一种早期筛查实体瘤或癌症的酶联免疫检测试剂盒及应用

摘要

本发明公开了一种早期筛查实体瘤或癌症的酶联免疫检测试剂盒及应用。本发明的试剂盒以SCNH2多肽作为抗原，与兔抗人SCNH2的特异性单克隆抗体结合反应，然后与酶标记的兔的二抗进行结合，并使用相应的底物进行显色，显色后添加显色硫酸或磷酸终止液终止反应，在相应的吸收光下测定产物。通过实验证明：本发明用于检测SCNH2的抗人SCNH2的单克隆抗体特异性高、灵敏度高；并且检测结果因采用酶联免疫专业设备避免了人为操作的误差；可有效、方便地对液体活检样中的SCNH2进行精确的定量检测。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种早期筛查实体瘤或癌症的酶联免疫检测试剂盒及应用。

背景技术

癌症的发生已经成为每个人身边的最大健康隐患。世界卫生组织公布的《全球癌症报告2014》显示，2012年我国癌症患者新增307万，死亡约220万；肺癌、肝癌、食道癌、胃癌和结直肠癌的新增病例和死亡率也远高于世界平均值；2013年亚太抗癌大会上甚至有专家宣称，我国每年新增癌症患者数量已占全球的20％以上，而且癌症高发的势头丝毫没有逆转趋势。随着社会的高速发展癌症也年轻化，癌症的发病年龄已经提前到40岁左右，逐渐成为人类第一致死性疾病。积极预防、早期发现和早期治疗是对付肿瘤最有效的办法。随着人们经济水平的提高，很多人虽然对自己的健康要求高了，但是由于工作压力比较大，多数人没有意识到已经处在亚健康状态或者处在没有症状的早期癌症阶段了。因此血液(血浆和/或血清)和/或尿液的早期筛查对临床早期的癌症或肿瘤发现、确定分期、治疗方案、以及提高治疗效率等具有很大的意义。

癌症的检测和诊断一直以来都是一个棘手的难题。目前，癌症检测和诊断还没有一些标准化的通用手段，普遍采用的结肠镜检查、活体组织检查和PET－CT等方法侵入性强，不可避免造成机体创伤，不仅给患者带来极大的痛苦，操作起来也极为不便，而且费用昂贵、周期比较长，一般人群比较难以承担或承受，还只局限在某些癌种。例如针对结肠癌的结肠镜检查、针对乳癌的乳房X线检查、针对前列腺癌的PSA检查以及子宫颈癌的子宫颈抹片检查等等。但其它的癌症，就没有一些很好的检查方法了，医生只能在这些癌症症状出现后才可以做出诊断，从而失去最佳治疗时机。另外，患者只有在出现了某些影响生活的症状时才去医院进行检查，若是癌症的话，对于大多数人来说，这个时期的癌症已经处于中晚期了，贻误了时机，留给自己的治疗窗口就非常小了。

研究发现，血液中存在的肿瘤特异性靶基因、肿瘤细胞和肿瘤生长因子可以作为一种标志物来进行诊断、治疗和预后监测。因此，体液检查是早期癌症诊断的一个重要方法，可以通过检测血液或尿液中各肿瘤标志物指标的变化来判别是否有癌症风险。目前，如何便捷地通过测试液体活检样及早地诊断早期癌症和肿瘤便成为了癌症诊断的热点领域。癌胚抗原(CEA)、细胞角蛋白19片段(C－19)、神经元烯醇化酶(NSE)、糖类抗原19(CA19-9)、糖类抗原125(CA125)、鳞状细胞癌抗原(SCCAg)、甲胎蛋白(AFP)、前列腺特异抗原(PSA)和人绒毛膜促性腺激素(HCG)等是目前临床上较常用的肿瘤标志物，但是这些标志物在癌症的早期诊断中的价值目前尚无定论(杨德昌等，2001；车国卫等，2003)。

