉内、静脉内或皮下施用本发明的序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体。组合物可以通过任何方便途径施用，例如通过输注或大丸剂注射、通过上皮膜或粘膜与皮肤膜(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，并且可以与其他生物活性剂一起施用。给药可以是全身的或局部的。另外，也可以应用肺给药，例如通过使用吸入器或喷雾器，并且与烟雾化剂一起配制。见，例如，美国专利号6,019,968、5,985,320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540和4,880,078；和PCT公开号WO 92/19244、WO 97/32572、WO 97/44013、WO98/31346和WO 99/66903，其每一篇通过参考以其整体并入本文。

本发明还使得本发明的序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体被包装于标有这类分子的量的密封的容器如安剖或袋中。在一实施方式中，本发明的序列-优化的CD123x CD3双特异性双抗体作为冻干无菌粉或无水浓缩物提供于密封容器中，并且可以用例如水或盐水重构至施用于受试者的适当浓度。优选地，本发明的序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体作为冻干无菌粉提供于密封容器中，其单位剂量为至少5μg、更优选地至少10μg、至少15μg、至少25μg、至少50μg、至少100μg、或至少200μg。

本发明冻干的序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体应在它们的原始容器中储存在2和8℃之间，并且分子应在重构之后的12小时，优选地6小时，5小时，3小时，或1小时内施用。在可选的实施方式中，本发明的序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体以液体形式提供在指示分子、融合蛋白或缀合分子的量和浓度的密封容器中。优选地，本发明液体形式的序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体提供在密封容器中，其中分子存在的浓度为至少1μg/ml，更优选地至少2.5μg/ml、至少5μg/ml、至少10μg/ml，至少50μg/ml、或至少100μg/ml。

有效治疗、预防或改善与病症相关的一个或多个症状的本发明的组合物的量可通过标准临床技术测定。制剂中采用的精确剂量也取决于施用的途径和病况的严重性，并且应根据从业者的判断和每个患者的情况决定。有效的剂量可从源自体外或动物模型测试系统的剂量响应曲线推断。

对于本发明包括的序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体，优选地基于接受受试者的体重(kg)测定施用至患者的剂量。施用的剂量通常从至少约0.3ng/kg每天至约0.9ng/kg每天，从至少约1ng/kg每天至约3ng/kg每天，从至少约3ng/kg每天至约9ng/kg每天，从至少约10ng/kg每天至约30ng/kg每天，从至少约30ng/kg每天至约90ng/kg每天，从至少约100ng/kg每天至约300ng/kg每天，从至少约200ng/kg每天至约600ng/kg每天，从至少约300ng/kg每天至约900ng/kg每天，从至少约400ng/kg每天至约800ng/kg每天，从至少约500ng/kg每天至约1000ng/kg每天，从至少约600ng/kg每天至约1000ng/kg每天，从至少约700ng/kg每天至约1000ng/kg每天，从至少约800ng/kg每天至约1000ng/kg每天，从至少约900ng/kg每天至约1000ng/kg每天，或至少约1,000ng/kg每天。

在另一实施方式中，患者施用的治疗方案包括一个或多个剂量的这种预防或治疗有效量的本发明包括的序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体，其中治疗方案在2天、3天、4天、5天、6天或7天内施用。在某些实施方式中，治疗方案包括间歇地施用本发明包括的预防或治疗有效量的序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体的剂量(例如，在给定周的第1天、第2天、第3天和第4天施用剂量并且在相同周的第5天、第6天和第7天不施用预防或治疗有效量的本发明包括的序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体的剂量)。典型地，有1、2、3、4、5或更多个治疗过程。每个过程可以是相同方案或不同的方案。

在另一实施方式中，在方案(一个或多个)的四分之一、二分之一或三分之二或四分之三(例如，在4个过程治疗的第一、第二或第三方案中)内逐渐增加施用的剂量，直到达到本发明包括的序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体的日预防或治疗有效量。

表1提供上面针对典型治疗过程描述的不同剂量方案的5个例子。

施用本发明的序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体的剂量和频率可通过修饰比如，例如，脂质化而增强序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体的吸收和组织渗透被降低或改变。

可计算施用至患者的本发明的序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体的剂量，以用作单一剂疗法。可选地，本发明的序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体结合其他治疗性组合物使用，并且施用至患者的剂量小于当所述分子作为单一剂疗法使用时的剂量。

本发明的药学组合物可局部施用至需要治疗的区域；这可通过例如，但不限于下述方式实现：局部输注、注射或移植物手段，所述移植物是多孔的、非多孔的或明胶材料，包括膜，如硅橡胶(sialastic)膜或纤维。优选地，当施用本发明的分子时，必须小心施用所述分子不吸收的材料。

本发明的组合物可在泡，尤其脂质体中递送(见Langer(1990)“New Methods OfDrug Delivery,”Science 249:1527-1533)；Treat等，在LiposomesintheTherapyofInfectiousDiseaseandCancer，Lopez-Berestein和Fidler(eds.)，Liss，New>

可以在控释系统或缓释系统中递送本发明的组合物。可以使用本领域技术人员已知的任何技术产生包含本发明的一种或多种序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体的缓释制剂。见例如美国专利第4,526,938号；PCT公开WO 91/05548；PCT公开WO 96/20698；Ning等(1996),“IntratumoralRadioimmunotheraphy Of A Human Colon CancerXenograft Using A Sustained Release Gel,”Radiotherapy&Oncology 39:179-189，Song等(1995)“Antibody Mediated Lung Targeting Of Long Circulating Emulsions,”PDA Journal of Pharmaceutical Science&Technology 50:372-397；Cleek等(1997)“Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For CardiovascularApplication,”Pro.Int’l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24:853-854；和Lam等(1997)“Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For LocalDelivery,”Proc.Int’l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24:759-760，其每一篇通过参考以其整体并入本文。在一种实施方式中，泵可用于控释系统中(见Langer，上文；Sefton，(1987)“Implantable Pumps,”CRC CRC Crit.Rev.Biomed.Eng.14:201-240；Buchwald等(1980)“Long-Term，Continuous Intravenous Heparin Administration By AnImplantable Infusion Pump In Ambulatory Patients With Recurrent VenousThrombosis,”Surgery 88:507-516；和Saudek等(1989)“A Preliminary Trial Of TheProgrammable Implantable Medication System For Insulin Delivery,”N.Engl.J.Med.321:574-579)。在另一实施方式中，聚合材料可用于实现分子的控释(见例如，MEDICAL APPLICATIONS OF CONTROLLED RELEASE，Langer和Wise(eds.)，CRC Pres.，Boca Raton，Florida(1974)；CONTROLLED DRUG BIOAVAILABILITY，DRUG PRODUCT DESIGNAND PERFORMANCE，Smolen和Ball(eds.)，Wiley，New York(1984)；Levy等(1985)“Inhibition Of Calcification Of Bioprosthetic Heart Valves By LocalControlled-Release Diphosphonate,”Science 228:190-192；During等(1989)“Controlled Release Of Dopamine From A Polymeric Brain Implant:In VivoCharacterization,”Ann.Neurol.25:351-356；Howard等(1989)“Intracerebral DrugDelivery In Rats With Lesion-Induced Memory Deficits,”J.Neurosurg.7(1):105-112)、美国专利号5,679,377、美国专利号5,916,597、美国专利号5,912,015、美国专利号5,989,463、美国专利号5,128,326、PCT公开号WO 99/15154和PCT公开号WO 99/20253)。缓释制剂所用的聚合物的实例包括但不限于聚(2-甲基丙烯酸羟乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、乙烯-乙烯基乙酸酯共聚物(poly(ethylene-co-vinyl acetate))、聚(甲基丙烯酸)、聚乙醇酸交酯(PLG)、聚酐、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚交酯(PLA)、丙交酯-乙交酯共聚物(PLGA)以及聚原酸酯(polyorthoeste)。控释系统可接近治疗靶标(例如，肺)布置，因此仅仅需要全身剂量的一部分(见，例如，Goodson，在MEDICAL APPLICATIONS OF CONTROLLED RELEASE，同上，2卷，115-138页(1984)中)。根据Dunn等(见U.S.5,945,155)，使用可用作控释移植物的聚合物组合物。该特定方法基于聚合物系统中生物活性材料原位控释的治疗效果。移植通常发生于患者身体内需要治疗的任何地方。使用非聚合物持续送递系统，由此受试者身体内的非聚合物移植物被用作药物送递系统。一旦移植到身体中，移植物的有机溶剂会从组合物中消散、分散或渗漏到周围组织液中，并且非聚合物材料会逐渐凝结或沉淀，形成固体微孔基质(参见U.S.5,888,533)。

控释系统在Langer(1990,“New Methods Of Drug Delivery,”Science 249:1527-1533)的综述中有论述。可以使用本领域技术人员已知的任何技术来生产包含本发明的一种或多种治疗剂的缓释制剂。见例如美国专利第4,526,938号；国际公开第WO 91/05548和WO 96/20698号；Ning等(1996)“IntratumoralRadioimmunotheraphy Of A HumanColon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel,”Radiotherapy&Oncology39:179-189,Song等(1995)“Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-CirculatingEmulsions,”PDA Journal of Pharmaceutical Science&Technology 50:372-397；Cleek等(1997)“Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody ForCardiovascular Application,”Pro.Int’l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24:853-854；and Lam等(1997)“Microencapsulation Of Recombinant Humanized MonoclonalAntibody For Local Delivery,”Proc.Int’l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24:759-760，每一上述文献通过引用以其整体并入本文。

