一种蔬菜和干果中双炔酰菌胺残留量的LC-MS-MS检测方法

摘要

本发明公开了一种蔬菜和干果中双炔酰菌胺残留量的LC?MS?MS检测方法，属于农药残留量检测技术领域。本方法用乙腈溶液均质提取样品中残留的双炔酰菌胺，提取液经分散净化后，液相色谱串联质谱（LC?MS?MS）检测，采用不含待测农药的空白基质溶液建立校正的标准曲线，外标法定量。本方法平均回收率为85.0％～94.6%，平均相对标准偏差（RSD）为0.86％～2.89％%，本发明检出限0.003mg/kg，定量检出限0.01mg/kg。具有操作简便、快速、灵敏度高、重复性好、定性定量准确的优点。能满足0.01mg/kg残留限量的“一律标准”技术要求，为保障我国人民食品安全、对外出口贸易健康发展提供有力的技术支撑。

说明书

技术领域

本发明涉及一种双炔酰菌胺残留量的检测方法，更具体地涉及一种蔬菜和干果中双炔酰菌胺残留量的LC-MS-MS（液相色谱-串联质谱）检测方法，属于农药残留量检测技术领域。

背景技术

双炔酰菌胺化学名称为2-(4-氯苯基)-N-[2-(3-甲氧基-4-丙-2-炔基氧基-苯基)-乙基]-2-丙-2-炔氧基-乙酰胺，英文化学名称为2-(4-chlorophenyl)-N-[2-(3-methoxy-4-prop-2-ynyloxy-phenyl) -ethyl]-2-prop-2-ynyloxy-acetamide。CAS登录号为[374726-62-2]。分子式：C23H22ClNO4，相对分子质量：411.9。化学结构式如下：

理化性质：淡棕色粉末，熔点96.4℃~97.3℃。沸点大约200℃开始热分解。蒸汽压<9.4×10-7 Pa(25℃)。油水分配系数log Pow：3.2℃(25℃)。水中溶解度4.2 mg/L(25℃)。哺乳动物毒性：大鼠急性经口LD5>5000 mg/kg，大鼠急性经口LD50>2000 mg/kg，大鼠急性吸入LC50> 5000 mg/kg，兔眼睛有轻微刺激，兔皮肤有中度刺激，通过大鼠试验无致突变、致畸、致癌作用，亦无神经毒害，对大鼠的繁殖无影响，大鼠体内代谢可快速吸收和排出。生态毒性：鸟类急性经口山齿鹑LD50>5000 mg/kg，虹鳟鱼LC50>2.9 mg/L。蜜蜂触杀和经口LD50>200 mg/只，蚯蚓LC50>1000mg/kg。环境降解效应：在pH4~9水溶液中稳定。水中光解DT501.7 d(pH=7，25℃)。土壤代谢Koc 847 mL/g(范围405~1294 mL/g)。土壤降解DT50 17 d(范围2~29 d)。

双炔酰菌胺对抑制孢子的萌发具有较高活性。它同时也抑制菌丝体的成长与孢子的形成，对靶标病原体，双炔酰菌胺最好是用作预防性喷洒，但在潜伏期中也可以提供治疗作用。双炔酰菌胺对植物表面的蜡质层具有很高的亲合力。当喷洒到植物表面且沉淀干燥后，大部分活性成分被腊质层吸附，并且很难被雨水冲洗掉。一小部分活性成分渗透到植物组织中，由于其本身活性高，被吸收到植物组织中的这部分足以抑制菌丝体的成长，从而保护整个叶片不受病害侵染。这些性质保证它稳定高效，持效期长，作用效果好，使用剂量低应用范围广。

随着人们对食品中农药残留毒性的关注，双炔酰菌胺残留的检测也受到重视。据美国联邦公报消息，2016年3月28日美国环保署发布条例，修订双炔酰菌胺（mandipropamid）的最大残留限量。土豆（湿皮）中限量小于0.15ppm；块茎和球茎类蔬菜(亚组1C) 限量小于0.09ppm。同时，作为我国主要出口市场的欧盟、日本等国家规定若田间使用农药没有在该国家登记，没有制定相应的残留限量标准时，出口至其国家的食品农产品包括畜禽肉等动物源性食品中残留限量均实行0.01mg/L 的“一律标准”。

我国最新颁布的GB2763—2014《食品中农药最大残留限量》规定了苯酰菌胺、氰酰胺、啶酰菌胺、氟吡菌胺、环酰菌胺、噻呋酰胺、双炔酰菌胺7种新型酰胺类杀菌剂在食品中的残留限量，而目前尚未有同时分析这7种新型杀菌剂残留分析方法的报道，因此建立果蔬中简单准确的新型酰胺类杀菌剂残留量分析方法已是迫在眉睫。

