Ⅱ型登革病毒NS1抗原捕获方法建立及其在登革病毒感染分型诊断中的应用

摘要

登革热是一种由白纹伊蚊和埃及伊蚊传播的疾病，自70年代以来，由于蚊媒控制难度大、全球气候变暖、病毒进化和国际间人员流动增多等诸多因素的影响，登革病毒（DENV）的传播范围显著增加。DENV已知有四个血清型（DENV1、DENV2、DENV3和DENV4），任何一种DENV感染均可导致登革热、登革出血热（DHF）或登革休克综合征（DSS），而不同血清型的登革病毒二次感染是引发DHF和DSS的高危因素。由于机体对不同血清型DENV感染的免疫保护作用只是部分的和短暂的，所以生活在疫区的人们在一生中均可能受到四种血清型DENV感染的威胁。因此，在一个地区内各型DENV的反复流行是导致出现此病严重形式DHF和DSS最常见的危险因素。目前，对DENV感染的早期诊断和分型诊断以及区分其他相关的黄热病毒感染中，分子诊断技术（RT-PCR）在很大程度上代替了传统的病毒分离方法。虽然分子检测提供了一种较理想的敏感而快速的诊断，但此方法成本高，且需要专门的实验设备和熟练的技术人员，这些因素局限了其在登革热流行的许多发展中国家的使用。 操作简单、快速准确且成本低的病毒抗原检测方法能很好地克服RT-PCR的缺点，并已成功地应用于感染性疾病的诊断和监测。DENV包含有3个主要的结构蛋白（C，prM，and E）和7个非结构蛋白（NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B，和NS5）。在这些蛋白中，NS1是相对保守的糖蛋白，其分子量为45-50Kda，以膜型和分泌型两种形式高表达于感染的细胞中。虽然NS1的确切功能尚不清楚，但它是一个被研究较多的诊断靶标抗原。近来，已有两种DENVNS1抗原捕获ELISA成为商品化的DENV感染的早期诊断试剂，这两种诊断试剂准确性好、敏感性高，能快速而可靠的诊断DENV急性期初次感染和二次感染。然而，这些方法的局限性在于其使用的抗体是针对四个血清型的DENV和虫媒病毒的交叉抗原表位的，不能区分DENV血清型。研究表明NS1具有群特异性和型特异性，因此特异性针对NS1抗原的单抗产品有望发展成为群特异性和型特异兼有的抗原检测试剂。在前期研究中，我们制备了一组特异性识别DENV1 NS1抗原表位的单抗并成功地建立了检测DENV1 NS1抗原捕获ELISA，此方法已被证明为早期检测和快速鉴定DENV1感染的有效工具。本研究中，我们制备了一组特异性针对DENV2 NS1抗原的单抗，并建立了DENV2型特异性NS1抗原捕获ELISA，并对其在DENV感染早期诊断和分型诊断中的作用和意义进行了初步的探讨。 本研究主要分为三个部分： 第一部分：DENV2 NS1蛋白特异性单克隆抗体的制备及鉴定。 本部分研究在成功获得具有良好抗原性的DENV2 NS1蛋白的基础上，制备抗Ⅱ型登革病毒NS1蛋白特异性单抗，并对单抗进行免疫学特性研究、抗体识别抗原位点分析以及血清型特异性鉴定。采用重组DENV2 NS1蛋白与灭活的DENV2混合免疫BALB/c小鼠，取血清抗体效价高的小鼠脾脏与小鼠骨髓瘤细胞融合，并对阳性的细胞株采用有限稀释法进行克隆化。ELISA检测初步确定有37株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞与DENV2 NS1重组蛋白和DENV2感染细胞裂解上清均有强阳性反应。IgG亚类测定表明，37株单抗中IgG2a有1株，IgG2b有3株，IgG1有33株。Western blot结果显示所有的单抗均与DENV2 NS1重组蛋白和DENV2感染细胞裂解上清呈阳性反应，免疫反应条带位置大小约为分子量45KDa。通过四个血清型DENV的IFA和DENV NS1重组蛋白的ELISA进一步鉴定单抗的血清型特异性，结果显示，在37株单抗中有20株单抗与DENV2特异性反应而与其他三个血清型的DENV无交叉反应，IFA和ELISA的结果一致；另外17株单抗与四个血清型DENV存在不同的交叉反应模式。采用竞争ELISA用DENV2 NS1重组抗原包被微孔板对20株特异性单抗的抗原结合位点进行分析，结果显示，20株单抗至少识别DENV2 NS1蛋白的4个不同的抗原结合位点。为下一步建立双抗体夹心抗原捕获ELISA奠定了基础。 第二部分：DENV2 NS1抗原捕获ELISA的建立。 根据单抗表位测定结果，在识别NS1蛋白不同抗原结合位点的单抗中进行相互配对，以选择最佳的捕获单抗和检测单抗配对建立双抗体夹心ELISA。结果显示，识别抗原结合位点Ⅲ的8株单抗和识别抗原结合位点Ⅳ的9株单抗中进行相互配对检测DENV2 NS1蛋白的敏感性均较高。最后，我们选择了以单抗M6（4D41A6）作为固相的捕获抗体和M14（5A47A8）作为标记的检测抗体的配对组合，其检测系列稀释的DENV2感染细胞培养上清中的NS1抗原的敏感性最高，而检测一组正常人血清标本显示特异性最好。