在本发明的组合物是编码本发明的序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体的核酸时，核酸可体内施用，以通过如下方式促进其编码的序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体的表达：将核酸构建为适当的核酸表达载体的一部分并且施用它从而其成为细胞内的，例如，通过使用逆转录病毒载体(见美国专利号4,980,286)，或通过直接注射，或通过使用微粒轰击(例如，基因枪；生物弹道技术(Biolistic)，Dupont)，或用脂质或细胞-表面受体或转染剂涂覆，或通过使其与已知进入核的同源框样肽一起施用(见例如，Joliot等(1991)“Antennapedia Homeobox Peptide Regulates Neural Morphogenesis,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)88:1864-1868)等。可选地，可以将核酸引入细胞内并通过同源重组整合到宿主细胞DNA中，以进行表达。

用治疗或预防有效量的本发明的序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体治疗受试者可包括单一治疗或，优选地，可包括一系列治疗。在优选的实施例中，用本发明的序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体每周治疗受试者一次，持续约1至10周，优选地2至8周，更优选地约3至7周，和甚至更优选地约4、5或6周。本发明的药学组合物可一天施用一次，一天两次，或一天三次。可选地，药学组合物可一周施用一次，一周两次，每两周一次，一个月一次，每六周一次，每两个月一次，一年两次或每年一次。应当认识到，用于治疗的分子的有效剂量可以随着具体治疗的过程增加或降低。

VI.本发明的组合物的用途

本发明的序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体具有治疗任何与CD123的表达相关或特征在于CD123的表达的疾病或病况的能力。因此，这种分子可用于诊断或治疗急性髓细胞样白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)，包括CML的母细胞危象和与CML相关的Abelson癌基因(Bcr-ABL易位)、骨髓增生异常综合征(MDS)、急性B成淋巴细胞白血病(B-ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)，包括Richter综合症或CLL的Richter转化、毛细胞性白血病(HCL)、母细胞性浆细胞样树突细胞赘生物(BPDCN)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)，包括套细胞白血病(MCL)，和小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、霍奇金淋巴瘤、系统性肥大细胞增多症，和伯基特淋巴瘤(见实施例2)；自身免疫狼疮(SLE)、过敏症、哮喘和类风湿性关节炎，但不限于上述疾病或病况。本发明的双特异性双抗体可另外用于制造用于治疗上述病况的药物。

已经一般性描述了本发明，通过参考下述实施例本发明将更容易理解，通过示例的方式提供所述实施例并且不旨在限制本发明，除非另外说明。

实施例1

CD123 x CD3双特异性双抗体和对照蛋白质的构建

表2包含被表达和纯化的双特异性双抗体的列表。序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体(DART-A)和非序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体(DART-B)能够同时结合CD123和CD3。对照双特异性双抗体(对照DART)能够同时结合FITC和CD3。双特异性双抗体是所叙述的氨基酸序列的异源二聚体或异源三聚体。形成双特异性双抗体的方法提供在WO2006/113665、WO 2008/157379、WO 2010/080538、WO 2012/018687、WO 2012/162068和WO2012/162067中。

实施例2

对靶细胞进行抗体标记用于定量FACS(QFACS)

从培养物收获总计10⁶个靶细胞，重悬在FACS缓冲液(PBS+1％BSA+0.1％NaAzide)中的10％人AB血清中并且温育5min，阻断Fc受体。具有不同抗体结合能力的抗体标记微球(Antibody>TMSimply(QSC),BangsLaboratories,Inc.,Fishers,IN)和靶细胞用抗CD123PE抗体(BD Biosciences)根据制造商的说明进行标记。简言之，将一滴各种QSC微球添加至5mL聚丙烯管，并且以1μg/mL浓度将PE标记的抗CD123抗体添加至靶细胞和微滴二者中。在黑暗中4℃下温育管30分钟。通过添加2mL FACS缓冲液并且在2500 x G下离心5分钟，洗涤细胞和微球。洗涤之后，添加一滴空白微球群体。首先在流式细胞仪上分析微滴，以设置测试特定的仪器设置(instrumentsetting)(PMT电压和补偿)。使用相同的仪器设置，记录微球和靶细胞的几何平均荧光值。从微球群体的几何平均荧光产生微球群体上抗体结合位点的标准曲线。基于靶细胞的几何平均荧光使用QuickCal电子表(Bangs Laboratories)针对为微球产生的标准曲线计算靶细胞上的抗体结合位点。

为了测定用于评估CD123 x CD3双特异性双抗体的适当的靶细胞系，通过定量FACS(QFACS)评估在靶系Kasumi-3(AML)、Molm13(AML)、THP-1(AML)、TF-1(红白血病)和RS4-11(ALL)上的CD123表面表达水平。使用QFACS试剂盒计算细胞表面上CD123抗体结合位点的绝对数目。如表3中所显示，细胞系上CD123抗体结合位点的绝对数目的顺序为Kasumi-3(高)>Molm13(中)>THP-1(中)>TF-1(中低)>RS4-11(低)。三个最高表达细胞系是AML细胞系：Kasumi-3、MOLM13和THP-1。非AML细胞系：TF-1和RS4-11分别具有中–低/低表达的CD123。

实施例3

CTL细胞毒性试验(LDH释放试验)

用0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液分离附着靶肿瘤细胞并且通过以1000rpm离心5min进行收集。从培养物中收获悬浮靶细胞系，用试验培养基洗涤。通过锥虫蓝排斥使用Beckman Coulter Vi-细胞计数器测量细胞浓度和生存力。将靶细胞在试验培养基中稀释至4 x10⁵细胞/mL。将50μL稀释细胞悬液添加至96孔U-底细胞(bottom>

测量靶最大释放(MR)、抗体非依赖性细胞毒性(AICC)和靶细胞自发释放(SR)的三组对照如下设置：

1)MR:没有CD123 x CD3双特异性双抗体的200μL试验培养基和50μL靶细胞；在实验结束时添加的洗涤剂以测定最大LDH释放。

2)AICC:没有CD123 x CD3双特异性双抗体的50μL试验培养基，50μL靶细胞和100μL T细胞。

3)SR:没有CD123 x CD3双特异性双抗体的150μL培养基和50μL靶细胞。

CD123 x CD3双特异性双抗体(DART-A、DART-A w/ABD和DART-B)和对照首先稀释至4μg/mL的浓度，并且然后进行连续稀释下降至最终浓度为0.00004ng/mL(即，40fg/mL)。将50μL的稀释物添加至包含50μL靶细胞/孔的板。

用试验培养基洗涤纯化的T细胞一次并且以2x>6细胞/mL的细胞密度重悬于试验培养基中。将100μL中的2x>5个T细胞添加至每个孔，终效应器与靶细胞(E:T)比为10:1。在37℃下5％CO₂中温育板约18小时。

温育之后，将25μL的10x溶解液(Promega#G182A)或1mg/mL毛地黄皂苷添加至最大值释放对照孔，通过吹吸(pipetting)3次进行混合，并且温育板10min以完全溶解靶细胞。板在1200rpm下离心5分钟，并且将50μL的上清液从每个试验板孔转移至平底ELISA板和将50μl的LDH底物溶液(Promega#G1780)添加至每个孔。板在室温下(RT)黑暗中温育10-20min，然后添加50μL的终止液。在Victor2Multilabel板读取器(Perkin Elmer#1420-014)上在490nm下1小时之内测量光密度(O.D.)。如下所述计算细胞毒性的百分数并且使用GraphPad软件产生剂量响应曲线。

从O.D.数据使用下述式计算比细胞溶解：

细胞毒性(％)＝100x(样品的OD–AICC的OD)/(MR的OD–SR的OD)

重定向杀伤具有不同水平CD123表面水平的靶细胞系:

CD123 x CD3双特异性双抗体以亚-ng/mL(sub-ng/mL)范围内实现50％的最大活性(EC50)需要的浓度显示有效的重定向杀伤能力，不考虑具有高CD123表达，Kasumi-3(EC50＝0.01ng/mL)(图4图D)，中CD123-表达，Molm13(EC50＝0.18ng/mL)和THP-1(EC50＝0.24ng/mL)(图4，分别为图C和E)和中低或低CD123表达，TF-1(EC50＝0.46ng/mL)和RS4-11(EC50＝0.5ng/mL)(图4，分别为图B和A)的靶细胞系中的CD3抗原决定部位结合特异性(DART-A对DART-B)。类似地，也用具有来自不同供体的T细胞的多靶细胞系观察到了CD123x CD3双特异性分子介导的重定向杀伤并且在不表达CD123的细胞系中没有观察到重定向杀伤活性。结果总结在表4中。

尽管重复该实施例是必要的，但是应认识到本领域技术人员在合理的和可接受的限制内，可以适于重复所述结果的方式改变上述方案。因此，举例的方案不旨在限于具体的严格方式。

实施例4

通过序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体(DART-A、DART-A w/ABD和DART-Aw/Fc)的重定向杀伤期间的T细胞活化

序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体显示有效的重定向杀伤能力，无论在具有高CD123表达，Kasumi-3，和中THP-1，CD123-表达，(图5，分别为图A和B)的靶细胞系中是否存在半衰期延长技术(DART-A对DART-A w/ABD对DART-A w/Fc)。为了表征序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体介导重定向杀伤过程期间的T细胞活化，来自重定向杀伤试验的T细胞针对T细胞活化标记物CD25被染色，并且通过FACS被分析。如图5中图D所显示，CD8T细胞中的CD25以剂量依赖性方式被上调，表示序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体在重定向杀伤的过程中诱导T细胞活化。相反地，在没有靶细胞的情况下，没有活化CD8T细胞(图5，图C)，表示序列-优化的CD123x CD3双特异性双抗体在没有靶细胞的情况下不激活T细胞。同样地，当与靶细胞和对照双特异性双抗体(对照DART)一起温育时，CD8T细胞不被激活(图5，图D)，表示需要用序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体交联T细胞和靶细胞。