SCNH₂是Apelin家族的一个成员，但是其信号通路与Apelin家族的其它已知成员的信号通路完全不同。SCNH₂是一个16个氨基酸的多肽生长因子，其氨基酸序列为L-V-Q-P-R-G-S-R-N-G-P-G-P-W-Q-G-NH₂(Fang,et.al.,OJCD,2013(3):37-51)。在大多数的哺乳动物或有袋目哺乳动物体内，SCNH₂是非常保守的一个序列，在低等的脊椎动物中消失了。

SCNH₂在17天的小鼠胚胎的未分化细胞核中是高表达，一旦细胞分化，例如成骨细胞中SCNH₂的水平很高，但是分化后的骨细胞中SCNH₂就消失了(Fang,et.al.,OJCD,2013(3):37-51)。另外，癌组织芯片免疫组织化学染色的结果显示，SCNH₂在各种实体瘤中的表达水平显著高于其正常的组织，例如，和正常人相比，90.2％的乳腺癌、96.6％结直肠癌、87.5％的肺癌和75.6％的卵巢癌中SCNH₂的水平显著增加。另外，癌症患者血浆中的SCNH₂的含量也明显地高于正常人的含量(Fang,et.al.,OJCD,2013(3):37-51)。这些证据都表明SCNH₂与癌症和胚胎发育有很强的关联，是一个非常好的与癌症关联的特异性生物标记。

SCNH₂不仅可以促进各种细胞包括不同来源的肿瘤细胞的分裂增殖，尤其在促进血管生成的能力比其同家族多肽生长因子Apelin-13高。在鸡胚绒毛膜血管再生的模型中，100匹克摩尔浓度(pM)的SCNH₂与100纳摩尔浓度(nM)的血管内皮生长因子(VEGF)促进血管生成的能力相当，在1匹克摩尔浓度(pM)时，在体促进血管生成的能力显著高于VEGF的作用。甚至在0.1pM时，仍然具有很强的促血管生成的作用。SCNH₂同时还可以显著地促进癌细胞的迁移和浸润。SCNH₂的促细胞增殖、血管生成、癌细胞迁移和浸润的作用几乎完全可以被抗SCNH₂的抗体抑制(Fang,et.al.,OJCD,2013(3):37-51)。以上证据证明，极微量的SCNH₂如0.1pM就可以起到其它生长因子如VEGF、Apelin-13很高剂量如1,000倍剂量100nM的生物功效，而且其在各种实体瘤中的表达水平急剧升高(Fang,et.al.,OJCD,2013(3):37-51)，因此，测定血液中的SCNH₂的水平对于癌症的预警筛查、早期筛查、检测诊断、化疗效果检测、手术切除癌症的彻底性检测和肿瘤的复发监控等将具有很好的临床意义。

发明内容

本发明的一个目的是提供抗SCNH₂的单克隆抗体。

本发明提供的抗SCNH₂的单克隆抗体由保藏号为CGMCCNo.11599的杂交瘤细胞株产生的。

本发明的另一个目的是提供一株分泌抗SCNH₂的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

本发明提供的杂交瘤细胞株的名称为SCNH-MoAb，其分类命名为鼠杂交瘤细胞株，该细胞株于2015年11月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCCNo.11599。

本发明还有一个目的是提供上述单克隆抗体或上述杂交瘤细胞株的新用途。

本发明提供了上述单克隆抗体或上述杂交瘤细胞株在如下1)-6)中至少一种中的应用：

1)检测或辅助检测待测样品中SCNH₂含量；

2)制备检测或辅助检测待测样品中SCNH₂含量的试剂或试剂盒；

3)筛查早期实体瘤和/或癌症；

4)制备筛查早期实体瘤和/或癌症的产品；

5)监测癌症治疗效果和/或监测癌症有无复发；

6)制备监测癌症治疗效果和/或监测癌症有无复发的产品。

上述应用中，所述癌症为结直肠癌、胃癌和/或胰腺癌。

本发明的最后一个目的是提供一种检测或辅助待测样品中SCNH₂含量的酶联免疫试剂盒。

本发明提供的检测或辅助待测样品中SCNH₂含量的酶联免疫试剂盒包括独立包装的上述单克隆抗体、SCNH₂多肽和酶标记的二抗。

上述试剂盒还包括记载所述单克隆抗体的工作浓度和所述SCNH₂多肽的工作浓度的载体，

所述单克隆抗体的工作浓度为0.1-100μg/ml；

所述SCNH₂多肽的工作浓度为0.5-1μg/ml。

上述试剂盒中，

所述单克隆抗体的工作浓度为0.3125μg/ml；

所述SCNH2多肽的工作浓度为1μg/ml。

上述试剂盒中，

所述酶为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或葡萄糖氧化酶等任何适于标记酶联免疫吸附试验的酶；所述酶具体为辣根过氧化物酶。

