聚甲酚磺醛在制备用于治疗登革病毒感染所致疾病的药物中的用途

摘要

本发明公开了聚甲酚磺醛(Policresulen)在制备治疗登革病毒感染所致疾病的药物中的用途。所述登革病毒感染所致疾病包括登革热、登革出血热和登革热休克综合征。因此，聚甲酚磺醛对登革病毒的NS2B-NS3蛋白酶具有抑制作用，其可以应用于治疗由登革病毒感染引起的登革热、登革出血热和登革热休克综合征。

说明书

技术领域

本发明涉及药物治疗学领域，具体涉及聚甲酚磺醛在制备用于治疗由登革病毒感染引起的疾病的药物中的用途，所述由登革病毒感染引起的疾病为登革热、登革出血热或登革热休克综合征。

背景技术

登革病毒(DengueViruses，DV)属于黄病毒属(Flavivirus)，是热带以及亚热带地区传播最广的病原体之一。登革病毒的感染会导致一系列严重的传染性疾病，临床上主要表现为登革热(Denguefever，DF)，登革出血热(Denguehemorrhagicfever，DHF)以及登革热休克综合征(Dengueshocksyndrome，DSS)、其中以DHF/DSS致死率为高，主要发生于新生儿和二次感染的人群[TheLancet,1998,352(9132):971-977.MicrobesandInfection,2010,12(2):113-118.]。登革病毒根据E蛋白的抗原性不同，可分DV1、DV2、DV3、DV4这4种血清型。感染其中任意一型的DV不仅不会使机体对其他三型的登革热病毒产生抵抗反而增加了被其他三型登革热病毒感染的可能。DV的这种抗体依赖性感染增强作用(Antibody-dependentenhancement，ADE)使得疫苗的研制变得异常困难，目前最有效的预防措施在于防蚊[ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2007,104(22):9422-9427.]。

靶向病毒的蛋白酶发现其高活性抑制剂已经作为一种极有前景的抗病毒策略在治疗HIV(Humanimmunodeficiencyvirus)，HCV(HepatitisCvirus)等病毒感染上广泛应用，并取得了一定的效果。目前，已有数个HIV和HCV的蛋白酶抑制剂正在进行临床研究[AntiviralRes.2010,85:210-231.ExpertOpin.Emerg.Drugs,2008,13:1-19.]。基于此研究策略以及鉴于NS3蛋白酶在登革病毒复制过程中的极度重要性的作用，该蛋白被认为是最有前景的抗登革病毒药物靶点[Antiviralresearch,2008,80(2):94-101.]。另外，有研究报道NS3蛋白酶N末端活性主要依赖于NS2B蛋白的辅助[Journalofvirology,1993,67(4):2034-2042.]，因此许多研究将NS2B/NS3作为一种主要的分子靶标来开发抗登革病毒药物[Antiviralresearch,2010,85(3):450-462.]。

聚甲酚磺醛是一种高分子量有机酸，pH值接近于4，可以通过蛋白凝固和促进血管肌纤维的收缩作用起到止血的功能；可以通过选择性的和坏死或病变组织细胞膜的磷脂结合，导致病变组织细胞死亡；还可以通过高酸和蛋白凝固作用具有广谱的抗菌作用，包括葡萄球菌(staphylococcusspp.)，链球菌(streptococcusspp.)和白色念珠菌(Candidaalbicans)。可用于治疗宫颈糜烂、阴道各种炎症或切片检查后的止血。也可用于治疗小面积烧伤、肢体溃疡、褥疮及慢性皮炎等[RevColBrasCir.2014,41(2):92-98.]。所述聚甲酚磺醛具有如下结构式：

其中，n为1的结构是其主要成分。

本发明经随机筛选发现聚甲酚磺醛是2型登革病毒的NS2B-NS3蛋白酶的抑制剂，可以抑制登革病毒的复制活性。因此，聚甲酚磺醛可应用于治疗由登革病毒感染引起的登革热、登革出血热和登革热休克综合征。