实施例5

粒酶B和穿孔蛋白的细胞内染色

为了测定T细胞中粒酶B和穿孔蛋白的细胞内水平，如上述设置CTL试验。约18小时之后，来自试验板的细胞用抗CD4和抗CD8抗体通过在4℃下温育30分钟进行染色。表面染色之后，细胞在100μL固定和透化缓冲液(BD BioSciences)中在4℃下温育20min。用透化/洗涤缓冲液(BD BioSciences)洗涤细胞并且在50μL的粒酶B和穿孔蛋白抗体混合物(在1X透化/洗涤缓冲液中制备)中在4℃下温育30分钟。然后用250μL透化/洗涤缓冲液洗涤细胞并且重悬于透化/洗涤缓冲液中，用于FACS收集。

重定向杀伤期间T细胞中通过序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体(DART-A)上调粒酶B和穿孔蛋白

为了研究序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体(DART-A)介导的T细胞的细胞毒性的可能的机制，测量T细胞中重定向杀伤之后细胞内粒酶B和穿孔蛋白水平。在用DART-A温育T细胞和Kasumi-3细胞之后观察到CD8和CD4T细胞二者中粒酶B和穿孔蛋白水平的剂量依赖性上调(图6，图A)。有趣地，与CD4T细胞相比，CD8T细胞中的上调几乎高两倍(图6，图A)。当在存在粒酶B和穿孔蛋白抑制剂的情况下进行试验时，没有观察到细胞杀伤。当T细胞用Kasumi-3靶细胞和对照双特异性双抗体(对照DART)温育时，CD8或CD4T细胞中没有粒酶B或穿孔蛋白的上调(图5，图B)。这些数据指示DART-A介导的靶细胞杀伤可通过粒酶B和穿孔蛋白机制介导。

实施例6

序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体(DART-A)的体内抗肿瘤活性

从人全血分离PBMC和T细胞

通过使用Ficoll梯度离心从全血分离来自健康的人供体的PBMC。简单地，用无菌PBS1:1稀释全血。三十五ml的稀释血液在50-mL管的15mL Ficoll-Paque^TM>6细胞/mL的终浓度。

T细胞分离:通过阴性选择从来自人全血的PBMC使用Dynabeads Untouched HumanT Cell(Dynabeads未接触的人T细胞)分离试剂盒(Life Technologies)根据制造商的说明分离未接触的T细胞。分离之后，在具有10％FBS，1％青霉素/链霉素的RPMI培养基中培养T细胞过夜。

肿瘤模型

以1:5比组合人T细胞和肿瘤细胞(Molm13或RS4-11)(分别1x>6和5x>6)并且悬浮在200μL的无菌生理盐水中并且在研究的第0天(SD0)皮下(SC)注射。序列-优化的CD123x>

静脉内(IV)施用，如表5(MOLM13)和表6(RS4-11)中概括。

数据收集和统计分析:

动物体重-在肿瘤细胞注射开始时每周记录个体动物体重两次直到研究结束。

垂死率(Moribundity)/死亡率-每周两次观察动物的一般垂死率和每天观察死亡率。基于包括总体观察和体重减轻的因素，动物死亡评估为药物相关的或技术的；每天记录动物死亡。

肿瘤体积-从肿瘤植入的一周内开始，每周两次记录个体肿瘤体积和持续直到研究结束。

通过数据计，检查经历技术或药物相关死亡的动物。

肿瘤生长抑制-使用下式计算每个包含治疗(处理)动物的组的肿瘤生长抑制(TGI)值：

通过TGI计算，检查经历部分或完全应答的动物，或经历技术或药物相关死亡的动物。化合物活性的国家癌症研究所(National Cancer Institute)标准是TGI>58％(Corbett等(2004)Anticancer Drug Development Guide；Totowa，NJ:Humana 99-123)。

部分/完全肿瘤应答–在第1天具有小于1mm³肿瘤测量的个体小鼠归类为具有部分应答(PR)并且使用下式测定肿瘤退化百分数(％TR)值：

缺少明显肿瘤的个体小鼠被归类为经历完全应答(CR)。

肿瘤体积统计–在治疗组和对照组之间进行统计分析，比较肿瘤体积。为了这些分析，采用双因素方差分析，随后应用Bonferroni后检验。使用GraphPad软件(版本5.02)进行所有分析。通过分析，检查来自经历技术或药物相关死亡的个体动物的体重和肿瘤数据。但是，来自报告部分或完全应答的动物的肿瘤数据包括在这些计算中。

MOLM13结果

AML细胞系MOLM13与活化的T细胞预混合并且在SD0，SC植入NOD/SCIDγ(NSG)敲除小鼠中(N＝8/组)，如上详述。媒介处理组(单独MOLM13细胞或加T细胞)中的MOLM13肿瘤显示体内相对侵略性(aggressive)的生长特征(图7，图A和B)。在SD8，肿瘤媒介处理组的平均肿瘤体积是129.8±29.5mm³并且到SD15，肿瘤已经达到的平均体积为786.4±156.7mm³。在SD18实验结束时，肿瘤已经达到的平均体积为1398.8±236.9mm³。

在植入肿瘤细胞/T细胞混合物的同一天[(SD0)]开始DART-A的治疗，并且随后继续每天注射进行另外7天，总共8天注射。以9个剂量水平(0.5、0.2、0.1、0.02和0.004mg/kg和20、4、0.8和0.16μg/kg)用DART-A治疗动物。结果显示在图7，图A(0.5、0.2、0.1、0.02，和0.004mg/kg)和图7，图B(20、4、0.8和0.16μg/kg)中。到研究第11天，MOLM13肿瘤的生长被0.16、0.5、0.2、0.1、0.02和0.004mg/kg剂量水平显著抑制(p<0.001)。而且，以20和4μg/kg剂量水平治疗负载MOLM13肿瘤小鼠分别产生8/8和7/8CR。在SD18实验结束时，用DART-A以0.8–20μg/kg)治疗的肿瘤的平均体积范围从713.6.0±267.4至0mm³，所有这些显著比媒介处理的对照组中肿瘤更小。TGI值对于20、4和0.8μg/kg剂量组分别是100、94和49％。与媒介处理的MOLM13肿瘤细胞组相比较，接收20和4μg/kg剂量水平DART-A的组到SD15达到统计显著性，而用0.8μg/kg治疗的组在SD18达到统计显著性。

RS4-11结果

ALL细胞系RS4-11与活化的T细胞预混合并且在NOD/SCIDγ敲除小鼠(N＝8/组)中在SD0SC植入，如上详述。媒介处理组(单独RS4-11细胞或加T细胞)中的RS4-11肿瘤显示体内相对侵略性的生长特征(图8)。

在植入肿瘤细胞/T细胞混合物的同一天[(SD0)]开始用DART-A进行治疗，并且随后继续每天注射进行另外3天，总共4天注射。以5个剂量水平(0.5、0.2、0.1、0.02和0.004mg/kg)用DART-A治疗动物。结果显示在图8中。

在Winn模型的情况下，当在注入的当天开始给药并且持续3天或更多连续天时，序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体(DART-A)有效抑制在NOD/SCID小鼠中SC植入的MOLM13AML和RS4-11ALL肿瘤的生长。基于国家癌症研究所确定的标准，0.1mg/kg剂量水平和更高(TGI>58)的DART-A认为在RS4-11模型中有活性，并且0.004mg/kg和更高的DART-A剂量在MOLM13模型中有活性。与RS4-11模型相比抑制MOLM13模型中肿瘤生长相关的较低的DART-A剂量与体外数据一致，表明MOLM13细胞具有比RS4-11细胞更高水平的CD123表达，其与对MOLM13细胞中体外DART-A介导细胞毒性增加的灵敏度相关联。

尽管重复该实施例是必要的，但是应认识到本领域技术人员在合理的和可接受的限制内，可以适于重复所述结果的方式改变上述方案。因此，举例的方案不旨在限于具体的严格方式。

实施例7

来自AML患者1的初级组织样品中白血病胚细胞和干细胞上的CD123表面表达

为了定义AML患者1初级样品中CD123表达模式，评估冷冻保存的原发性AML患者骨髓和PBMC样品的白血病胚细胞上的CD123表面表达。

AML骨髓样品–临床报道

年龄：42

性别：雌性

AML亚型：M2

基于形态的癌症细胞百分数：67.5％

骨髓免疫表型分型：

CD15＝19％、CD33＝98.5％、CD38＝28.8％、CD45＝81.8％、CD64＝39.7％、CD117＝42.9％、HLA-DR＝17％、CD2＝1.8％、CD5＝0.53％、CD7＝0.2％、CD10＝0.41％、CD19＝1.1％、CD20＝1.4％、CD22＝0.71％CD34＝0.82％

骨髓单核细胞(BM MNC)中的白血病胚细胞中的CD123表达

评估来自AML患者1总计0.5x10⁶骨髓单核细胞(BM>

实施例8

使用AML患者初级样本的自体CTL杀伤试验

将来自AML患者1的冷冻保存原发性AML样品(骨髓单核细胞(BMNC)和外周血单核细胞(PBMC))融解在具有10％FBS的RPMI1640中，并且允许在37℃下5％CO₂中过夜回收。用试验培养基(RPMI>2培养箱中温育板。在每个时间点，用CD4、CD8、CD25、CD45、CD33和CD123抗体使细胞染色。在配备CellQuest>

通过序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体(DART-A)在来自AML患者1的初级样本中进行自体肿瘤细胞消耗、T细胞扩展和活化