上述试剂盒还包括底物，所述底物为邻苯二胺、联大茴香胺、5-氨基水杨酸、邻联甲苯胺或3,3’,5,5’-甲基联苯胺；所述底物具体为3,3’,5,5’-甲基联苯胺。

上述试剂盒在如下1)-5)中至少一种中的应用也属于本发明的保护范围：

1)检测或辅助检测待测样品中SCNH₂含量；

2)筛查早期实体瘤和/或癌症；

3)制备筛查早期实体瘤和/或癌症的产品；

4)监测癌症治疗效果和/或监测癌症有无复发；

5)制备监测癌症治疗效果和/或监测癌症有无复发的产品。

上述应用或上述试剂盒中，所述待测样品为尿液和/或血清和/或血浆。

本发明利用抗SCNH₂的特异性抗体采用酶链免疫吸附法来检测液体活检样中的SCNH₂的水平，实现早期筛查实体瘤或癌症、监测癌症治疗效果、监测癌症有无复发。具体方法如下：以SCNH₂多肽作为抗原，与兔抗人SCNH₂的特异性单克隆抗体结合反应，然后与酶标记的兔的二抗进行结合，并使用相应的底物进行显色，显色后添加显色硫酸或磷酸终止液终止反应，在相应的吸收光下测定产物。通过实验证明：本发明用于检测SCNH₂的抗人SCNH₂的单克隆抗体特异性高、灵敏度高；并且检测结果因采用酶联免疫专业设备避免了人为操作的误差；可有效、方便地对液体活检样中的SCNH₂进行精确的定量检测。

附图说明

图1为兔抗SCNH₂抗体效价检测结果。

图2为SCNH₂包被浓度检测结果。

图3为尿液中SCNH₂浓度检测结果。

图4为血清中SCNH₂水平检测结果。

图5为血浆中SCNH₂水平检测结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的标本稀释液：含有1％牛血清白蛋白(简称BSA，Fisher，货号C79500)的pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)。

下述实施例中的洗涤液：pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)。

下述实施例中的酶底物：3,3’,5,5’-甲基联苯胺(TBM，一步超敏四甲基联苯胺Tetramethylbenzidine)是Sigma公司的产品，货号为T0440-1L。

下述实施例中的酶反应终止液：0.02M的硫酸。

下述实施例中的细胞冻存液：50％小牛血清；40％不完全培养液(Sigma，货号R5886)；10％DMSO(二甲基亚砜，Fisher,货号MT25950CQC)。

下述实施例中的完全培养液为将FBS(Fisher，货号MT35015CV)和RPMI1640培养基(Fisher,货号32404-014)混匀得到的培养液，FBS在完全培养液中的体积分数为10％。

实施例1、杂交瘤细胞株的获得及抗SCNH₂的单克隆抗体的制备

一、免疫原的制备

SCNH₂多肽(氨基酸序列为L-V-Q-P-R-G-S-R-N-G-P-G-P-W-Q-G-NH₂)合成由美国GenScript技术有限公司完成。具体步骤如下：采用多肽合成仪(TETRAS^TMPeptideSynthesizer,AdvancedChemTech,Germany)固相合成SCNH₂多肽，得到多肽载体后，通过反相高压液相色谱仪(HPLC)进行纯化后，再经过HPLC和质谱仪对纯化物进行分析，纯度达到90％以上。纯化物进一步经过干冰冷冻干燥成粉剂。