国内外公开报道的关于新型酰胺类杀菌剂分析手段主要有免疫分析法、气相色谱法、液相色谱法、气相色谱-质谱法，其中目前报道较多的分析方法为气相色谱-质谱联用法。而利用液质联用方法在基质较为复杂的各种蔬菜和干果中检测多双炔酰菌胺残留，并且适应范围广、灵敏度高、重复性好、定性定量准确的LC-MS-MS方法尚未见报道。

因此，一种简便、快速、灵敏度高、重复性好、定性定量准确的双炔酰菌胺在蔬菜和干果中的残留检测方法亟待开发出来。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处，而提供一种简便、快速、灵敏度高、重复性好、定性定量准确的蔬菜干果中双炔酰菌胺残留量的检测方法。

为实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：一种蔬菜干果中双炔酰菌胺残留量的LC-MS-MS（液相色谱-串联质谱）检测方法，包括如下步骤：

（1）试样制备：

将市场采集样品按照四分法缩分至500g，将此样品分成2×200g两份，用食品加工机粉碎，于-20℃冰柜密闭保存。

（2）提取及净化：

称取5.0g已制备好试样于50 mL离心管中，加入10ml乙腈，高速匀浆2min，加入2gNaCl，剧烈振摇1min。取上层乙腈相离心，取1mL上清液加入1mL的甲醇和水混合溶液（体积比1:1）过0.2μm尼龙微孔过滤膜，得到的液相部分即为待测样品。

（3）标准工作溶液的配制:

将不含双炔酰菌胺的同种类基质空白样品按上述步骤(1)、(2)处理，得样品提取净化液，用空白提取净化液配制成至少5个浓度的双炔酰菌胺系列混合标准工作液。

（4）测定和结果计算:

将步骤(3)中的各浓度梯度的标准工作液进行LC-MS-MS测定，以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线；在相同条件下将步骤(2)中净化后的样品液进行LC-MS-MS测定，测得样品液中双炔酰菌胺的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中双炔酰菌胺含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中双炔酰菌胺残留量。

步骤(1)中样品若为脱水蔬菜和干果，需降低称样量，并加适量水充分浸润。

步骤(2)中用乙腈提取时加入氯化钠盐析含水量较少的样品盐析时需加入一定量的水。

步骤(4)中所述的液相色谱的流动相包括A相和B相，A相为甲醇，B相为水；流速：0.3mL/min；进样体积：1.0μL；柱温箱：45℃。

步骤(4)中液相色谱使用梯度洗脱的方法，梯度洗脱程序为：

步骤(4)中液相色谱的色谱柱ZORBAX ECLIPSE Plus C18，2.1×50mm,1.8μm。

步骤(4)中分析条件为：离子源温度375℃.离子源:ESI.电喷雾电压：5000V。雾化器压力：0.138MPa。辅助加热气：0.379MPa。扫描方式：正离子扫描。

步骤(4)中质谱检测使用多反应监测(MRM)负离子扫描模式，双炔酰菌胺的母离子、子离子，去簇电压和碰撞能量分别为：

步骤(4) 中检测所述滤液中农药的母离子和子离子对，若其离子色谱峰保留时间与标准工作溶液一致；且滤液(样品)中目标化合物的两个子离子的相对丰度与浓度相当的空白基质标准溶液的离子相对丰度偏差不超过30％时，则判断该样品中存在该种农药；若上述两个条件不能同时满足，则判断不含该种农药。

本发明所具有的有益效果：

1、本发明采用LC-MS-MS（液相色谱-串联质谱）法定性定量测定蔬菜中残留的以及多杀菌素含量，采用外标法定量，平均回收率为85.0％～94.6%，平均相对标准偏差（RSD）为0.86％～2.89％%，灵敏度高、重复性好。

2、本发明检出限0.003mg/kg，定量检出限0.01mg/kg，能够简便、快速、定性定量准确的蔬菜干果中双炔酰菌胺残留量，能满足美国、日本、欧盟等国家对相应食品安全检测的0.01mg/kg 残留限量，即“一律标准”的技术要求，将为保障我国人民食品安全及对外出口贸易健康发展提供有力的技术支撑。

3、建立了简便、快速并能有效避免样品中基质干扰的样品前处理方法，将此前处理方法结合LC-MS-MS（液相色谱-串联质谱）应用于蔬菜、干果食品中双炔酰菌胺定性确证和定量检测。

附图说明

图1双炔酰菌胺标准曲线；

图2双炔酰菌胺标样0.2mg/L色谱图；

图3番茄空白色谱图；

图4番茄添加0.1mg/kg色谱图；

图5干辣椒空白色谱图；

图6干辣椒添加0.1mg/kg色谱图

图7葡萄干空白色谱图；

图8葡萄干添加0.1mg/kg色谱图。

具体实施例

下列实施例是对发明的进一步说明，但本发明不仅限于此。

实施例中使用的仪器：

液质联用仪：Agilent 6460 Triple Quad LC/MS；Trace 1310型气相色谱-TSQ 8000型三重四极杆串联质谱仪（美国Thermo公司)；Sartorius 电子天平（千分之一，北京赛多利斯天平有限公司)；IKA T18 Basic均质器（德国 IKA 公司)；MS 3基本型涡旋混合器（IKA，Germany）。