发明内容

本发明的一个目的是提供聚甲酚磺醛在制备用于治疗由登革病毒感染引起的疾病的药物中的用途。所述疾病为登革热、登革出血热或登革热休克综合征。

本发明的另一目的是公开聚甲酚磺醛在制备作为登革病毒的NS2B-NS3蛋白酶的抑制剂中的用途。

本发明的有益效果

本发明创造性地发现了聚甲酚磺醛的新的作用靶点和药效，其对登革病毒的NS2B-NS3蛋白酶具有抑制作用。同时还具有抑制登革病毒复制的作用。所述聚甲酚磺醛可用于治疗由登革病毒感染引起的登革热、登革出血热和登革热休克综合征。

附图说明

图1为显示聚甲酚磺醛可以浓度依赖性的结合NS2B-NS3蛋白的图。

图2为显示聚甲酚磺醛可以浓度依赖性的抑制NS2B-NS3活性的图。

图3为显示聚甲酚磺醛对BHK-21的细胞毒性的图。

图4为显示聚甲酚磺醛可以浓度依赖性的抑制DENV2报告病毒的活性的图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明。

试验实施例

试验实施例1：聚甲酚磺醛对NS2B-NS3结合活性测定实验

本发明在大肠杆菌BL21(DE3)中表达并分离纯化获得2型登革病毒的NS2B-NS3蛋白，测试了聚甲酚磺醛对NS2B-NS3的结合活性。实验表明，聚甲酚磺醛能浓度依赖性的和NS2B-NS3结合，其平衡解离常数K_D为0.69μg/mL。

1、实验材料和方法

1)NS2B-NS3蛋白的制备：将2型登革病毒的NS2B-NS3基因序列(NS2B(aa49-95)-Gly4-Ser-Gly4-NS3(aa1-185)克隆到pET15b原核表达载体上，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达，用His柱纯化得到的NS2B-NS3蛋白，透析、浓缩到约10mg/mL。

2)NS2B-NS3蛋白芯片的制备：使用GE公司生产的BiacoreT200仪器完成这部分工作。所有的实验都在25℃进行。NS2B-NS3通过标准氨基偶联的方法偶联到芯片CM5表面上，具体步骤如下：首先，配制HBS-EP工作缓冲液(10mMHepes,150mMNaCl,3.4mMEDTA,0.005％(v/v)surfactantP20,pH7.4)，平衡机器至基线平稳。偶联时，0.2M1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和50mMN-羟基丁二酰亚胺(EDC/NHS)1：1混和，以5μL/min进样7分钟活化芯片表面。NS2B-NS3用10mM(pH3.9)的乙酸钠溶液稀释至终浓度为15μg/mL，以5μL/min流速进样固定在芯片表面。最后，1M乙醇胺(pH8.5)以5μL/min流速进样7分钟，进行芯片表面的封闭，至最终的偶联量为5000RU。NS2B-NS3偶联完成后，平衡过夜至基线平稳，然后进行聚甲酚磺醛与NS2B-NS3结合的相关动力学研究。

3)化合物结合活性测定实验方法：用SPR的方法测定聚甲酚磺醛(安徽德信佳生物医药有限公司，50％水溶液)与NS2B-NS3的结合活性。分别用HBS-EP缓冲液稀释聚甲酚磺醛母液到5.89μg/mL，4.12μg/mL，2.88μg/mL，2.01μg/mL，1.41μg/mL，0.99μg/mL，0.69μg/mL，0.48μg/mL离心后自动进样，检测不同浓度聚甲酚磺醛与NS2B-NS3的结合活性。聚甲酚磺醛与NS2B-NS3的相互作用分别用BiacoreT200控制软件中的动力学分析Wizard进行动力学实验。所有小分子进样时，流速为30μL/min，进样1分钟，解离2分钟，然后分别用HBS-EP缓冲液洗脱2分钟，以完成一个循环。得到的数据根据BiacoreT200evaluationsoftware分析软件中的1∶1Langmuir结合模型进行拟合，得到确切的动力学常数。