为了确定序列优化的CD123 x CD3双特异性双抗体(DART-A)在AML患者1中介导的活性，用0.1ng/mL或0.01ng/mL的DART-A温育患者样品，并且在处理后的不同时间点测量白血病胚细胞和T细胞的百分数。通过CD45+/CD33+门控鉴定白血病胚细胞。用DART-A温育原发性AML骨髓样品导致白血病细胞群体随着时间的消耗(图10，图A)，伴随着残留T细胞的伴随扩展(图10，图B)和T细胞活化标记物的诱导(图10，图C)。在DART-A治疗的样品中，T细胞到120小时从约7％扩展至约80％。通过CD4和CD8细胞上CD25表达测量的T细胞活化在72小时达到高峰并且到120小时时间点下降。

尽管重复该实施例是必要的，但是应认识到本领域技术人员，在合理的和可接受的限制内，可以适于重复所述结果的方式改变上述方案。因此，举例的方案不旨在限于具体的严格方式。

实施例9

来自ALL患者的初级组织样品中白血病胚细胞和干细胞上的CD123表面表达

为了定义ALL患者初级样品中的CD123表达模式，评估冷冻保存的原发性ALL患者PBMC样品在白血病胚细胞上的CD123表面表达。

外周血单核细胞(PBMC)中的白血病胚细胞中的CD123表达

评估来自健康供体和ALL患者总计0.5x10⁶个外周血单核细胞(PBMC)的CD123表达。如图11，图E-H中所显示，来自ALL骨髓的绝大部分细胞表达CD123。相反地，如在正常供体中期望的，B细胞是CD123阴性的，并且pDC和单核细胞是CD123阳性的(图11，图D)。

通过对CD4和CD8细胞染色鉴定ALL患者样品中的T细胞群体。如图12，图B中所显示，ALL患者样品中总PBMC的仅一小部分是T细胞(约0.5％的是CD4T细胞和约0.4％是CD8T细胞。

实施例10

使用ALL患者初级样本的自体CTL杀伤试验

将冷冻保存的原发性ALL样本(外周血单核细胞(PBMC))融解在具有10％FBS的RPMI1640中，并且允许在37℃下5％CO₂中回收过夜。用试验培养基(RPMI>2培养箱中温育。在每个时间点，用CD4、CD8、CD25、CD45、CD33和CD123抗体使细胞染色。在配备CellQuest>+和CD8⁺-门控的群体上的CD25MFI测定活化。通过CD45⁺CD33⁺门控鉴定白血病母细胞群体。

在ALL患者的初级样本中通过序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体(DART-A)进行的自体肿瘤细胞消耗、T细胞扩展和活化

为了确定序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体(DART-A)在ALL患者原发性患者样品中介导的活性，用1ng/mL的DART-A温育患者样品，并且在处理后的不同时间点测量白血病胚细胞和T细胞的百分数。通过CD45⁺/CD33⁺门控鉴定白血病胚细胞。与未处理的对照或对照DART相比，用DART-A温育原发性ALL骨髓样品导致白血病细胞群体随着时间的消耗(图13，图H对图F和G)。当T细胞被计数(CD8和CD4染色)和活化(CD25染色)被分析时，与未处理的或对照DART样品(图14，分别为图H、G、K和J)相比，T细胞扩展并且在DART-A样品中活化(图14，分别为图I和L)。

实施例11

AML患者2的初级组织样品中白血病胚细胞和干细胞上的CD123表面表达

为了定义AML患者2初级样品中的CD123表达模式，评估冷冻保存的原发性AML患者骨髓和PBMC样品在白血病胚细胞上的CD123表面表达。

骨髓单核细胞(BMNC)的白血病胚细胞中的CD123表达

评估AML患者2的总计0.5x10⁶骨髓单核细胞(BM>

实施例12

使用AML患者2初级样本的自体CTL杀伤试验

将来自AML患者2的冷冻保存的原发性AML样品(骨髓单核细胞(BM MNC)和外周血单核细胞(PBMC))融解在具有10％FBS的RPMI1640中，并且允许在37℃下5％CO₂中回收过夜。用试验培养基(RPMI>2培养箱中温育板。在每个时间点，用CD4、CD8、CD25、CD45、CD33和CD123抗体使细胞染色。在配备CellQuest>

AML患者2的初级样本中的自体肿瘤细胞消耗、T细胞扩展和活化

为了确定序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体(DART-A)在AML患者原发性患者2样品中介导的活性，用0.1或0.01ng/mL的DART-A温育患者样品，并且在处理后的不同时间点测量白血病胚细胞和T细胞的百分数。用DART-A温育原发性AML骨髓样品导致随着时间的白血病细胞群体的消耗(图16，图A)，伴随着残留T细胞的伴随扩展(CD4和CD8)(分别为图16，图B和图16，图C)。为了确定T细胞是否被活化，针对T细胞活化的两个标记物CD25或Ki-67，将细胞染色。如图17，图A和B中所显示，用DART-A温育原发性AML骨髓样品导致T细胞活化。这些数据表示144h时间点。

粒酶B和穿孔蛋白的细胞内染色

为了确定T细胞中粒酶B和穿孔蛋白的细胞内水平，设置CTL试验。在约18h之后，用抗CD4和抗CD8抗体通过在4℃下温育30分钟使来自试验板的细胞染色。表面染色之后，细胞在4℃下在100μl固定和透化缓冲液中温育20min。用透化/洗涤缓冲液洗涤细胞并且在1XPerm(透化)/洗涤缓冲液中制备的50μL的粒酶B和穿孔蛋白抗体混合物中4℃下温育30分钟。然后用250μl Perm/洗涤缓冲液洗涤细胞并且重悬于Perm/洗涤缓冲液中用于FACS收集。

在重定向杀伤期间通过序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体(DART-A)在T细胞上调粒酶B和穿孔蛋白。

为了研究序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体(DART-A)通过T细胞介导的细胞毒性的可能机制，在重定向杀伤之后测量T细胞中的细胞内粒酶B和穿孔蛋白水平。当T细胞用对照双特异性双抗体(对照DART)温育时，没有粒酶B和穿孔蛋白的上调。用序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体(DART-A)，在CD8和CD4T细胞中都观察到粒酶B和穿孔蛋白水平的上调(图17，图C和D)。有趣地，与CD4T细胞相比，CD8T细胞中的上调几乎高两倍(图17，图C和图17，图D)。这些数据表示DART-A介导的靶细胞杀伤通过粒酶B和穿孔蛋白通路介导。

实施例13

序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体与非人灵长类CD123和CD3蛋白交叉反应。

为了测量序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体(DART-A)和人或食蟹猴CD3之间的结合程度，进行BIACORE^TM分析。BIACORE^TM分析测量解离速率，kd。抗体和其靶之间的结合亲和力(KD)是根据下式结合(结合速率(on>a)和解离(解离速率(off-rate)，kd)的动力学常数的函数：KD＝[kd]/[ka]。BIACORE^TM分析使用表面等离子体共振以直接测量这些动力学参数。重组人或食蟹猴CD3直接被固定至支持物上。捕获纯化的人或食蟹猴CD123并且固定至支持物。测量解离的时间过程并且进行数据的二价拟合(bivalent>TM分析的结果显示在图18中。对食蟹猴CD123(图18D)和CD3(图18B)蛋白的结合亲和力与对人CD123(图18C)和CD3(图18A)蛋白的结合亲和力相当。

实施例14

用人和食蟹猴PBMC进行体外自体单核细胞消耗

来自人或食蟹猴全血样品的PBMC以150μL的试验培养基中200,000细胞/孔的细胞密度添加至U-底板。在试验培养基中制备序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体(DART-A或DART-A w/ABD)的稀释物。将50μL的每种DART-A或DART-A w/ABD稀释物添加至包含PBMC的板的两个孔中。在37℃下温育板～18-24h。上清液用于测定细胞毒性，如上述。如图19(图A和B)中所显示，在人(图19，图A)和食蟹猴PBMC(图19，图B)二者中观察到pDC细胞的消耗。这些结果指示循环pDC可在食蟹猴中用作临床前毒理学研究的药物动力学标记物。

尽管重复该实施例是必要的，但是应认识到本领域技术人员，在合理的和可接受的限制内，可以适于重复所述结果的方式改变上述方案。因此，举例的方案不旨在限于具体的严格方式。

实施例15

用序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体(DART-A)处理的食蟹猴中的浆细胞样树突细胞消耗

作为发现剂量范围的毒理学研究的一部分，以0.1、1、10、30、100、300或1000ng/kg剂量，作为4-天输注对食蟹猴施用序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体(DART-A)。以100ng/kg施用对照DART。为了鉴定食蟹猴PBMC中的pDC和单核细胞群体，用CD14-FITC抗体标记细胞。单核细胞鉴定为CD14⁺群体并且pDC鉴定为CD14^-CD123⁺群体。如图20图K和L中所显示，在用少至10ng/kg>

图21和图22提供对B细胞(CD20⁺)(图21，图A)，单核细胞(CD14⁺)(图21，图B)，NK细胞(CD159⁺CD16⁺)(图21，图C)，pDC(CD123^HI，CD14^-)(图21，图D)，和T细胞(总的，CD4⁺，和CD8⁺)(分别为图22，图A，图22，图B，和图22，图D)的FACS分析的结果。

