合成环氧琥珀酸钙悬浊液的方法和生产L-(+)-酒石酸的方法

摘要

本发明公开了一种合成顺式环氧琥珀酸钙的方法，该方法利用顺丁烯二酸酐、碳酸钙和双氧水，在钨酸钠的催化下反应，然后用氢氧化钙调节pH。本发明还公开了一种生产L-(+)-酒石酸的方法，由顺式环氧琥珀酸钙利用酶的催化作用产生L-(+)-酒石酸钙，分离出固态的L-(+)-酒石酸钙粗产品，然后用硫酸酸解，再分离去除硫酸钙，然后经纯化制得最终产品L-(+)-酒石酸。本发明可取代目前的顺式环氧琥珀酸钠转化工艺，直接生成L-(+)-酒石酸钙，节约了钙盐沉淀操作单元，同时减少了钠离子的排放，降低了原料消耗，具有显著的工业应用价值和环境效益。

说明书

技术领域

本发明属于生物催化制备有机酸领域，具体说是合成环氧琥珀酸钙 悬浊液的方法以及利用该悬浊液生产L-(+)-酒石酸的方法。

背景技术

L-(+)-酒石酸是一种天然有机酸，是一种重要的食品添加剂和化工原 料。传统的酶法转化生产L-(+)-酒石酸一般以顺式环氧琥珀酸钠为催化 底物，在顺式环氧琥珀酸水解酶(ESH)的催化作用下，生成L-(+)-酒石 酸钠，然后再采用钙盐法来提取L-(+)-酒石酸(即，在含有L-(+)-酒石酸 钠的转化液中加入钙中和剂使之生成L-(+)-酒石酸钙，经反复结晶、洗 净后加入硫酸酸解提取L-(+)-酒石酸，并需通过活性炭脱色、离子交换 去除杂离子后才可得到精纯产品)。该方法原料成本较高，且产生大量的 含高浓度钠离子的废水。

发明内容

本发明以顺式环氧琥珀酸钙盐为催化底物，使之在顺式环氧琥珀酸 水解酶的催化作用下直接生成L-(+)-酒石酸钙。为克服传统的顺式环氧 琥珀酸钙批次转化效率低等缺陷，本发明采用连续流加的方式，并在顺 式环氧琥珀酸钙转化过程中加入硫酸钠助溶剂，使得反应体系中的各种 离子处于“顺式环氧琥珀酸钙-硫酸钙-顺式环氧琥珀酸钠-硫酸钠”的动 态平衡状态，进而提高了顺式环氧琥珀酸钙的转化效率及L-(+)-酒石酸 的生产效率。该方法不仅在化学合成步骤减少了碳酸钠、氢氧化钠的使 用，还减少了含钠离子废水的排放，可以大大降低L-(+)-酒石酸的生产 成本以及可能造成的环境污染。

本发明第一方面的目的在于提供一种顺式环氧琥珀酸钙悬浊液的合 成方法，该方法包括以下步骤：

步骤(1)：将顺丁烯二酸酐和碳酸钙在预热后的水中搅拌混匀；

步骤(2)：向步骤(1)得到的混合液中加入钨酸钠催化剂，并流加 双氧水，于加热条件下保温；

步骤(3)：将步骤(2)得到的反应液用氢氧化钙调节pH至碱性， 得到所述顺式环氧琥珀酸钙悬浊液。

本发明第二方面的目的在于提供一种生产L-(+)-酒石酸的方法，该 方法包括以下步骤：

步骤(4)：向加入有硫酸钠助溶剂的反应釜中连续流加通过权利要 求1-4中任一项所述的方法制得的顺式环氧琥珀酸钙悬浊液，同时加入 顺式环氧琥珀酸水解酶催化剂，于37℃下搅拌，产生L-(+)-酒石酸钙悬 浊液；

步骤(5)：从步骤(4)得到的L-(+)-酒石酸钙悬浊液中分离出固态 的L-(+)-酒石酸钙粗产品，然后用硫酸酸解，再分离去除硫酸钙，最后 经纯化步骤制得最终产品L-(+)-酒石酸。

有益效果

本发明直接以顺式环氧琥珀酸钙盐为催化底物来生产L-(+)-酒石酸， 相比于传统的顺式环氧琥珀酸钠盐催化工艺，具有如下特点和优点：

(1)两种催化工艺均以顺丁烯二酸酐为初始原料，但在环氧底物合 成过程中，本发明所采用的工艺无需使用碳酸钠、氢氧化钠。

传统钠盐工艺的反应流程示意图如下：

本发明钙盐工艺的反应流程示意图如下：

(注：原料顺丁烯二酸实际是以酸酐的形式存在)

(2)本发明采取的L-(+)-酒石酸生产方法，由于无需钙盐沉淀步骤， 因此，减少了一个操作单元。

(3)本发明采取的L-(+)-酒石酸生产方法，由于采用连续流加模式， 并引入硫酸钠助溶剂，提高了L-(+)-酒石酸的生产效率。

(4)本发明采取的L-(+)-酒石酸生产方法，由于在底物合成时无需 使用钠盐，且硫酸钠助溶剂可以反复套用，因此降低了原料成本。同时， 其废水中不含有高浓度的钠盐，减少了排放量，降低了生产成本。

