带有一氧化氮供体的芳香酸衍生物在制备治疗恶性肿瘤迁移疾病药物中的应用

摘要

本发明公开了带有一氧化氮供体的芳香酸衍生物在制备治疗恶性肿瘤迁移疾病药物中的新应用，本发明在现有技术的基础上，通过大量实验研究，开发新的临床功效，实验结果表明，带有一氧化氮供体的芳香酸衍生物具有很好的抑制肿瘤细胞生长，尤其是具有很好的抑制肿瘤细胞迁移的功效，疗效可靠，安全性好，具有重要的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种药物，具体涉及带有一氧化氮供体的芳香酸衍生物在制备治疗恶性肿瘤疾病药物中的应用。

背景技术

肿瘤已成为21世纪威胁人类生存的头号杀手，临床上目前治疗肿瘤的药物，抗肿瘤效果取得了一定的进步，但药物毒性大，在杀死肿瘤细胞的同时也无选择性的杀死白细胞、淋巴细胞等人体自身免疫细胞，导致病人常常由于因自身免疫能力低下并发感染，尤其是对于肿瘤细胞迁移后，目前的抗肿瘤药物疗效一般，在临床使用中有较大的局限性。

目前肿瘤的诊断与治疗主要是依靠一些西医的方法与手段，如化学药物的治疗与放射治疗等等，目前治疗肿瘤的药物在临床上大多是具有靶点特性的细胞毒性药物，可是这仍存在很多的不足之处如选择性差、毒副作用强、易产生耐药性等等。

一氧化氮不仅可以对肿瘤细胞的增殖产生显著的抑制作用，而且还可以加速肿瘤细胞的凋亡，另外一氧化氮在体内通过与氧自由基结合的方式，生成的活性氮对肿瘤细胞有间接的阻滞作用，一氧化氮虽然有很好的抗肿瘤作用，但是仍然存在许多的缺点和需要改进的地方，如体内半衰期短，不稳定等等。

芳香酸类化合物，如阿魏酸、咖啡酸、肉桂酸、异阿魏酸以及香豆酸报道具有很好的抗血栓活性，临床上常用于心血管疾病，尽管芳香酸类化合物具有多种药理活性，但是,由于他们的分子亲水性较强,较难透过生物膜脂质双分子层而影响其药效作用(王汝涛,周四元,张峰,等.阿魏酸乙酯对过氧化氢损伤人血管内皮细胞的保护作用[J].中国临床药理学与治疗学,2004,9(7):763-765.)限制了该类化合物的应用。中国专利201010214044.6，报道了带有一氧化氮供体的芳香酸前体药物及其制备方法和其应用，另外中国专利201210306272.5报道了带有一氧化氮供体的芳香酸衍生物在制备治疗恶性肿瘤疾病药物中的应用，但目前还未有带有一氧化氮供体的芳香酸衍生物在抗恶性肿瘤迁移疾病药物中的应用的报道。

发明内容

发明目的：本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供带有一氧化氮供体的芳香酸衍生物在制备治疗恶性肿瘤迁移疾病药物中的新应用。实验结果表明，带有一氧化氮供体的芳香酸衍生物对多种肿瘤细胞具有强抗肿瘤细胞迁移的活性，临床使用安全，不良反应低。

技术方案：为了实现以上目的，本发明所采取的技术方案如下：

带有一氧化氮供体的芳香酸衍生物在制备治疗恶性肿瘤迁移药物中的应用。

作为优选方案，所述的带有一氧化氮供体的芳香酸衍生物在制备治疗恶性肿瘤迁移药物中的应用，所述的带有一氧化氮供体的芳香酸衍生物为(E)-3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙烯酸-2-{2-[4-苯磺酰基-1,2,5-噁二唑-5-氧-3-氧基]-乙氧基}乙酯，(E)-3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙烯酸-4-[4-苯磺酰基-1,2,5-噁二唑-5-氧-3-氧基]-2-丁酯和(E)-3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙烯酸-4-[4-苯磺酰基-1,2,5-噁二唑-5-氧-3-氧基]-1-丁酯。

带有一氧化氮供体的芳香酸衍生物在制备治疗肺癌、肝癌或乳腺癌细胞迁移药物中的应用。

作为优选方案，以上所述的带有一氧化氮供体的芳香酸衍生物在制备治疗肺癌、肝癌或乳腺癌细胞迁移药物中的应用，其特征在于，所述的带有一氧化氮供体的芳香酸衍生物为(E)-3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙烯酸-2-{2-[4-苯磺酰基-1,2,5-噁二唑-5-氧-3-氧基]-乙氧基}乙酯，(E)-3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙烯酸-4-[4-苯磺酰基-1,2,5-噁二唑-5-氧-3-氧基]-2-丁酯和(E)-3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙烯酸-4-[4-苯磺酰基-1,2,5-噁二唑-5-氧-3-氧基]-1-丁酯。