二、动物免疫

将合成的具有生物活性的SCNH₂多肽作为免疫原对兔子进行免疫接种。具体步骤如下：将步骤一制备的SCNH₂多肽(溶剂为pH7.4的磷酸盐缓冲液，SCNH₂多肽的浓度为1毫克/毫升)与免疫佐剂福氏佐剂混匀，进行背部皮下多点注射，0.1毫升/点。首次免疫注射抗原量为400微克/只兔，加强免疫的剂量约为首次剂量的1/4左右。每2～3周加强免疫一次。

福氏佐剂的配置：将羊毛脂与石蜡油按1:3的比例置容器内，用超声波使之混匀，高压灭菌，置4℃下保存备用。首次免疫前，将卡介苗与灭菌的福氏佐剂混匀(卡介苗终浓度为4毫克/毫升)，用振荡器混成乳状，用一注射器装抗原液(SCNH₂多肽溶液)，另一注射器装等量佐剂，二者以聚乙烯塑料管连接，然后二者来回反复抽吸，约数十分钟后即能完全乳化。检查合格后即以其中一注射器作注射用。加强免疫时，不添加卡介苗，直接按照上述步骤混合等量的抗原和佐剂后进行免疫注射。在第2次加强免疫后2周，从耳缘静脉取2～3ml血，制备血清，检测血清的抗体效价。如未达到预期效价，需再进行加强免疫，直到满意时为止。当抗体效价达到预期水平时，即可放血制备抗血清。并将制备好的血清通过蛋白G(Fisher，货号PI21359)进行纯化(按说明书操作)，纯化后得到的IgG即为多克隆抗体。

三、细胞融合和克隆化

(一)细胞融合

(1)制备饲养细胞层

选用6～10周的BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞。按照如下步骤进行操作：

A、拉颈处死，浸泡在75％酒精内，3～5分钟；

B、用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜；

C、用无菌注射器注入5～6毫升预冷的培养液RPMI1640(Sigma，货号R5886)(严禁刺破肠管)；

D、反复冲洗，吸出冲洗液；

E、冲洗液放入10毫升离心管，1200转/分离5～6分钟；

F、用20％小牛血清(Fisher，货号MT35015CV)的培养液混悬，调整细胞数至1×10⁵/毫升；

G、加入96孔板(Fisher，货号12565501)，100微升/孔；

H、放入37℃，CO₂孵箱培养。

(2)制备免疫脾细胞

A、最后一次加强免疫3天后兔拉颈处死；

B、无菌取脾脏，培养液洗一次；

C、脾脏研碎，过不锈钢筛网；

D、离心，细胞用培养液洗2次；

E、计数；

F、取1×10⁸脾淋巴细胞悬液备用。

(3)制备骨髓瘤细胞

A、取对数生长骨髓瘤细胞离心；

B、用无血清培养液洗2次；

C、计数，取得1×10⁷细胞备用。

(4)融合

①将步骤(3)制备的骨髓瘤细胞与步骤(2)制备的脾细胞按1:10的比例混匀，在50毫升离心管中用无血清不完全培养液洗1次，离心，1200转/分钟，8分钟；弃上清，用吸管吸净残留液体，以免影响聚乙二醇(简称PEG，Sigma,货号1546569)浓度。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。

②90秒内加入37℃预温的1毫升45％PEG溶液，边加边轻微摇动。37℃水浴作用90秒。

③加入37℃预温的不完全培养液以终止PEG作用，每隔2分钟分别加入1毫升、2毫升、3毫升、4毫升、5毫升和6毫升。

④离心，800转/分钟,6分钟。

⑤充上清，用含20％血清HAT选择培养液重悬。

⑥将上述细胞加到已有饲养细胞层的96孔板内，每孔加100微升。一个免疫脾脏可接种4块96孔板。

⑦将培养板置37℃、5％二氧化碳培养箱中培养。

脾细胞和骨髓瘤细胞经PEG处理后，在选择培养液(HAT，Sigma，货号H0262)中培养，由于骨髓瘤细胞缺乏胸苷激酶或次黄嘌呤鸟嘌呤核糖转移酶，故不能生长繁殖，而杂交瘤细胞具有上述两种酶，在HAT选择培养液可以生长繁殖。在用HAT选择培养1～2天内，将有大量瘤细胞死亡，3～4天后瘤细胞消失，杂交细胞形成小集落，HAT选择培养液维持7～10天后应换用HT培养液(HT，Sigma，货号H0137)，再维持培养2周。在上述选择培养期间，每2～3天换一半培养液。杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。