药品及标准品：标准品购自天津农业部环境质量监督检验测试中心(质量浓度均为100ug/mL)。乙腈(HPLC 级，Merke，Germany)；甲酸(HPLC 级，CNW，Germany)；甲醇、氯化钠为分析纯，均购自国药集团化学试剂有限公司。

基质匹配标准溶液：用空白样品基质溶液配成不同浓度的基质混合标准溶液，用于制作标准工作曲线，不同种类蔬菜或干果制得不同种类的基质校正工作溶液，基质匹配标准溶液现配现用。

供试蔬菜干果：番茄、干辣椒和葡萄干购自本地超市。

实施例1番茄中双炔酰菌胺残留量的LC-MS-MS检测：

（1）试样制备：

将采集番茄样品按照四分法缩分至500g，将此样品分成2×200g两份，用食品加工机粉碎，于-20℃冰柜密闭保存。

（2）提取及净化：

称取5.0g已制备好的番茄试样于50 mL离心管中，加入10ml乙腈，高速匀浆2min，加入2g NaCl，剧烈振摇1min。取上层乙腈相离心，取1mL上清液加入1mL的甲醇和水混合溶液（体积比1:1）过0.2μm尼龙微孔过滤膜，得到的液相部分即为待测样品。

（3）标准工作溶液的配制:

将不含双炔酰菌胺的番茄基质空白样品按上述步骤(1)、(2) 处理，得样品提取净化液，用空白提取净化液配制0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5mg/L双炔酰菌胺标准工作溶液，将标准工作液进LC-MS/MS分析，以所得峰面积对其相应浓度进行回归分析，以进样浓度（mg/L）为横坐标，峰面积为纵坐标，得到标准工作曲线。

（4）测定和结果计算:

将步骤(3)中的各浓度梯度的标准工作液进行LC-MS-MS测定，以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线；在相同条件下将步骤(2)中净化后的样品液注入LC-MS-MS进行测定，测得样品液中双炔酰菌胺的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中双炔酰菌胺含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中双炔酰菌胺残留量。

步骤(4)中所述的液相色谱的流动相包括A相和B相，A相为甲醇，B相为水；流速：0.3mL/min；进样体积：1.0μL；柱温箱：45℃。

步骤(4)中液相色谱使用梯度洗脱的方法，梯度洗脱程序如表1：

表1：实施例1的梯度洗脱程序

步骤(4)中液相色谱的色谱柱ZORBAX ECLIPSE Plus C18，2.1×50mm,1.8μm。

步骤(4)中分析条件为：离子源温度375℃.离子源:ESI.电喷雾电压：5000V。雾化器压力：0.138MPa。辅助加热气：0.379MPa。扫描方式：正离子扫描。

步骤(4)中质谱检测使用多反应监测(MRM)负离子扫描模式，双炔酰菌胺的母离子、子离子，去簇电压和碰撞能量分别如表2：

表2：实施例1的MRM检测参数

步骤(4)中检测所述滤液中农药的母离子和子离子对，若其离子色谱峰保留时间与标准工作溶液一致；且滤液(样品)中目标化合物的两个子离子的相对丰度与浓度相当的空白基质标准溶液的离子相对丰度偏差不超过30％时，则判断该样品中存在该种农药；若上述两个条件不能同时满足，则判断不含该种农药。

以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线。

表3 番茄空白基质中双炔酰菌胺的标准曲线

加标回收率和重复性：

在不含双炔酰菌胺的苹果中加入0.01mg/kg、0.1mg/kg和0..5 mg/kg3个浓度的添加水平，待农药添加30min后按上述处理步骤进行残留量测定。将测定浓度与农药理论添加浓度进行比较，得到农药添加回收率，每个添加水平平行测定6次，得其相对标准偏差，测定结果见表4。由表4可以看出，在3个加标水平上，双炔酰菌胺的平均回收率为93.1％～94.5％，平均相对标准偏差(RSD)为0.86％～2.89％，说明本发明方法的回收率较高，重复性好。

表4 实施例1中双炔酰菌胺的回收率和重复性(n＝6)

检出限：将不同浓度的双炔酰菌胺基质标准工作溶液注入LC-MS-MS，以最低浓度基质标准溶液色谱峰3倍信噪比和样品处理过程的浓缩倍数计算检出限，双炔酰菌胺的检出限为3μg/kg。