本发明提供的带有一氧化氮供体的芳香酸衍生物在制备治疗肺癌、肝癌或乳腺癌细胞迁移药物中的应用，将带有一氧化氮供体的芳香酸衍生物和药学上可接受的载体制备成片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、粉针剂或注射剂。

有益效果：本发明提供的中药组合物和现有技术相比具有以下优点：

本发明在带有一氧化氮供体的芳香酸衍生物现有活性的基础上，通过大量实验研究，开发其新的临床功效，实验结果表明，带有一氧化氮供体的芳香酸衍生物具有很好的抑制肿瘤细胞生长，尤其是具有很好的抑制肿瘤细胞迁移的功效，疗效可靠，安全性好，具有重要的应用前景。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

实施列1带有一氧化氮供体的芳香酸衍生物对C57BL/6小鼠Lewis肺癌侵袭迁移的抑制作用研究

1实验材料

1.1实验动物

雌性C₅₇BL/6小鼠(201500-05)，质量(20±2)g，南京青龙山实验动物中心。

1.2药品与试剂

(E)-3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙烯酸-2-{2-[4-苯磺酰基-1,2,5-噁二唑-5-氧-3-氧基]-乙氧基}乙酯(简称FXS-3)由自己实验室合成提供，纯度大于98％；Lewis肺癌细胞株和SABC免疫组化试剂盒(南京凯基生物有限公司)；MMP-2抗体，MMP-9抗体，p-AKT抗体、p-ERK抗体(美国Santa Cruz公司)。

2实验方法

2.1肿瘤细胞接种、分组及给药

收集处于生长对数期的Lewis消化并调整浓度至5×10⁶cell/mL，接种于雌性C₅₇BL/6小鼠左前肢腋部皮下，每只0.2mL，建立小鼠Lewis肺癌模型。20d后肉眼可见左腋部肿块明显，则该造模方法视为成功。成功的40小鼠只随机分为5组，即模型对照组、环磷酰胺组(50mg/kg/d)和(E)-3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙烯酸-2-{2-[4-苯磺酰基-1,2,5-噁二唑-5-氧-3-氧基]-乙氧基}乙酯(简称FXS-3)低、中、高剂量组(25、50、100mg/kg/d)，每组8只。

2.2肿瘤生长抑制率及肺转移抑制率

末次给药24h，采取颈椎脱臼的方法处死小鼠，剥离腋下肿瘤瘤块并称肿瘤瘤重，从而计算FXS-3对肿瘤的抑制率。摘取整个肺脏并称量重量，利用10％中性HCHO进行固定，利用解剖显微镜，计算转移瘤的结节数。

2.3肺组织病理学检查

肺利用10％中性HCHO进行固定12h，常规石蜡包埋、切片，经苏木精-怡红染色，利用光学显微镜，检测其病理学变化。

2.4肺组织中MMP-2、MMP-9、p-AKT和p-ERK检测

肺组织进行石蜡切片，按试剂盒说明进行免疫组化检测。石蜡切片均要在同一条件下采用软件进行分析，测定每个视野的平均灰度值。灰度值越小，其含量越高，反之则含量越低。

2.5统计学处理

采用SPSS 21.0软件，实验数据均以“X±SD”表示，两组间数据比较采用t检验，多组间数据比较采用方差分析，以P＜0.05或P＜0.01表示差异具有统计学意义。

3实验结果

3.1 FXS-3对肺癌的生长及肺转移作用

与模型组比较，给药FXS-3(100mg/kg和50mg/kg)组，肿瘤的瘤重明显减轻(P＜0.01)，各剂量组，肺表面转移瘤结节数明显减少(P＜0.01)，表明FXS-3能明显抑制肺癌的生长及转移(表1，表2)。

表1 FXS-3对Lewis肺癌生长及肺转移的影响(n＝8)

注：与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

3.2 FXS-3对肺组织形态学变化的作用

光镜下可见模型组小鼠肺组织表面均有白色肿瘤结节，且转移瘤结节数量较多。而FXS-3各剂量组转移瘤结节数明显减少，结节较小，且多为孤立结节。模型组肺内瘤结核碎裂像少见，并可见肺泡壁增厚，瘤细胞沿肺边缘浸润，瘤组织内微血管丰富，偶见坏死。化合物FXS-3中、高剂量组瘤细胞生长不良，呈散在分布，大片坏死多见，瘤组织内及其周围微血管较少，可见淋巴细胞等炎性细胞浸润，提示FXS-3可明显抑制Lewis肺癌肺转移及生长。