建立的双抗体夹心抗原捕获法检测重组NS1蛋白的灵敏度为3ng/mL，其线性检测范围为10～100 ng/mL，可用于评价临床标本中NS1水平。进一步检测不同血清型的DENV和其它黄病毒的病毒培养液，结果显示，采用血清型特异性单抗建立的双抗体夹心抗原捕获法仅特异的检测到DENV2，而与其它病毒无交叉反应，检测方法具有型特异性。本部分研究表明，采用双抗体夹心抗原捕获法建立的NS1蛋白检测方法具有高敏感性和特异性，可为登革病毒感染提供一种新的实验室诊断方法。 第三部分：DENV2 NS1抗原捕获ELISA初步临床研究。 通过对DENV和临床血清样品的检测，以及与商品化的进口同类产品的比较，探讨所建立方法在登革病毒感染早期诊断和分型诊断中的作用。我们所建立方法与商品化的Panbio DENV NS1抗原捕获ELISA同时检测空斑实验确定病毒滴度的DENV，结果显示我们的方法能检测到的DENV2最高稀释度为1：4，096（5．8 PFU/0．1ml），商品化的试剂盒能检测到的DENV2最高稀释度为1：512（46．8PFU/0．1ml），由此可见，对于DENV2感染细胞培养上清中NS1的检测，我们的方法比商品化的Panbio DENV NS1抗原捕获ELISA敏感性高达8倍。采用建立的方法检测了504例正常人血清样品，确立检测的临界值。对504例正常血清样品的检测全部为阴性，特异性达100%。检测了30份实验室确诊为DENV2感染的病人血清标本以确定本方法对临床标本检测的准确度。在这些标本中，有10份是病毒分离和RT-PCR均确定为阳性，另20份为RT-PCR和Panbio DENV IgM/IgG捕获ELISA检测阳性。依照WHO制定的标准，在血清学分类上17份血清标本被确定为初次感染，13份血清为二次感染。我们所建立的DENV2 NS1抗原捕获ELISA检测30份以1：10稀释血清标本阳性的有25份，由此可见，我们的方法对DENV2病毒分离和/或RT-PCR阳性的血清标本检测的总体阳性率为83．3%（25/30）。这结果与商品化的Panbio DENV NS1抗原捕获ELISA对同样为1：10稀释的血清标本的检测结果一致，两种方法的检测阳性率均为83．3%（25/30），均有5份样本检测为阴性。两种方法检测初次感染急性期血清的阳性率均为88．2%（15/17），检测二次感染的急性期血清的阳性率均为76．9%（10/13），采用统计学Fisher's exact test分析显示，两种检测方法对初次感染和二次感染的血清中NS1的检出率相同且均无显著性差异（P=0．628）。为了进一步评价两种NS1抗原捕获ELISA的灵敏度，将NS1阳性血清进行系列稀释后检测。从两种方法检测NS1均为阳性的25份血清标本中选择了19份血清量较多的标本用于两种方法检测敏感性比较，结果显示我们的方法敏感性明显高于商品化的试剂盒，我们的方法甚至能检测到稀释了10000倍以后的血清标本中的NS1抗原。 通过检测DENV1或其他的虫媒病毒和非虫媒病毒感染的一组血清标本以进一步评价我们所建立方法的特异性。我们分析了301份在先前的研究中用DENV1 NS1抗原捕获ELISA检测为阳性的DENV1感染患者急性期血清，以及132份其他的相关病毒感染的急性期血清，其中包括50例出血热患者血清，13例乙型脑炎患者血清，49例麻疹患者血清和18例20份钩端螺旋体感染患者血清，对以上标本的检测结果均为阴性，由此表明，我们所建立的方法具有登革病毒血清型特异性而且与其它相关或无关病毒无交叉反应，具有高度的特异性，可用于分型诊断和鉴别诊断。 综合以上三个部分的研究结果，本研究的结论如下： 一、成功制备了一组具有血清型特异性的Ⅱ型登革病毒NS1单抗和四型登革病毒NS1交叉抗原结合位点单抗，为免疫诊断试剂研制、NS1蛋白功能的研究、登革病毒感染的发病机理研究等奠定基础。 二、建立了基于单抗的NS1抗原捕获ELISA，能灵敏的检测到Ⅱ型登革病毒感染急性期血清中的NS1抗原，与进口商品化的同类产品相比，具有更高的检测灵敏度，适用于登革病毒感染的早期诊断； 三、建立了具有血清型特异性的NS1抗原捕获ELISA，可特异的检测Ⅱ型登革病毒NS1抗原，与其它相关病毒均无交叉反应，具有型特异性，可用于登革病毒感染的快速分型诊断或鉴别诊断。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一部分 Ⅱ型登革病毒非结构蛋白NS1特异性单克隆抗体的制备与鉴定

1材料

2方法

3实验结果

4讨论

第二部分 Ⅱ型登革病毒非结构蛋白NS1抗原捕获ELISA的建立

1材料

2实验方法

3结果

4讨论

第三部分 Ⅱ型登革病毒NS1抗原捕获ELISA初步临床应用

1材料

2方法

2结果

4 讨论

全文小结

参考文献

附录

成果

综述登革病毒NS1抗原检测与方法研究进展

致谢

研究生毕业论文统计学审稿证明