2、实验结果：

结果如附图1所示，聚甲酚磺醛可以浓度依赖性的与NS2B-NS3结合，进一步利用BiacoreT200evaluationsoftware软件拟合出聚甲酚磺醛与NS2B-NS3结合的K_D值为0.69μg/mL。

试验实施例2：蛋白水平测试化合物聚甲酚磺醛对NS2B-NS3的抑制作用(IC₅₀的测试)

本发明在蛋白水平上通过测定蛋白酶在与化合物共孵育的情况下对特异性底物水解程度影响来测试聚甲酚磺醛对NS2B-NS3的酶活性的影响。研究结果表明，聚甲酚磺醛具有浓度依赖性地抑制NS2B-NS3酶活性的作用，IC₅₀为1.24μg/mL。

1、实验原理

NS2B-NS3蛋白酶可以特异性切割多肽Bz-Nle-Lys-Arg-Arg-AMC，而被切割下来的AMC在380nm激发光下可以产生460nm的发射光，通过测定发射光变化的速率可以反应出NS2B-NS3蛋白酶的活力。

2、实验材料和方法

1)NS2B-NS3蛋白的制备：同“试验实施例1”。

2)NS2B-NS3底物(Bz-Nle-Lys-Arg-Arg-AMC)：购自上海吉尔生化。

3)测定聚甲酚磺醛对NS2B-NS3蛋白IC₅₀的方法：测定在不同浓度聚甲酚磺醛作用下NS2B-NS3蛋白的酶活力。NS2B-NS3酶活测定方法具体如下：首先，配置酶活缓冲液(l50mMTris-HC、10mMNaCl、20％甘油、1mMCHAPS、pH＝8.5)，再将聚甲酚磺醛用DMSO梯度稀释到0.57μg/mL，5.67μg/mL，56.67μg/mL，283.36μg/mL，566.71μg/mL，5667.1μg/mL，11334.2μg/mL，22668.4μg/mL，取上述稀释后各浓度的聚甲酚磺醛及DMSO各1μL加入到89μL酶活体系中(含200nMNS2B-NS3的酶活缓冲液)于37℃孵育30min，然后加入10μL1mM的Bz-Nle-Lys-Arg-Arg-AMC启动反应。在酶标仪(SpectraMaxM5)中检测最初5min荧光值变化速率(V)。酶活测定过程中所使用的为96孔不透光平底黑板。抑制率(％)＝(V_a-V_b)/V_a*100％，其中，V_a为酶与DMSO孵育后的反应初速率；V_b为酶与各浓度聚甲酚磺醛孵育后的反应初速率。得出各浓度聚甲酚磺醛对NS2B-NS3的抑制率后用Origin5.0拟合计算IC₅₀。

3、实验结果：

结果如附图2所示，聚甲酚磺醛可以浓度依赖性的增强对NS2B-NS3酶活的抑制作用，进一步用Origin5.0进行拟合计算得出聚甲酚磺醛的IC₅₀为1.24μg/mL。

试验实施例3：细胞水平检测化合物聚甲酚磺醛对BHK-21细胞的毒性

本发明通过MTT法检测聚甲酚磺醛处理对细胞的毒性。结果表明，聚甲酚磺醛的半数细胞毒性浓度CC₅₀大于376.72μg/mL。

1、实验原理

用MTT法检测聚甲酚磺醛对BHK-21的细胞毒性。MTT全称为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，是一种黄颜色的染料。MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。10％SDS(溶于0.01mol/LHCl溶液中)能溶解细胞中的甲瓒，用多功能酶标仪在570nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

通过检测不同药物浓度下570nm波长处光吸收值，即可计算该药物浓度下细胞的存活率，从而计算聚甲酚磺醛的CC₅₀。

2、实验材料与方法

1)细胞：BHK-21(本实验室保藏)；MTT(Amresco)；DMEM培养基和胎牛血清FBS(Gibco)