3.3 FXS-3对小鼠肺组织中的MMP-2和MMP-9蛋白含量的作用

MMP-2于肿瘤细胞胞浆内表达。由表2可见，与模型组相比，FXS-3(100mg/kg)组，MMP-2含量水平明显降低(P<0.05)，提示FXS-3可显著抑制肺组织中的MMP-2的含量。由表2可见，FXS-3(100mg/kg和50mg/kg)组，小鼠肺组织中的MMP-9表达水平明显降低(P<0.01)，提示FXS-3可显著抑制Lewis肺癌小鼠肺组织中的MMP-9蛋白表达。

表2 FXS-3对Lewis肺癌小鼠肺组织中的MMP-2和MMP-9表达的影响(n＝8)

3.4 FXS-3对小鼠肺组织中的p-AKT和p-ERK蛋白含量的作用

和模型组相比较，FXS-3(100mg/kg和50mg/kg)组小鼠肺组织中的p-AKT和p-ERK表达水平明显降低(P<0.05)，提示FXS-3可显著抑制Lewis小鼠肺中的p-AKT和p-ERK的含量。

浸润性生长和已有转移灶的恶性肿瘤中，MMPs的表达量增加且活性增强，在已发现26种基质金属蛋白酶家族成员，MMP-2和MMP-9可以显著的降解细胞外机制以及基底膜中Ⅳ型胶原、Ⅴ型胶原、纤连蛋白等主要成分。

本发明研究发现，与模型对照组相比，FXS-3处理组小鼠肺组织中的MMP-2和MMP-9含量均有所下降，并且随着FXS-3给药量的升高，下降水平更加显著。实验结果显示，FXS-3能够通过降低肺组织中的MMP-2和MMP-9的含量从而抑制其在小鼠体内的转移能力。

实施例2带有一氧化氮供体的芳香酸衍生物(简称FXS-3)对A549转移和侵袭的抑制作用研究

1实验材料

1.1主要试剂

Matrigel(美国BD 356234)；MMP-2和MMP-9PCR引物由上海生物工程有限责任公司合成；AKT及ERK特异性抑制剂LY294002与U0126(Sigma)；鼠抗人MMP-2、MMP-9、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR、p-MEK/MEK和p-ERK/ERK的单克隆抗体均为Santa Cruz公司产品；其余见第四章。

1.2主要试剂配制

实验药物：(E)-3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙烯酸-2-{2-[4-苯磺酰基-1,2,5-噁二唑-5-氧-3-氧基]-乙氧基}乙酯(简称FXS-3)由自己实验室合成提供，纯度大于98％；Matrigel的配制：无血清培养基将融化的Matrigel稀释一倍。

2实验方法

2.1伤口愈合试验

取A549，0.25％TE消化后，800rpm离心4min，用无血清DMEM基础培养基进行重悬，A549计数，使得密度为2×10⁵cell/mL，接种于24well板中。无血清DMEM培养基孵育24h，10μL小枪头垂直每孔划一道直线后吸弃的旧的培养基，用PBS清洗两次，洗掉漂浮的细胞，更换新鲜的培养液，并加入不同剂量(0.625、1.25、2.5μM)的FXS-3，继续常规培养24h。于不同时间点至倒置显微镜下观察伤口愈合情况，24h后用相机拍照。重复二次，每次随意取三个视野。

2.2 Transwell小室迁移试验

取对数生长期A549，用无血清培养基A549饥饿培养24h；Transwell小室先加入50μL无血清培养基3h，计数A549，使用无血清培养基调整A549密度至2×10⁵cell/mL，Transwell小室中每孔加入A54950μL，下室加入500μL含20％FBS的培养基；分别加入不同剂量(0.625、1.25、2.5μM)FXS-3，对照组不加FXS-3，继续培养24h；细胞计数：用棉签小心地将Transwell上室的A549擦干净，移出小室，倒置，使其风干，再在24well板中加入0.1％结晶紫溶液(500μL)，将小室置于结晶紫溶液中，使其完全浸没在结晶紫溶液，放置在37℃环境中30min，用PBS洗一遍，在显微镜下观察，直径取3个视野，拍照(200×)，并且A549计数。