(二)抗体的检测

特异性抗体的检测方法采用酶联免疫吸附试验。

(三)杂交瘤的克隆

采用有限稀释法克隆进行抗体阳性孔克隆。

(1)克隆前1天制备饲养细胞层(同细胞融合)；

(2)将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻吹干，计数；

(3)调整细胞为3～10个细胞/毫升；

(4)取头天准备的饲养细胞层的细胞培养板，每孔加入稀释细胞100微升。孵育于37℃、5％二氧化碳孵箱中；

(5)在第7天换液，以后每2～3天换液1次；

(6)8～9天可见细胞克隆形成并及时检测抗体活性；

(7)将阳性孔的细胞移至24孔板(Fisher,货号08-772-1H)中扩大培养；

(8)每个克隆都迅速地冻存。

将上述抗体效价最高的(1:250000)的单克隆杂交瘤细胞株命名为SCNH-MoAb，其分类命名为鼠杂交瘤细胞株，并将该细胞株于2015年11月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCCNo.11599。

四、杂交瘤细胞的冻存与复苏

1、杂交瘤细胞的冻存

杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样，每支冻存管(Fisher,货号0339011)含1×10⁶以上，但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而改变，在24孔培养板中培养，当长满孔底时，一孔装一支冻存管冻存。

冻存液最好预冷，操作动作轻柔、迅速。冻存时用细胞冻存装置(Fisher，货号13900857)进行冻存。冻存细胞要定期复苏，检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性，在液氮中细胞可保存数年或更长时间。

2、细胞复苏方法

将玻璃安瓿自液氮中小心取出，放37℃水浴中，在1分钟内使冻存的细胞解冻，将细胞用完全培养液洗涤两次，然后移入头天已制备好的饲养层细胞的培养瓶内，置37℃、5％二氧化碳孵箱中培养，当细胞形成集落时，检测抗体活性。

用冻存液(即含10％DMSO，20％血清的培养液)将杂交瘤细胞株CGMCCNo.11599制成1×10⁶个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时，取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后移入培养瓶内培养。

五、单克隆抗体的制备和纯化

(一)小批量制备单克隆抗体

将上述选定的单克隆细胞株，使用完全培养液培养两天后，离心收集一半的培养液冷藏在4℃冰箱中；另外一半补充新鲜的完全培养液后，悬浮单克隆细胞株继续培养，如此重复几次后，将所有收集的培养液用蛋白G进行纯化(按说明书操作)，获得抗SCNH₂的单克隆抗体。

(二)大规模制备单克隆抗体

通过在小鼠体内接种杂交瘤细胞来制备腹水从而大批量地生产单克隆抗体。腹水的制备：先腹腔注射0.5毫升Pristane(降植烷)或液体石蜡于BALB/C鼠，1～2周后腹腔注射1×10⁶个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获5～10毫升腹水。也可用注射器抽提腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达到5～10毫克/毫升，或者还可将腹水中细胞冻存起来，复苏后转种小鼠腹腔则产生更大量的含有单克隆抗体的腹水。收集的腹水可以用蛋白G(按说明书操作)进行纯化，获得大量的抗SCNH₂的单克隆抗体。

实施例2、抗SCNH₂的单克隆抗体的工作浓度和SCNH₂包被最适浓度的优化

一、抗SCNH₂工作浓度的优化

1、抗体梯度稀释96孔板

用标本稀释液将实施例1制备的抗SCNH₂的单克隆抗体溶液稀释为1毫克/毫升的浓度，制备一个抗SCNH₂抗体的96孔储存板：第一列为150μl1:100稀释的抗体；第二列为150μl1:200稀释的抗体；以此类推一直到第十二列为150μl1:204,800稀释的抗体。然后，将此储存板保存在2～8度的冷藏箱中备用。