2)实验步骤：分BHK-21细胞于96孔板中，每孔1万(注意96孔板最边缘的孔勿用作实验孔，加PBS防止其他孔培养基挥发)；观察细胞状态，达到约50％，取出旧的培养基，换上92μL新鲜培养基2％FBS+DMEM；将聚甲酚磺醛分别用10％的DMSO进行系列稀释；分别于对应孔中加8μL稀释后的药物，每种浓度设5个重复；同时设置对照组(不含药物组，即加8μL10％的DMSO)和空白组(不含细胞组)，置于37℃，5％CO₂的培养箱中培养；于加药后48h，每孔加入25μLMTT溶液(5mg/mL)，继续培养4h后，每孔加入125μL10％SDS(溶于0.01mol/LHCl溶液中)，轻轻吹打，放置2h，使结晶物充分溶解，以空白组调零，测定OD₅₇₀，按以下公式计算：

3、实验结果：

结果如附图3所示，聚甲酚磺醛对细胞毒性较小，当终浓度为376.72μg/mL时，细胞活力依然保持在72.5％。

试验实施例4：细胞水平检测化合物聚甲酚磺醛对2型登革病毒的复制活性

本发明通过Rluc报告基因检测实验技术测试了化合物聚甲酚磺醛对2型登革病毒的复制活性，结果表明聚甲酚磺醛可以浓度依赖性的抑制2型登革报告病毒IC₅₀测定结果为9.99μg/mL，同时该药物的治疗指数(TI,therapeuticindex)大于37.7(即CC₅₀/IC₅₀＝376.72/9.99＝37.7)。

1、实验原理

Rluc报告基因是一种编码可被检测的荧光素酶的基因，在感染性克隆的基础上，将Rluc报告基因与DENV2病毒基因组融合，构建含有Rluc报告基因的病毒cDNA感染性克隆，拯救出的报告病毒与野生型DENV2病毒生长趋势相同且能稳定表达报告基因，通过测定Rluc报告基因所表达荧光素酶的活性即可直观判断DENV2病毒生长情况。

通过检测不同药物浓度作用下Rluc报告病毒的荧光素酶的活性，即可计算药物对病毒的抑制率，从而计算该药物的IC₅₀。

2、实验材料

1、实验材料。细胞：BHK-21(本实验室保藏)；病毒：pACYC-DENV2-Rluc2Areportervirus(感染性克隆体外转录RNA并转染BHK-21细胞后于144h所收毒，滴度：4.3×105PFU/ml)；.试剂盒：ReniliaLuciferaseAssaysystem(Promega)；DMEM培养基和胎牛血清FBS(Gibco)。

2、实验步骤。分BHK-21于24孔板中，5万/孔，37℃培养过夜；24孔板弃培养基，每孔加入200μL含2％FBS的DMEM培养基，按Moi＝0.1(即每孔加入12μL病毒)感染BHK-21细胞，37℃感染1h，弃病毒，每孔加入1mL含2％FBS的DMEM培养基；将送检药物用分别用100％的DMSO进行系列稀释；于对应孔中加入8μL稀释后的药物，Mock：只感染病毒加8μL100％的DMSO，每种药物每种浓度设2个复孔；37℃培养48h，弃培养基，PBS洗1次，每孔加100μL1×裂解缓冲液，刮细胞样；取20uL样品+50μL的底物于酶标板，多功能酶标仪检测luciferase值。根据测得的luciferase值，绘制抑制曲线，同时按照公式计算IC₅₀。

3、实验结果：

结果如附图4所示，聚甲酚磺醛可以浓度依赖性的抑制2型登革报告病毒IC₅₀测定结果为9.99μg/mL，同时该药物的治疗指数(TI,therapeuticindex)大于37.7(即CC₅₀/IC₅₀＝376.72/9.99＝37.7)。