2.3 Transwell小室侵袭试验

取对数生长期A549，用无血清培养基A549饥饿培养24h；将Matrigel放置4℃环境中使其融化；使用无血清培养基将融化的Matrigel稀释一倍，然后加入30μL至Transwell上室中，于37℃孵育120min；然后在Transwell小室先加入50μL无血清培养基3h，计数A549，使用无血清培养基调整A549密度至2×10⁵cell/mL，Transwell小室中每孔加入A54950μL，下室加入500μL含20％FBS的培养基；分别加入不同剂量(0.625、1.25、2.5μM)FXS-3，对照组不加FXS-3，继续培养24h；细胞计数：用棉签小心地将Transwell上室的A549擦干净，移出小室，倒置，使其风干，再在24well板中加入0.1％结晶紫溶液(500μL)，将小室置于结晶紫溶液中，使其完全浸没在结晶紫溶液，放置在37℃环境中30min，用PBS洗一遍，在显微镜下观察，直径取3个视野，拍照(200×)，并且A549计数。

2.4 Western blot检测MMP-2和MMP-9蛋白的表达

2.4.1细胞总蛋白的提取

提取A549总蛋白的方法见第四章第一节。

2.4.2 Western blot检测

2.5 Western blot检测FXS-3对AKT/mTOR和MEK/ERK信号通路的影响

Western blot检测AKT、mTOR、MEK和ERK蛋白及磷酸化水平，一抗使用p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR、p-MEK/MEK和p-pERK/ERK的单克隆抗体，方法同第四章第一节。

2.6统计学处理

采用SPSS 21.0软件，实验数据均以“X±SD”表示，两组间数据比较采用t检验，多组间数据比较采用方差分析，以P＜0.05或P＜0.01表示差异具有统计学意义。

3实验结果

3.1 FXS-3抑制A549非定向迁移

采用Wound Healing方法考察FXS-3对A549非定向迁移能力的影响。结果表明，FXS-3(0.625、1.25和2.5μM)作用A5490、12和24h，划痕的宽度变得越来越宽阔，并且划痕两侧的A549的数目变的越来越少；Control组的A549培养了0、12和24h，划痕的宽度变得越来越窄，并且划痕两侧的A549的数目变的越来越多。

3.2 FXS-3抑制A549定向迁移

Transwell小室实验检测FXS-3对A549定向能力的改变，表3结果发现，与Control组比较，FXS-3(0.625、1.25、2.5μM)有明显的抑制A549定向迁移的作用；与阳性组比较，高浓度的FXS-3(2.5μM)给药组对细胞的定向迁移抑制率要强于顺铂。

表3 FXS-3对A549定型迁向能力的影响(n＝3)

3.3 FXS-3抑制A549侵袭

Transwell小室侵袭实验考察FXS-3对A549侵袭能力的改变，表4结果表明，与Control组比较，FXS-3(0.625、1.25、2.5μM)有明显的抑制A549的侵袭作用；与阳性组比较，FXS-3(2.5μM)给药组对细胞的侵袭抑制率要强于顺铂。

表4 FXS-3对A549侵袭能力的影响(n＝3)

3.4 FXS-3抑制A549中MMP-2和MMP-9的表达

为了明确FXS-3抑制A549迁移和侵袭的机制，用2.5μM的FXS-3分别处理A549 6h、12h和24h后提取总RNA和总蛋白，检测A549中MMP-2和MMP-9蛋白和基因的表达。RT-PCR检测结果显示随着FXS-3作用时间的延长，MMP-2和MMP-9mRNA的含量逐渐减少，Western blot检测结果与RT-PCR一致，表明FXS-3能够阻滞A549迁移和侵袭可能与下调MMP-2和MMP-9的含量有着密不可分的关系。

3.5 FXS-3抑制A549中AKT/mTOR和MEK/ERK信号通路

为了考察FXS-3抑制A549迁移和侵袭的信号通路，用FXS-3处理培养的A549，分别观察AKT/mTOR和MEK/ERK信号通路，即AKT、mTOR、MEK和ERK的变化。用Western blot方法检测FXS-3作用后对四个信号转导蛋白的含量的影响。结果显示，当2.5μM的FXS-3作用于A5496h后，AKT、mTOR、MEK和ERK磷酸化水平开始降低，并且FXS-3可以抑制A549中AKT/mTOR和MEK/ERK信号通路。

3.6 FXS-3通过AKT/mTOR和MEK/ERK信号通路影响A549中MMP-2和MMP-9的表达

为了验证FXS-3抑制AKT/mTOR和MEK/ERK信号通路与下调MMP-2和MMP-9的表达有关，分别加入p-AKT和p-P70S6K的抑制剂LY294002和rapmycin，分别检测FXS-3作用A549后，上述蛋白的含量的变化情况。结果显示，加入抑制剂LY294002和U0126后，进一步下调了MMP-2和MMP-9的含量。结果提示AKT/mTOR和MEK/ERK信号通路均可介导FXS-3对MMP-2和MMP-9的含量。