2、SCNH₂包被的聚苯乙烯96孔板

将实施例1制备的SCNH₂多肽(SCNH₂)用PBS(PH为7.4)溶液稀释为4个不同的浓度：2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml和0.25μg/ml；然后将A、B排的每一个孔加入50μl的2μg/ml的SCNH₂，将C、D排的每一个孔加入50μl的1μg/ml的SCNH₂，将E、F排的每一个孔加入50μl的0.5μg/ml的SCNH₂，将G、H排的每一个孔加入50μl的0.25μg/ml的SCNH₂。在室温下，将SCNH₂包被的96孔板放在水平摇床上孵育30分钟。吸掉96孔板中的液体，使用洗涤液洗涤三次，然后将每孔中加入300μl标本稀释液。将此96孔板放置在水平摇床上，在室温下摇30分钟，然后，弃去标本稀释液。

3、第一抗体竞争性结合抗原

将步骤1制备的抗体梯度稀释96孔板中的抗体添加到包被好的聚苯乙烯96孔板的相对应的孔中，每孔50μl，然后，将此聚苯乙烯板在室温下摇动孵育30分钟后弃去抗体，用洗涤液洗涤三次。

4、二抗标记第一抗体

将HRP标记的抗兔IgG的二抗(Fisher，货号AP32PMI)用样本稀释液进行1:500倍稀释，添加50μl到每一孔，在室温下摇动孵育30分钟后弃去二抗，用洗涤液洗涤三次。

5、底物显色

添加100μl的酶底物(一步超敏四甲基联苯胺TBM)，在室温下避光处孵育30分钟后，每孔添加50μl的酶反应终止液(0.02M的硫酸)。

6、酶标仪分析

用酶标仪(TECAN酶标仪)测定各孔450nm处的OD值。并以抗体稀释浓度为横坐标，以OD值为纵坐标绘制曲线。曲线如图1所示，从图中可以看出，抗SCNH₂的单克隆抗体的适用浓度为0.1ng/ml-100ug/ml，最优浓度为0.3125ng/ml。

二、SCNH₂包被的最适浓度的选择

1、按照上述步骤制备SCNH₂包被的聚苯乙烯96孔板

2、制备适合的第一抗体工作液

用标本稀释液将实施例1制备的抗SCNH₂的单克隆抗体进行1:1600倍稀释，得到第一抗体溶液。

3、制备梯度稀释的SCNH₂

用样本稀释液将SCNH₂进行梯度稀释，浓度分别为400pg/ml、2ng/ml、4ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、200ng/ml、400ng/ml、2μg/ml、4μg/ml、20μg/ml和40μg/ml，放置在2～8度冷藏箱中保存备用。

4、制备竞争性抗原抗体反应

将步骤1中的聚苯乙烯96孔板的第1列加入25μl的样本稀释液，将3中梯度稀释的SCNH₂依次添加到第2列，第3列，直至第12列。然后添加步骤2中制备的第一抗体溶液25μl到每一个孔中，在室温下摇动孵育30分钟后弃去液体，用洗涤液洗涤三次。

重复步骤一中的5、6的步骤。

结果如图2所示，SCNH₂包被的适用浓度为0.5-1μg/ml，最优浓度为1μg/ml。

实施例3、抗SCNH₂单克隆抗体的应用

一、抗SCNH₂单克隆抗体在检测尿样中的SCNH₂水平中的应用

1、尿液的收集

收集正常人和癌症患者(肺癌和结直肠癌)的尿液(所有的正常人和癌症患者都签署了知情同意书，取样程序和检测都遵从科学研究的伦理程序)，收集尿液前，需用消毒纸巾将外阴部及尿道口进行消毒处理，然后，用无菌器皿收取中间尿液。将2毫升的尿液转移到无菌的离心管中在室温下，1500转速离心10分钟后，取上清液分装在3个不同的无菌的2毫升的离心管中，并对其进行编号登记。其中两管冻存在-80度的冰箱中，1管保存在2～8度的冷藏箱中在短期内用于进行检测。