用对照DART处理猴子对T或B淋巴细胞、NK细胞、单核细胞和pDC没有显著的影响。用DART-A以10ng/kg/d或更高剂量处理猴子导致pDC的消除(图21，图D)。pDC的消耗是完全的和持久的，在完成给药之后的数周回到给药前水平。当施用DART-A时，T淋巴细胞的循环水平下降，但是在每周循环结束时回到给药前水平，表明是运输(trafficking)的改变而不是真正的消耗。CD4和CD8T淋巴细胞二者按照相同的模式。T-淋巴细胞活化标记物，CD69(图22，图C)，在循环细胞中仅仅是可疑阳性的(marginally positive)，并且不跟踪DART-A给药。B淋巴细胞、单核细胞和NK细胞随着DART-A给药变动，在猴子中观察到实质变化。在最高剂量的两个猴子中都观察到增加的循环水平的B淋巴细胞和单核细胞的趋势。

总之，上述结果表明了序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体(DART-A)的治疗性效力。序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体(DART-A)可用作用于治疗多种疾病和病况的治疗剂，所述疾病和病况包括：AML、ABL(ALL)、CLL、MDS、pDCL、套细胞白血病、毛细胞性白血病、CLL的Ricter转化、CML的母细胞危象、BLL(亚型是CD123+)(见实施例2)；自身免疫狼疮(SLE)、过敏症(嗜碱性粒细胞是CD123+)、哮喘等。

实施例16

序列-优化的CD123 x CD3双特异性双抗体(DART-A)和非序列-优

化的CD123 xCD3双特异性双抗体(DART-B)的可比较性质

序列-优化的CD123xCD3双特异性双抗体出人意料的优势和特性

如上讨论，类似地设计DART-A和DART-B并且两个构建体的第一多肽在从N-末端至C-末端方向上包括N-末端、能够结合CD3的单克隆抗体的VL结构域(VL_CD3)、间插接头肽(接头1)、能够结合CD123的单克隆抗体的VH结构域(VH_CD123)、接头2、E-螺旋结构域和C-末端。同样地，两个构建体的第二多肽在从N-末端至C-末端方向上包括N-末端、能够结合CD123的单克隆抗体的VL结构域(VL_CD123)、间插接头肽(接头1)、能够结合CD3的单克隆抗体的VH结构域(VH_CD3)、接头2、K-螺旋结构域和C-末端。

如实施例1中指示，发现CD123 x CD3双特异性双抗体能够同时结合CD3和CD123。另外，如实施例3和图4，图C和D中公开，两种CD123 x CD3双特异性双抗体以亚ng/mL范围实现50％的最大活性(EC50)需要的浓度展示有效的重定向杀伤能力，不考虑具有高CD123表达的靶细胞系中CD3抗原决定部位结合特异性(DART-A对DART-B)。因此，CD123 x CD3双特异性双抗体具体序列的微小改变不完全消除生物活性。

但是，在所有测试的细胞系中，发现DART-A比DART-B更有活性和更有效重定向杀伤(见，例如，图4，图A、C和D)。因此DART-A展示比类似的DART-B出人意料的优势。

实施例17

用于治疗血液恶性肿瘤的DART-A非人灵长类药理学

白介素3(IL-3)受体α链CD123在宽范围的血液恶性肿瘤中的恶性细胞上过表达(Munoz，L.等(2001)“Interleukin-3Receptor Alpha Chain(CD123)Is Widely ExpressedIn Hematologic Malignancies,”Haematologica 86:1261-1269；Testa,U.等(2014)“CD123 Is A Membrane Biomarker And A Therapeutic Target In HematologicMalignancies,”Biomark.Res.2:4)，并且与差的预后相关(Vergez,F.等(2011)“HighLevels Of CD34+CD38low/-CD123+Blasts Are Predictive Of An Adverse Outcome InAcute Myeloid Leukemia:A Groupe Ouest-Est Des Leucemies Aigues Et Maladies DuSang(GOELAMS)Study,”Haematologica 96:1792-1798)。而且，已经报道CD123由白血病干细胞(LSC)表达(Jordan,C.T.等(2000)“The Interleukin-3Receptor Alpha Chain Is AUnique Marker For Human Acute Myelogenous Leukemia Stem Cells,”Leukemia 14:1777-1784；Jin，L.等(2009)“Monoclonal Antibody-Mediated Targeting Of CD123,IL-3Receptor Alpha Chain,Eliminates Human Acute Myeloid Leukemic Stem Cells,”Cell Stem Cell 5:31-42)，这是吸引人的特征，该特征确保靶向这种疾病的根本原因(root cause)。与该结论一致，CD123也参与维持白血病生成的IL-3自分泌环，如通过CD123-阻碍单克隆抗体降低白血病干细胞移植物移入和改善急性骨髓性白血病(AML)小鼠模型中存活的能力所显示(Jin,L.等(2009)“Monoclonal Antibody-Mediated TargetingOf CD123,IL-3 Receptor Alpha Chain,Eliminates Human Acute Myeloid LeukemicStem Cells,”Cell Stem Cell 5:31-42)。但是，在高风险AML患者的1期研究中，单克隆抗体不展示抗白血病活性(Roberts,A.W.等(2010)“A Phase I Study Of Anti-CD123Monoclonal Antibody(mAb)CSL360 Targeting Leukemia Stem Cells(LSC)In AML,”J.Clin.Oncol.28(Suppl):e13012)。因此，包括消耗策略的可选的CD123-靶向方法是期望的。尽管正常造血祖细胞(HPC)的亚型表达CD123，造血干细胞(HSC)几乎不表达至不表达CD123(Jordan，C.T.等(2000)“The Interleukin-3Receptor Alpha Chain Is A UniqueMarker For Human Acute Myelogenous Leukemia Stem Cells,”Leukemia 14:1777-1784；Jin，W.等(2009)“Regulation Of Th17 Cell differentiation And EAE InductionBy MAP3K NIK,”Blood 113:6603-6610)，表明CD123细胞-消耗策略允许经正常造血作用进行重构。

使得患者自身的T淋巴细胞靶向白血病细胞代表了有希望的治疗血液恶性肿瘤的免疫治疗策略。该方法的治疗潜能已经使用患有B细胞淋巴瘤和B-前体急性成淋巴细胞白血病的患者中的blinatumomab(能够结合CD3和B细胞CD19抗原的基于双特异性抗体的BiTE)被尝试过(Klinger，M.等(2012)“Immunopharmacologic Response Of PatientsWith B-Lineage Acute Lymphoblastic Leukemia To Continuous Infusion Of T Cell-Engaging CD19/CD3-Bispecific BiTE Antibody Blinatumomab,”Blood 119:6226-6233；Topp，M.S.等(2012)“Long-Term Follow-Up Of Hematologic Relapse-Free Survival InA Phase 2Study Of Blinatumomab In Patients With MRD In B-Lineage ALL,”Blood120:5185-5187；Topp，M.S.等(2011)“Targeted Therapy With The T-Cell-EngagingAntibody Blinatumomab Of Chemotherapy-Refractory Minimal Residual Disease InB-Lineage Acute Lymphoblastic Leukemia Patients Results In High Response RateAnd Prolonged Leukemia-Free Survival,”J.Clin.Oncol.29:2493-2498)。

本发明的CD123 x CD3双特异性双抗体分子，比如DART-A，包括可选的基于双特异性抗体的模式(modality)，其提供改善的稳定性和更有力的制造性质(Johnson，S.等(2010)“Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And In Vivo B-CellDepletion,”J.Mol.Biol.399:436-449；Moore，P.A.等(2011)“Application Of DualAffinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell KillingOf B-Cell Lymphoma,”Blood 117:4542-4551)。

为了表明本发明CD123 x CD3双特异性双抗体分子的卓越性和效力，确认了上述DART-A的在体外和白血病的临床前模型中的生物活性，并且相对于上述对照DART(对CD3和荧光素双特异性)或对CD123和荧光素双特异性)的“对照DART-2”，在短尾猴(cynomolgusmacaques)(短尾猿，Macaca fascicularis)中评估了其药代动力学，药物动力学和安全药理学。

“对照DART-2”的第一多肽链的氨基酸序列(CD123VL─接头─4-4420VH─接头─E-螺旋；接头加下划线)(SEQ ID NO:58):

DFVMTQSPDS LAVSLGERVT MSCKSSQSLL NSGNQKNYLT WYQQKPGQPP

KLLIYWASTR ESGVPDRFSG SGSGTDFTLT ISSLQAEDVA VYYCQNDYSY

PYTFGQGTKL EIKGGGSGGGGEVKLDETGG>

SDYWMNWVRQ SPEKGLEWVA QIRNKPYNYE TYYSDSVKGR FTISRDDSKS

SVYLQMNNLR VEDMGIYYCT GSYYGMDYWG QGTSVTVSSGGCGGGEVAAL

EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEK

“对照DART-2”的第二多肽链的氨基酸序列(4420VL─接头─CD123VH─接头─K-螺旋)(SEQ ID NO:59):

DVVMTQTPFSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLRWYLQKPGQSPK

VLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVP

WTFGGGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVQSGAELKKPGASVKVSCKASGYTFT

DYYMKWVRQAPGQGLEWIGDIIPSNGATFYNQKFKGRVTITVDKSTSTAY

MELSSLRSEDTAVYYCARSHLLRASWFAYWGQGTLVTVSSGGCGGGKVAA

LKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE

双功能ELISA

在室温下，用PBS(PBST/BSA)中的0.5％BSA、0.1％Tween-20封闭用碳酸氢盐缓冲液中可溶性人或食蟹猴IL3R-α(0.5μg/mL)涂覆过夜的MaxiSorp ELISA板(Nunc)30分钟。施加DART-A分子，随后连续添加人CD3εδ-生物素和链霉抗生物素HRP(JacksonImmunoResearch)。通过将四甲基联苯胺(BioFX)转化为底物5min检测HRP活性；用40μL/孔的1％H₂SO₄终止反应并且在450nm下读取吸光度。