实施例3带有一氧化氮供体的芳香酸衍生物对SMMC-7721和MCF-7转移侵袭能力的影响

1、实验方法

1.1细胞迁移的测定同实施例2方法。

1.2受试药物：(E)-3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙烯酸-2-{2-[4-苯磺酰基-1,2,5-噁二唑-5-氧-3-氧基]-乙氧基}乙酯(简称FXS-3)，(E)-3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙烯酸-4-[4-苯磺酰基-1,2,5-噁二唑-5-氧-3-氧基]-2-丁酯(简称FXS-1)和(E)-3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙烯酸-4-[4-苯磺酰基-1,2,5-噁二唑-5-氧-3-氧基]-1-丁酯(简称FXS-2)

2、实验结果

2.1 FXS-1、FXS-2和FXS-3抑制SMMC-7721和MCF-7的转移

2.1.1 FXS-1、FXS-2和FXS-3抑制SMMC-7721的转移

见表5所示。与Control组比较，FXS-1、FXS-2和FXS-3有明显的抑制SMMC-7721的转移作用；且随着FXS-1、FXS-2和FXS-3浓度的增加，抑制SMMC-7721的作用效果更加明显；与阳性组比较，高浓度的FXS-1、FXS-2和FXS-3组对SMMC-7721转移的抑制率要强于顺铂；同一样品的不同浓度相比较，随着FXS-1、FXS-2和FXS-3的浓度的不断提升，对SMMC-7721转移的抑制率也会越来越强；同一浓度的不同样品相比较，FXS-3强于FXS-2，强于FXS-1。

表5 FXS-1、FXS-2和FXS-3对SMMC-7721转移的抑制作用(n＝3)

注：与Control组比较，^*P<0.05，^**P<0.01

2.1.2 FXS-1、FXS-2和FXS-3抑制MCF-7的转移

见表6所示。与Control组比较，FXS-1、FXS-2和FXS-3有明显的抑制MCF-7转移的作用；且随着FXS-1、FXS-2和FXS-3浓度的增加，抑制MCF-7的作用效果更加明显；与阳性组比较，高浓度的FXS-1、FXS-2和FXS-3组对MCF-7转移的抑制率要强于顺铂；同一样品的不同浓度相比较，随着FXS-1、FXS-2和FXS-3的浓度的不断提升，对MCF-7转移的抑制率也会越来越强；同一浓度的不同样品相比较，FXS-3强于FXS-2，强于FXS-1。

表6 FXS-1、FXS-2和FXS-3对MCF-7转移的抑制作用(n＝3)

注：与Control组比较，^*P<0.05，^**P<0.01

2.2 FXS-1、FXS-2和FXS-3抑制SMMC-7721和MCF-7的侵袭

2.2.1 FXS-1、FXS-2和FXS-3抑制SMMC-7721的侵袭

见表7所示。与Control组比较，FXS-1、FXS-2和FXS-3有明显的抑制SMMC-7721的侵袭作用；且随着FXS-1、FXS-2和FXS-3浓度的增加，抑制SMMC-7721的作用效果更加明显；与阳性组比较，高浓度的FXS-1、FXS-2和FXS-3组对SMMC-7721侵袭的抑制率要强于顺铂；同一样品的不同浓度相比较，对SMMC-7721侵袭有抑制作用随着浓度的增加而增加，且呈浓度依赖关系；同一浓度的不同样品相比较，FXS-3强于FXS-2，强于FXS-1。

表7 FXS-1、FXS-2和FXS-3对SMMC-7721侵袭的抑制作用(x±s,n＝3)

注：与Control组比较，^*P<0.05，^**P<0.01

2.2.2 FXS-1、FXS-2和FXS-3抑制MCF-7的侵袭

见表8所示。与Control组比较，FXS-1、FXS-2和FXS-3有明显的抑制MCF-7的侵袭作用；且随着FXS-1、FXS-2和FXS-3浓度的增加，抑制MCF-7的作用效果更加明显；与阳性组比较，高浓度的FXS-1、FXS-2和FXS-3组对MCF-7侵袭的抑制率要强于顺铂；同一样品的不同浓度相比较，对MCF-7侵袭有抑制作用随着浓度的增加而增加，且呈浓度依赖关系；同一浓度的不同样品相比较，FXS-3强于FXS-2，强于FXS-1。

表8 FXS-1、FXS-2和FXS-3对MCF-7侵袭的抑制作用(n＝3)

注：与Control组比较，^*P<0.05，^**P<0.01

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。