2、检测尿样中的SCNH₂水平

(1)将浓度为1μg/ml的SCNH₂包被聚苯乙烯96孔板，每孔中添加50μl，室温下在摇床上孵育30分钟。

(2)弃去包被液。使用300μl的洗涤液洗涤三次，每次5分钟。

(3)弃去洗涤液。每空中添加100μl包被液，室温下在摇床上孵育30分钟。

(4)弃去包被液。将第一列添加25μl的样本稀释液，第1、2排的第二个孔至第12个孔添加25μl梯度稀释的SCNH₂，浓度如下：400pg/ml、2ng/ml、4ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、200ng/ml、400ng/ml、2μg/ml、4μg/ml、20μg/ml和40μg/ml。第2排至第8排的第二列至第六列添加25μl不同的正常人尿液样本，共15个样本，每个样本两个孔。其余的孔为检测样本，共18个样本，每个样本两个孔。室温下水平摇动5分钟。然后，添加25μl的浓度为312.5ng/ml的实施例1中制备的抗SCNH₂的单克隆抗体。室温下在摇床上孵育30分钟。

(5)弃去样本-抗体液体。使用300μl的洗涤液洗涤三次，每次5分钟。

(6)弃去洗涤液。每孔中添加50μlHRP标记的抗兔IgG的二抗，用样本稀释液进行1/500倍稀释，在室温下摇动孵育30分钟。

(7)弃去二抗液体。使用300μl的洗涤液洗涤三次，每次5分钟。

(8)弃去洗涤液。添加100μl的酶底物(一步超敏四甲基联苯胺TBM)，在室温下避光处孵育30分钟后，每孔添加50μl的终止液(0.02M的硫酸)。

(9)酶标仪读板分析：用酶标仪(TECAN酶标仪)测定各孔450nm处的OD值。以SCNH₂浓度为横坐标，以OD值为纵坐标绘制曲线。曲线结果见图3。从图中可以看出，正常人尿液中的SCNH₂浓度为0.05ng/ml，结直肠癌患者尿液中的SCNH₂浓度为0.5ng/ml，肺癌患者尿液中的SCNH₂浓度为0.4ng/ml。癌症患者尿液中的SCNH₂浓度明显高于正常人，说明本发明的抗SCNH₂抗体特异性高、检测灵敏度高，可有效、方便地对液体活检样中的SCNH₂进行精确的定量检测。

二、抗SCNH₂单克隆抗体在检测血清中的SCNH₂水平中的应用

1、血清标本的获取

收集正常人和癌症患者(胰腺癌和胃癌)的血清(所有的正常人和癌症患者都签署了知情同意书，取样程序和检测都遵从科学研究的伦理程序)。具体步骤如下：使用乙二胺四乙酸(EDTA)处理的真空干燥管(抗凝管，紫色盖)收集2毫升的新鲜血液后，将其在室温下静置30分钟。将样品在室温下，1500转速离心10分钟，然后取上清液血清分装于无菌的3个不同的2毫升离心管中，并对其进行编号登记。其中两个离心管样品冻存在-80度的冰箱内，1管保存在2～8度的冷藏箱中在短期内用于检测。

2、检测血清中的SCNH₂水平

(1)将浓度为1μg/ml的SCNH₂包被聚苯乙烯96孔板，每孔中添加50μl，室温下在摇床上孵育30分钟。

(2)弃去包被液。使用300μl的洗涤液洗涤三次，每次5分钟。

(3)弃去洗涤液。每孔中添加100μl包被液，室温下在摇床上孵育30分钟。

(4)弃去包被液。将第一列添加25μl的样本稀释液，第1、2排的第二个孔至第12个孔添加25μl梯度稀释的SCNH₂，浓度如下：400pg/ml、2ng/ml、4ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、200ng/ml、400ng/ml、2μg/ml、4μg/ml、20μg/ml和40μg/ml。第3排至第8排的第二列至第六列添加25μl不同的正常人血清样本，共15个样本，每个样本两个孔。其余的孔为检测血清样本，共18个样本，每个样本两个孔。室温下水平摇动5分钟。然后，添加25μl的浓度为312.5ng/ml的实施例1中制备的抗SCNH₂的单克隆抗体。室温下在摇床上孵育30分钟。