表面等离子体共振分析

使用BIAcore 3000生物传感器(biosensor)(GE，Healthcare)分析DART-A结合人和食蟹猴CD3或CD123蛋白的能力，如Johnson，S.等(2010)(“Effector Cell RecruitmentWith Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent TumorCytolysis And In Vivo B-Cell Depletion,”J.Mol.Biol.399:436-449)和Moore，P.A.等(2011)(“Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve OptimalRedirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma,”Blood 117:4542-4551)描述。简言之，通过注射0.2M N-乙基-N-(3二乙氨基-丙基)碳二亚胺和0.05M N-羟基-琥珀酰亚胺活化CM5传感器芯片上的羧基基团。将可溶性CD3或CD123(1μg/ml)注射在10mM钠-乙酸酯，pH5.0中的活化的CM5表面上，流速为5μL/min，随后注射1M乙醇胺用于钝化。在10mM HEPES，pH7.4，150mM NaCl，3mM EDTA和0.005％P20表面活性剂中进行结合实验。通过脉冲注射10mM甘氨酸，pH 1.5进行固定的受体表面的再生。通过将结合曲线整体拟合至Langmuir 1:1结合模型测定KD值(BIA评估软件v4.1)。

细胞杀伤试验

用于细胞杀伤试验的细胞系获得自美国菌种保藏中心(ATCC)(Manassas，VA)。使用Ficoll-Paque Plus试剂盒(GE Healthcare)，将PBMC从健康的供体血液分离；用阴性选择试剂盒(Life Technologies)纯化T细胞。使用Quantum Simply细胞珠(BangsLaboratories，Inc.，Fishers，IN)测定CD123细胞-表面密度。如Moore，P.A.等描述，进行细胞毒性试验(2011)(“Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules ToAchieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma,”Blood 117:4542-4551)。简言之，用连续稀释的DART-A或对照DART蛋白质在存在T细胞的情况下以指示的效应细胞：靶细胞比处理靶细胞系(10⁵细胞/mL)，并且在37℃温育过夜。随着培养物上清液中乳酸脱氢酶(LDH，Promega)的释放测定细胞杀伤。对于基于流式(flow-based)的杀伤，用CMTMR(Life>5软件(GraphPad)分析数据并且表示为细胞毒性百分数。

食蟹猴药理学

在Charles River实验室(Reno，NV)根据当地机构动物管理及使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC)的指南进行非人灵长类实验。使用电池供电的可编程输注泵(SIMS Deltec,Inc.,St.Paul,MN)，通过股和颈静脉端口经静脉内输注向为目的饲养的、中国起源的幼稚食蟹猴(Macacafascicularis)(年龄范围2.5-9年，体重范围2.7-5kg)提供媒介或DART-A。在指定的时间点将外周血或骨髓样品收集在包含抗凝血剂的管中。用配备488nm、640nm和405nm激光器的LSR Fortessa分析器(BD Biosciences)和下述抗体进行细胞-表面表型分析：CD4-V450、CD8-V450、CD123-PE-Cy7、CD45-PerCP、CD4-APC-H7、CD8-FITC、CD25-PE-Cy7、CD69-PerCP、PD-1-PE、TIM3-APC、CD3-Pacific Blue、CD95-APC、CD28-BV421、CD16-FITC、CD3-Alexa488、CD38-PE、CD123-PE-Cy7、CD117-PerCP-Cy5.5、CD34-APC、CD90-BV421、CD45RA-APC-H7和CD33-APC(BD Biosciences)。使用TruCOUNT(BD Biosciences)测定细胞的绝对数目。用非人灵长类Th1/Th2细胞因子细胞计数珠阵列试剂盒(Cytokine Cytometric Bead ArrayKit)(BD Bioscience)测量IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、TNF-α和IFN-γ细胞因子的血清水平。使用具有电化学发光检测(MesoScale Diagnostics，MSD，Rockville，MD)的夹心免疫测定测量猴子血清样品中DART-A的浓度。简言之，用重组人IL-3Ra(R&D System)涂覆试验板(MSD)并且用5％BSA封闭。施加校准标准品或稀释测试样品，随后添加显示对上述分子的E-螺旋(SEQ ID NO:34)和K-螺旋(SEQ ID NO:35)结构域特异性结合的生物素化的单克隆抗体。添加SULFO-TAG^TM标记的链霉抗生物素缀合物(MSD)，并且在MSD成像器中分析复合物的形成。从通过将光强度数据拟合在五参数逻辑模型中产生的标准曲线测定DART-A浓度。

纯化的DART-A的物理化学表征显示分子量为58.9kDa的均质异源二聚物(图23；图24A-24B)，其在2–8℃下PBS中稳定多达12个月。SPR分析表明DART-A与对应的可溶性人和食蟹猴CD3和CD123抗原几乎相同的结合亲和力(图25A-25D和表7)。此外，DART-A同时结合采用用于捕获的人或猴子CD123和用于检测的人CD3的ELISA形式的抗原(图26A-26B)，并且表明与人和猴子T淋巴细胞类似的结合(图26C-26E)。表7中的数据是3个独立实验的平均值，每个实验重复一次。

DART-A通过人或食蟹猴T淋巴细胞介导重定向杀伤

DART-A通过抗CD123+Kasumi-3白血病细胞系的人或猴子效应细胞介导重定向靶细胞杀伤(图27A-27D)，其伴随着活化标记物的诱导。没有观察到抗CD123-阴性靶标(U937细胞)的活性或用对照DART的活性，表明T细胞活化严格依赖于靶细胞结合，并且CD3通过DART-A的单价结合不足以触发T细胞活化。因为CD123被包括pDC和单核细胞的正常循环白细胞的亚型表达(图27E)，所以进一步研究正常人和猴子PBMC中的DART-A的作用。

在人PBMC中观察到分级作用，早在开始处理后的3小时观察到CD14^-CD123^高细胞(pDC和嗜碱性粒细胞)的剂量依赖性快速消耗，而单核细胞(CD14+细胞)此时间点仍不受影响(图27F-27G)。CD14^-CD123^高细胞消耗在所有DART-A分子浓度下随着时间增加，而单核细胞到6小时稍微下降并且仅仅在18小时之后并且浓度大于1ng/mL时被消耗。用DART-A温育猴子PBMC导致相当的CD14^-CD123^高细胞的剂量依赖性消耗(图27H)，进一步支持该种类对DART-A药理学的相关性(CD14+猴子细胞几乎不表达至不表达CD123并且不被消耗)。

食蟹猴中的DART-A的药代动力学

食蟹猴被选择为用于DART-A分析的合适药理学模型，这是基于两个靶抗原在该物种中相比于在人中的等价分布，其中在人中的分布是基于用前体mAb的免疫组织化学，与公开的信息一致(Munoz，L.等(2001)“Interleukin-3Receptor Alpha Chain(CD123)IsWidely Expressed In Hematologic Malignancies,”Haematologica 86:1261-1269；Korpelainen,E.I.等(1996)“IL-3Receptor Expression,Regulation And Function InCells Of The Vasculature,”Immunol.Cell Biol.74:1-7)。

根据本发明进行的研究包括6个治疗，每组由8个食蟹猴(4雄性，4雌性)组成(表8)。所有的组第一次输注接收媒介对照；然后静脉内施用媒介或DART-A，达4个周周期(4weekly cycles)。第1组动物的所有4次随后的输注均接收媒介对照，而第2-5组对于所有随后的输注均接收每周逐渐增加剂量的DART-A，一周4天。第6组动物对于所有的输注均以每周7-天连续的逐渐增加剂量的DART-A处理。设计4-天-输注/3-天-不输注和7-天-输注计划以区分与DART-A施用相关的持久性作用和瞬间作用。在处理期结束时(第36天)，处死每组的两个雄性和2个雌性，而剩余的猴子在4-周恢复后(第65天)进行尸体剖检。猴子的亚群发展了针对CD3和CD123二者的人源化Fv的抗药物抗体(ADA)并且从PK分析中排除在出现ADA之后的数据点。在研究期间，所有的猴子暴露于DART-A。

二室模型用于评估PK参数(表9和图28)。T_1/2α短(4-5min)，反映与循环靶标快速结合；T_1/2β也是快速的，如对该尺寸的分子预期的，其遭受肾清除。在每次输注结束时从第6组猴子收集的血清样品的分析显示DART-AC_max的剂量依赖性增加。表9中，媒介是PBS，pH>

DART-A-处理的食蟹猴中的细胞因子释放

基于之前的类似化合物的经验，考虑到DART-A的T细胞活化性质，预期伴随着输注的循环细胞因子的增加，因此低的开始剂量被用作“脱敏”策略(见，例如，Topp，M.S.等(2011)“Targeted Therapy With The T-Cell-Engaging Antibody Blinatumomab OfChemotherapy-Refractory Minimal Residual Disease In B-Lineage AcuteLymphoblastic Leukemia Patients Results In High Response Rate And ProlongedLeukemia-Free Survival,”J.Clin.Oncol.29:2493-2498；Bargou,R.等(2008)“TumorRegression In Cancer Patients By Very Low Doses Of A T Cell-EngagingAntibody,”Science 321:974-977)。测试的细胞因子中，IL-6显示输注后的最小量级的最大改变，尽管本质上是瞬时的，并且具有大的动物间和组间不同(图29A-29C)。在媒介输注之后也观察到IL-6小的瞬时增加(所有的第1组和所有的第1天输注)，指示该细胞因子对操作应激的敏感性。但是，在第一次DART-A输注(100ng/kg/天)之后，在一些猴子中看到血清IL-6的DART-A-依赖性增加(<80pg/mL)，其到72小时回到基线。有趣地，IL-6释放的量级随着各连续DART-A输注而下降，甚至在剂量水平增加至多达1000g/kg/天时。也观察到血清TNF-α(<10pg/mL)的最小和瞬时DART-A相关的增加；如利用IL-6，在第一次输注之后观察到TNF-α释放的最大量级。当与对照比较时，在整个研究中，IL-5、IL-4、IL-2或IFN-γ的水平没有DART-A相关的改变。总之，响应用DART-A处理猴子的细胞因子释放是最小的、瞬时的并且表示经受试者内剂量递增易控制的第一剂量作用。