实施例2 干辣椒中双炔酰菌胺残留量的LC-MS-MS检测：

（1）试样制备：

将采集的干辣椒样品按照四分法缩分至500g，将此样品分成2×200g两份，用食品加工机粉碎，于-20℃冰柜密闭保存。

（2）提取及净化：

称取5.0g已制备好的干辣椒试样于50 mL离心管中，加入10ml乙腈，高速匀浆2min，加入2g NaCl，剧烈振摇1min。取上层乙腈相离心，取1mL上清液加入1mL的甲醇和水混合溶液（体积比1:1）过0.2μm尼龙微孔过滤膜，得到的液相部分即为待测样品。

（3）标准工作溶液的配制:

将不含双炔酰菌胺的干辣椒基质空白样品按上述步骤(1)、(2) 处理，得样品提取净化液，用空白提取净化液配制0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5mg/L双炔酰菌胺标准工作溶液，将标准工作液进LC-MS/MS分析，以所得峰面积对其相应浓度进行回归分析，以进样浓度（mg/L）为横坐标，峰面积为纵坐标，得到标准工作曲线。

标准工作溶液的配制、液相色谱- 串联质谱法(LC-MS-MS)测定及定性鉴定的操作步骤、色谱和质谱条件与实施例1番茄样品中双炔酰菌胺的测定一致。

加标回收率和重复性：

在不含双炔酰菌胺的干辣椒中加入0.01mg/kg、0.1mg/kg和0.5 mg/kg3个浓度的添加水平，待农药添加30min后按上述处理步骤进行残留量测定。将测定浓度与农药理论添加浓度进行比较，得到农药添加回收率，每个添加水平平行测定6次，得其相对标准偏差，测定结果见表5。由表5可以看出，在3个加标水平上，双炔酰菌胺的平均回收率为85.0％～86.6％，平均相对标准偏差(RSD)为2.32％～2.45％，说明本发明方法的回收率较高，重复性好。

表5 实施例2中双炔酰菌胺的回收率和重复性(n＝6)

检出限：将不同浓度的双炔酰菌胺基质标准工作溶液注入LC-MS-MS，以最低浓度基质标准溶液色谱峰3倍信噪比和样品处理过程的浓缩倍数计算检出限，双炔酰菌胺的检出限为3μg/kg。

施例3 葡萄干中双炔酰菌胺残留量的LC-MS-MS检测：

（1）试样制备：

将采集的葡萄干样品按照四分法缩分至500g，将此样品分成2×200g两份，用食品加工机粉碎，于-20℃冰柜密闭保存。

（2）提取及净化：

称取5.0g已制备好的葡萄干试样于50 mL离心管中，加入10ml乙腈，高速匀浆2min，加入2g NaCl，剧烈振摇1min。取上层乙腈相离心，取1mL上清液加入1mL的甲醇和水混合溶液（体积比1:1）过0.2μm尼龙微孔过滤膜，得到的液相部分即为待测样品。

（3）标准工作溶液的配制:

将不含双炔酰菌胺的葡萄干基质空白样品按上述步骤(1)、(2)处理，得样品提取净化液，用空白提取净化液配制0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5mg/L双炔酰菌胺标准工作溶液，将标准工作液进LC-MS/MS分析，以所得峰面积对其相应浓度进行回归分析，以进样浓度（mg/L）为横坐标，峰面积为纵坐标，得到标准工作曲线。

标准工作溶液的配制、液相色谱-串联质谱法(LC-MS-MS)测定及定性鉴定的操作步骤、色谱和质谱条件与实施例1中番茄样品中双炔酰菌胺的测定一致。

加标回收率和重复性：

在不含双炔酰菌胺的葡萄干中加入0.01mg/kg、0.1mg/kg和0.5 mg/kg3个浓度的添加水平，待农药添加30min后按上述处理步骤进行残留量测定。将测定浓度与农药理论添加浓度进行比较，得到农药添加回收率，每个添加水平平行测定6次，得其相对标准偏差，测定结果见表6。由表6可以看出，在3个加标水平上，双炔酰菌胺的平均回收率为87.2％～94.6％，平均相对标准偏差(RSD)为1.56％～2.20％，说明本发明方法的回收率较高，重复性好。

表6 实施例3中双炔酰菌胺的回收率和重复性(n＝6)

检出限：将不同浓度的双炔酰菌胺基质标准工作溶液注入LC-MS-MS，以最低浓度基质标准溶液色谱峰3倍信噪比和样品处理过程的浓缩倍数计算检出限，双炔酰菌胺的检出限为3μg/kg。

数据表明，将实施例方法配制0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5mg/L双炔酰菌胺标准工作溶液，以进样浓度（mg/L）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。在0.001~0.1mg/L范围内峰面积与进样浓度呈良好的线性关系，标准曲线方程为：Y=187579x-107.43，相关系数为r=0.9973。

上述实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术对本发明的技术方案作出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。