(5)弃去样本-抗体液体。使用300μl的洗涤液洗涤三次，每次5分钟。

(6)弃去洗涤液。每孔中添加50μlHRP标记的抗兔IgG的二抗，用样本稀释液进行1:500倍稀释，在室温下摇动孵育30分钟。

(7)弃去二抗液体。使用300μl的洗涤液洗涤三次，每次5分钟。

(8)弃去洗涤液。添加100μl的酶底物(一步超敏四甲基联苯胺TBM)，在室温下避光处孵育30分钟后，每孔添加50μl的终止液(0.02M的硫酸)。

(9)用酶标仪(TECAN酶标仪)测定各孔450nm处的OD值。以SCNH₂浓度为横坐标，以OD值为纵坐标绘制曲线。曲线结果见图4。从图中可以看出，正常人尿液中的SCNH₂浓度为0.9ng/ml，胃癌患者尿液中的SCNH₂浓度为4ng/ml，胰腺癌患者尿液中的SCNH₂浓度为30ng/ml。癌症患者尿液中的SCNH₂浓度明显高于正常人，说明本发明的抗SCNH₂抗体特异性高、检测灵敏度高，可有效、方便地对液体活检样中的SCNH₂进行精确的定量检测。

三、抗SCNH₂单克隆抗体在检测血浆中的SCNH₂水平中的应用

1、血浆标本的获取

使用真空干燥管(非抗凝管，红色盖)收集2毫升的新鲜血液后，将其在室温下静置30分钟。将样品在室温下，1500转速离心10分钟，然后取上清液血浆分装于无菌的3个不同的2毫升离心管中，并对其进行编号登记。其中两个离心管样品冻存在-80度的冰箱内，1管保存在2～8度的冷藏箱中在短期内用于检测。所有的正常人和癌症患者都签署了知情同意书，取样程序和检测都遵从科学研究的伦理程序。

2、检测血浆中的SCNH₂水平

(1)采用浓度为1μg/ml的SCNH₂包被聚苯乙烯96孔板，每空中添加50μl，室温下在摇床上孵育30分钟。

(2)弃去包被液。使用300μl的洗涤液洗涤三次，每次5分钟。

(3)弃去洗涤液。每孔中添加100μl包被液，室温下在摇床上孵育30分钟。

(4)弃去包被液。将第一列添加25μl的样本稀释液，第1、2排的第二个孔至第12个孔添加25μl梯度稀释的SCNH₂，浓度如下：400pg/ml、2ng/ml、4ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、200ng/ml、400ng/ml、2μg/ml、4μg/ml、20μg/ml和40μg/ml。第三排至第八排的第二列至第六列添加25μl不同的正常人血浆样本，共15个样本，每个样本两个孔。其余的孔为检测血浆样本，共18个样本，每个样本两个孔。室温下水平摇动5分钟。然后，添加25μl的浓度为312.5ng/ml的兔抗SCNH₂抗体。室温下在摇床上孵育30分钟。

(5)弃去样本-抗体液体。使用300μl的洗涤液洗涤三次，每次5分钟。

(6)弃去洗涤液。每孔中添加50μlHRP标记的抗兔IgG的二抗，用样本稀释液进行1:500倍稀释，在室温下摇动孵育30分钟。

(7)弃去二抗液体。使用300μl的洗涤液洗涤三次，每次5分钟。

(8)弃去洗涤液。添加100μl的酶底物(一步超敏四甲基联苯胺，TBM)，在室温下避光处孵育30分钟后，每孔添加50μl的终止液(0.02M的硫酸)。

(9)用酶标仪(TECAN酶标仪)测定各孔450nm处的OD值。以SCNH₂浓度为横坐标，以OD值为纵坐标绘制曲线。曲线结果见图5。从图中可以看出，正常人尿液中的SCNH₂浓度为0.9ng/ml，胰腺癌患者尿液中的SCNH₂浓度为51ng/ml，胃患者尿液中的SCNH₂浓度为50ng/ml。癌症患者尿液中的SCNH₂浓度明显高于正常人，说明本发明的抗SCNH₂抗体特异性高、检测灵敏度高，可有效、方便地对液体活检样中的SCNH₂进行精确的定量检测。