DART-A介导的循环CD14^-/CD123⁺白细胞的体内消耗

遍及整个研究测量CD14-/CD123+细胞的循环绝对水平作为药效终点。尽管对照组1中的CD123⁺细胞数量长时间保持稳定，在遍及所有活性治疗组的所有动物中，DART-A处理与可从开始第一次DART-A输注(100ng/kg/天)之后的第一时间点测量的(72小时)观察到的循环CD14-/CD123+细胞的剧烈消耗相关(从研究前基线的94-100％)(图30A-30C)。消耗是持久的，因为其在第2-5组中在每周3-天给药假期期间持续，仅仅在延长的恢复期间回到基线水平。为了消除DART-A掩盖或调节CD123的可能性(考虑到低的循环DART-A水平，这不太可能发生)，通过正交标记物CD303对pDC计数。与CD123数据一致，CD303+pDC在用DART-A处理的猴子中类似地被消耗(图30D-30F)。

循环T-淋巴细胞水平，活化和亚型分析

与循环CD123+细胞持续的消耗相反，按照4-天-输注/3-天-不输注计划施用的DART-A(组2-5)与循环T细胞的每周波动相关，而作为连续7-天输注的施用导致在第一次施用之后类似地降低的循环T细胞水平，其甚至在给药期间也缓慢恢复而没有波动(图31A-31C)。两个给药策略之间的差异指示DART-A对T淋巴细胞的作用与运输和/或边缘化(margination)一致，而不与消耗一致。停止给药之后，在恢复期的期间中，T细胞反弹至高于基线约2倍的水平。DART-A的输注与表达晚期活化标记物PD-1，尤其是在CD4+细胞中，的T细胞的暴露-依赖性、逐渐增加的频率相关，其中第6给药组展示最高的总体水平(图31D-31I和图32A-32F和图33A-33F)。在CD4+T细胞上没有检测到与T细胞枯竭相关的标记物Tim-3，并且在CD8+细胞(5.5-9.7％)和包括20.5-35.5％的CD8+/PD-1+双阳性细胞中为为低频率。在循环细胞中，在早期T细胞活化标记物CD69中没有一致的变化，并且仅CD25表达有适度变化。

为了排除体内暴露后的枯竭，比较分离自接收多次DART-A输注的食蟹猴的效应细胞的离体细胞毒素潜能与来自幼稚猴的细胞的离体细胞毒素潜能。如图34中所显示，分离自DART-A处理的猴子的PBMC显示与分离自幼稚猴子的细胞相当的细胞毒性，指示体内暴露于DART-A未不利影响T细胞杀伤靶细胞的能力。

DART-A暴露以对应的幼稚T细胞群体为代价增加中心记忆CD4细胞和效应记忆CD8+细胞的相对频率(图35A-35F和图32A-32F和图33A-33F)，指示DART-A暴露促进这些细胞的扩展和/或活动。

对血细胞生成和骨髓前体的影响

DART-A在以所有剂量测试的猴子中非常耐受；但是，在最高剂量下观察到了红细胞参数的可逆减少(图36A-36C)。频繁血液取样可能已经成为潜在的贡献因素，因为媒介处理的动物显示红细胞群的中等下降。在所有动物中观察到了网状细胞应答；但是，在最高暴露下(第6组)，对于红细胞群的类似减少，应答似乎没有那么强(图36D-36F)。遍及整个研究的骨髓涂片的形态学分析是普通的。但是，流式细胞术分析揭示，在给药期结束时，在DART-A处理的动物中，不成熟谱系-阴性(Lin-)骨髓群体中的CD123+细胞的频率下降，到恢复时间结束时回到基线水平(图37A-37B)。HSC(定义为Lin-/CD34+/CD38-/CD45RA-/CD90+细胞(Pang,W.W.等(2011)“Human Bone Marrow Hematopoietic Stem Cells Are IncreasedIn Frequency And Myeloid-Biased With Age,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)108:20012-20017))显示大的组间变化；与对应的给药前水平相比，第4-6组DART-A处理的猴子显示一些明显的下降，但是，与媒介处理的动物相比，在所有的处理的组中没有看到下降。这些数据指示HSC不易受DART-A靶向的影响并且与观察的DART-A处理对血细胞生成的不利作用的可逆性一致。

如上表明，就按照每周4-天-输注/3-天-不输注的计划或7-天-输注计划的输注4周，以100ng/kg/天的开始剂量，每周逐步增加至300、600和1,000ng/kg/天而言，施用DART-A至食蟹猴是良好耐受的。在第一次施用开始之后观察循环CD123+细胞，包括pDC的消耗，其在整个研究中在所有剂量和计划下均持续。也观察到骨髓CD123+前体的可逆减少。细胞因子释放，作为CD3-靶向疗法的重要安全性考虑，似乎是可控的并且与第一-剂量作用一致。在最高剂量下注意到中度可逆贫血，但没有注意到其他(中靶或脱靶)不利事件。

考虑到直向同源物之间的高同源性和DART-A以类似的亲和性与抗原结合并且在两个物种中介导重定向T细胞杀伤的能力，食蟹猴是DART-A药理学评估的合适动物模型。此外，两种抗原在猴子和人中，包括通过造血前体的类似表达和多个组织中内皮细胞的细胞质中协调表达。较例外的是在人而不是猴子睾丸间质细胞中的表达，以及与人相比在猴子中的CD123水平低-至-不存在。

与涉及T细胞活化的治疗性策略相关的主要考虑包括细胞因子的释放和脱靶细胞毒素作用。用具有二价CD3识别的CD3xCD123双特异性scFv免疫融合(immunofusion)构建体进行的最近的研究显示体外抗白血病活性，但是造成T细胞的非特异性活化和IFN-γ分泌(Kuo，S.R。等(2012)“Engineering A CD123xCD3 Bispecific scFv Immunofusion ForThe Treatment Of Leukemia And Elimination Of Leukemia Stem Cells,”ProteinEng.Des.Sel.25:561-569)。每个结合臂的单价性质和DART-A的高度均质单体形式确保T细胞活化专有地依赖于靶细胞结合：在没有靶细胞的情况下或通过使用仅仅包括CD3-靶向臂的对照DART分子没有观察到T细胞活化。此外，高剂量(多达100ug/kg/天)的对照DART分子不触发食蟹猴中的细胞因子释放。

100ng/kg/天的DART-A分子开始剂量是良好耐受的，具有最小的细胞因子释放。但是，在高的开始剂量(5μg/kg/天)下部出现细胞因子剧烈释放(storm)；然而，经逐步的每周剂量增加可安全达到这种剂量，指示DART-A介导的细胞因子释放似乎主要是第一-剂量作用。CD123+靶细胞的消耗，从而消除CD3连接源，可阐释第一-剂量作用：在低至3-10ng/kg/天的剂量下观察到几乎完全的CD123+细胞消耗，指示在与细胞毒性相比改变的剂量应答之后体内细胞因子释放。细胞毒性的剂量应答曲线和人T细胞释放的细胞因子也与该观察一致。

其中DART-A-诱导的PD1上调可起作用的T细胞脱敏好像也有助于在第一次输注DART-A之后限制细胞因子释放。最近的研究显示，在炎症位点的抗原-诱导的T细胞捕获(arrest)之后增加的PD-1表达通过与PD-L1相互作用，有助于使停止信号终止，因此使细胞释放和脱敏(Honda，T。等(2014)“Tuning Of Antigen Sensitivity By T Cell Receptor-Dependent Negative Feedback Controls T Cell Effector Function In InflamedTissues,”Immunity 40:235-247；Wei,F.等(2013)“Strength Of PD-1S ignalingDifferentially Affects T-Cell Effector Functions,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)110:E2480-E2489)。TCR信号传导强度的PD-1抵消不均匀：而增殖和细胞因子产生好像对PD-1抑制最敏感，细胞毒性最不受影响(Wei,F.等(2013)“Strength Of PD-1 SignalingDifferentially Affects T-Cell Effector Functions,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)110:E2480-E2489)。一致地，来自暴露于多次DART-A输注的猴子的T细胞的离体细胞毒素潜能与来自幼稚猴子的T细胞的相当，尽管前者中增加的PD-1水平。此外，PD-1上调不伴随着TIM3表达，其是T细胞枯竭的特点，如暴露于CD3抗体或慢性感染的延长刺激的T细胞所显示(Gebel,H.M.等(1989)“T Cells From Patients Successfully Treated With OKT3 DoNot React With The T-Cell Receptor Antibody，”Hum.Immunol.26:123-129；Wherry,E.J.(2011)“T Cell Exhaustion”Nat.Immunol.12:492-499)。

DART-A处理的猴子中循环CD123+细胞的消耗是快速的，并且以4-天-输注/3-天-不输注的计划在每周给药假期期间是持续的，与靶细胞消除一致。相反，循环T细胞的瞬时波动可能是作为DART-A的功能从组织和淋巴器官运输或运输至组织和淋巴器官的结果。DART-A暴露促进经历T淋巴细胞的抗原的扩展和/或活动，所述细胞优选是组织的发源地(home)并且更容易发挥细胞毒素效应功能(Mirenda,V.等(2007)“Physiologic AndAberrant Regulation Of Memory T-Cell Trafficking By The CostimulatoryMolecule CD28,”Blood 109:2968-2977；Marelli-Berg，F.M.等(2010)“Memory T-CellTrafficking:New Directions For Busy Commuters,”Immunology 130:158-165)。

CD123+正常细胞的消耗可携带潜在的易感性。相比单核细胞和嗜伊红粒细胞中的低水平，pDC和嗜碱性粒细胞表达高水平的CD123(Lopez，A.F.等(1989)“ReciprocalInhibition Of Binding Between Interleukin 3 And Granulocyte-MacrophageColony-Stimulating因子To Human Eosinophils,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)86:7022-7026；Munoz，L.等(2001)“Interleukin-3Receptor Alpha Chain(CD123)Is WidelyExpressed In Hematologic Malignancies,”Haematologica 86:1261-1269；Masten，B.J.等(2006)“Characterization Of Myeloid And Plasmacytoid Dendritic Cells InHuman Lung,”J.Immunol.177:7784-7793；Korpelainen，E.I.等(1995)“Interferon-GammaUpregulates Interleukin-3(IL-3)Receptor Expression In Human Endothelial CellsAnd Synergizes With IL-3 In Stimulating Major Histocompatibility ComplexClass II Expression And Cytokine Production,”Blood 86:176-182)。pDCs已经显示在控制小鼠或猴子的感染模型中的某些病毒起作用，尽管它们对控制针对流感的免疫应答似乎不是关键的(Colonna,M.等(1997)“Specificity And Function Of ImmunoglobulinSuperfamily NK Cell Inhibitory And Stimulatory Receptors,”Immunol.Rev.155:127-133；Smit,J.J.等(2006)“Plasmacytoid Dendritic Cells Inhibit PulmonaryImmunopathology And Promote Clearance Of Respiratory Syncytial Virus,”J.Exp,Med.203:1153-1159)。在肿瘤模型中，pDC可促进肿瘤生长和转移，而pDC消耗导致肿瘤抑制(Sawant,A.等(2012)“Depletion Of Plasmacytoid Dendritic Cells Inhibits TumorGrowth And Prevents Bone Metastasis Of Breast Cancer Cells,”J.Immunol.189:4258-4265)。在用DART-A处理的一些猴子中观察到了瞬时、中度、剂量非依赖性面部肿胀；但是，在这些猴子中或当人嗜碱性粒细胞经DART-A介导的T细胞杀伤溶解时没有观察到增加的组胺水平。单核细胞消耗可携带增加的感染风险；因此应监测人中pDC、嗜碱性粒细胞或嗜伊红粒细胞消耗的结果。

表达CD123的定向造血前体，比如常见的髓性前体(CMP)(Jordan，C.T.等(2000)“The Interleukin-3Receptor Alpha ChainIs A Unique Marker For Human AcuteMyelogenous Leukemia Stem Cells,”Leukemia 14:1777-1784；Rieger,M.A.等(2012)“Hematopoiesis,”Cold Spring Harb.Perspect.Biol.4:a008250)，可被DART-A靶向，这是以最高剂量施用DART-A之后观察到的中度贫血的一种可能的解释。红细胞生成的网状细胞应答好像在所有DART-A剂量水平起作用；但是，对于红细胞参数的相应下降，经历最大DART-A暴露的动物(组6，7-天-输注)显示降低的网状细胞应答，提示对前体(例如，CMP)可能的细胞毒素活性。在停止DART-A处理之后该作用是可逆的，与从剩余(spared)CD123低/阴性HSC的再生一致。

消耗CD123+细胞的可选方法包括第二代CD123-特异性Fc-增强的单克隆抗体(Jin，L.等(2009)“Monoclonal Antibody-Mediated Targeting Of CD123,IL-3ReceptorAlpha Chain,Eliminates Human Acute Myeloid Leukemic Stem Cells,”Cell StemCell 5:31-42；Roberts,A.W.等(2010)“A Phase I Study Of Anti-CD123MonoclonalAntibody(mAb)CSL360Targeting Leukemia Stem Cells(LSC)In AML,”J.Clin.Oncol.28(Suppl):e13012)，IL-3结合的白喉毒素(Frankel，A。等(2008)“Phase I Clinical StudyOf Diphtheria Toxin-Interleukin 3Fusion Protein In Patients With AcuteMyeloid Leukemia And Myelodysplasia,”Leuk.Lymphoma 49:543-553)，细胞因子-诱导的、表达CD123特异性嵌合抗原受体(CAR)的杀伤(CIK)细胞(Tettamanti，S.等(2013)“Targeting Of Acute Myeloid Leukaemia By Cytokine-induced Killer CellsRedirected With A Novel CD123-Specific Chimeric Antigen Receptor,”Br.J.Haematol.161:389-401)和CD123CAR T细胞(Gill，S.等(2014)“Efficacy AgainstHuman Acute Myeloid Leukemia And Myeloablation Of Normal Hematopoiesis In AMouse Model Using Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells,”Blood123(15):2343-2354；Mardiros，A.等(2013)“T Cells Expressing CD123-Specific ChimericAntigen Receptors Exhibit Specific Cytolytic Effector Functions And AntitumorEffects Against Human Acute Myeloid Leukemia,”Blood 122:3138-3148)。CAR T细胞在弥散性AML异源模型中展示有力的体外白血病母细胞杀伤和抗白血病活性(Mardiros，A.等(2013)“T Cells Expressing CD123-Specific Chimeric Antigen Receptors ExhibitSpecific Cytolytic Effector Functions And Antitumor Effects Against HumanAcute Myeloid Leukemia,”Blood 122:3138-3148)。最近的研究报道在CD123 CAR T细胞转移之后移植人CD34+细胞的NSG小鼠中正常造血作用消除(Gill，S.等(2014)“EfficacyAgainst Human Acute Myeloid Leukemia And Myeloablation Of NormalHematopoiesis In A Mouse Model Using Chimeric Antigen Receptor-Modified TCells,”Blood 123(15):2343-2354)，尽管其他人还未观察到类似的体外或体内效果(Tettamanti，S.等(2013)“Targeting Of Acute Myeloid Leukaemia By Cytokine-induced Killer Cells Redirected With A Novel CD123-Specific Chimeric AntigenReceptor,”Br.J.Haematol.161:389-401；Pizzitola，I.等(2014)“Chimeric AntigenReceptors Against CD33/CD123 Antigens Efficiently Target Primary AcuteMyeloid Leukemia Cells in vivo,”Leukemia doi:10.1038/leu.2014.62)。在上面讨论的实验中，观察到了CD123+骨髓前体群体的消耗，但是其在恢复期间逆转；此外，在所有测试的DART-A剂量水平，该少数群体的消耗不导致骨髓细胞性或类红细胞与髓样细胞(E:M)比的改变。这些差异强调了DART-A相对于细胞疗法的潜在优势，因为其提供依赖于自体T细胞的可滴定系统，与可能更难以控制的“超动力(supercharged)”离体转导细胞形成对比。CD123在多种血液恶性肿瘤，包括AML、毛细胞性白血病、母细胞性浆细胞样树突细胞赘生物(BPDCNs)、B-前体急性成淋巴细胞白血病(B-ALL)和慢性淋巴细胞性白血病的亚型、霍奇金疾病Reed-Stemberg细胞中，以及在骨髓增生异常综合征和系统性肥大细胞增多症中过表达(Kharfan-Dabaja,M.A.等(2013)“Diagnostic And Therapeutic Advances InBlasticPlasmacytoid Dendritic Cell Neoplasm:A Focus On Hematopoietic CellTransplantation,”Biol.Blood Marrow Transplant,”19:1006-1012；Florian,S.等(2006)“Detection Of Molecular Targets On The Surface Of CD34+/CD38--StemCells In Various Myeloid Malignancies,”Leuk.Lymphoma；Munoz，L.等(2001)“Interleukin-3 Receptor Alpha Chain(CD123)Is Widely Expressed In HematologicMalignancies,”Haematologica 86:1261-1269；Fromm,J.R.(2011)“Flow CytometricAnalysis Of CD123 Is Useful For Immunophenotyping Classical HodgkinLymphoma,”Cytometry B Clin.Cytom.80:91-99)。在非人灵长类中观察到的可预测的药效活性和可控制的安全性特征进一步支持了DART-A作为这些病症的免疫疗法的临床效用和效力。

总之，DART-A是基于抗体的分子，其结合TCR的CD3ε亚单位，以重定向抵抗表达在多种血液恶性肿瘤中被上调的抗原CD123的细胞的T淋巴细胞。DART-A以类似的亲和力结合人和食蟹猴二者的抗原并且将来自两个物种的T细胞重定向以杀伤CD123+细胞。用每周逐渐增加剂量的DART-A一周输注4或7天的猴子在处理启动之后72h显示循环CD123+细胞的消耗，其在4周处理期间持续，与给药计划无关。也出现循环T细胞的下降，但是在按照4-天剂量计划的猴子中随后的输注之前恢复至基线，与DART-A介导的活动一致。DART-A施用增加循环PD1+，但是不增加TIM-3+T细胞；此外，来自处理的猴子的T细胞的离体分析显示未改变的重定向靶细胞溶解，指示没有枯竭。在DART-A第一次输注之后，而不是在随后施用——即使在剂量逐渐增加时——之后，毒性限于细胞因子的最小瞬时释放，和伴随CD123+骨髓祖先的减少的红细胞群的最小可逆下降。血液恶性肿瘤中DART-A的临床测试似乎被批准。

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