表1：本发明所采用的钙盐转化工艺与传统钠盐转化工艺的主要原料 投入/产出(均为理论值，以生产每吨L-(+)-酒石酸计)

综上所述，本发明具有显著的工业应用价值和环境效益。

附图说明

图1示出了在现有技术的实施方式中，利用钠盐转化工艺制备L-(+)- 酒石酸时的主要操作单元。

图2示出了在本发明的一个实施方式中，利用钙盐转化工艺制备 L-(+)-酒石酸时的主要操作单元。

具体实施方式

在本发明优选的实施方式中，步骤(1)中使用顺丁烯二酸酐与碳酸 钙的摩尔比为1:1至1:0.5。当二者的摩尔比为1:1时，在步骤(2)后得 到的反应液的主要成分为顺式环氧琥珀酸钙；当二者的摩尔比为1:0.5 时，在步骤(2)后得到的反应液的主要成分为顺式环氧琥珀酸氢钙；当 二者的摩尔比在1:1至1:0.5之间(不含端值)时，在步骤(2)后得到 的反应液的主要成分为顺式环氧琥珀酸氢钙和顺式环氧琥珀酸钙的混合 物。无论哪种情况，将上述反应液在步骤(3)中用氢氧化钙调节pH至 碱性(例如8.5～9.0)后，都会得到碱性的顺式环氧琥珀酸钙悬浊液。

在一个实施方式中，步骤(1)中使用的预热后的水的温度为52-58℃、 优选55℃。

在本发明优选的实施方式中，相对于1重量份的钨酸钠催化剂，步 骤(1)中使用的顺丁烯二酸酐为400重量份，和/或步骤(2)中使用的 双氧水以H₂O₂分子计为1512.5重量份。优选地，双氧水的质量浓度为 27.5％。

在本发明优选的实施方式中，步骤(2)中双氧水的流加时间为 25-40min、优选30min。基于上述流加时间，可根据反应体系的规模对流 加速度进行具体控制。例如，对于反应体系的体积为5L的实验室规模， 双氧水的流加速度可为2.5-3.5L/h、优选3L/h；对于反应体系的体积为 2000L级别的中试规模，双氧水的流加速度可为800～1000L/h。如果流加 时间过短、流加速度过快，可能会造成反应体系的局部放热过多，使合 成的环氧琥珀酸钙发生酸水解和/或热水解，从而生成外消旋的酒石酸， 即等比例的L-(+)-酒石酸和D-(-)-酒石酸混合物；如果流加时间过长、流 加速度过慢，则会使得整个反应工艺的效率降低。因此，在这一优选的 实施方式中，之所以对步骤(2)中的双氧水流加时间和流加速度进行控 制，是为了保证反应更安全、顺畅、高效地进行。

在本发明优选的实施方式中，步骤(2)中的保温在65～69℃的温度 下进行。在本发明一个优选的实施方式中，步骤(2)中的保温进行的时 间为至少3h、优选至少4.5h。

在本发明优选的实施方式中，加入到所述反应釜中的所述硫酸钠助 溶剂的浓度为1.2M。在本发明一个优选的实施方式中，步骤(4)中所 述顺式环氧琥珀酸钙悬浊液的流加速度为0.5L/h。在本发明一个优选的 实施方式中，步骤(4)在200rpm的搅拌下进行。

通过顺式环氧琥珀酸水解酶的催化作用，将顺式环氧琥珀酸钙转化 为L-(+)-酒石酸钙在本领域中是已知的，因而其中所使用的酶对于本领 域技术人员而言也是已知的，例如在Wangetal.发表的文章Purification andcharacterizationofacis-epoxysuccinicacidhydrolasefromNocardia tartaricansCAS-52,andexpressioninEscherichiacoli(ApplMicrobiol Biotechnol(2013)97:2433–2441)中公开的ESH。在本发明中，“顺式环 氧琥珀酸水解酶催化剂”这一术语既可以表示游离的顺式环氧琥珀酸水 解酶，也可以表示产顺式环氧琥珀酸水解酶的菌体细胞(野生菌或大肠 杆菌工程菌)。可用于本发明的菌体细胞在本领域中也是已知的，例如在 US4,017,362专利中公开的诺卡氏菌、Willaertetal.发表的文章Continuous productionofL-(+)-tartaricacidfromcis-epoxysuccinateusingamembrane recyclereactor(ApplMicrobiolBiotechnol(2006)71:155–163)中公开的红 球菌、以及Wangetal.发表的文章Expressionandproductionofrecombinant cis-epoxysuccinatehydrolaseinEscherichiacoliunderthecontrolof temperature-dependentpromoter(JBiotechnol(2012)162:232-236)中公开的 大肠杆菌工程菌等。特别是在本发明的实施例和对比例中，所使用的是 大肠杆菌工程菌菌体细胞，具体例如通过如下方法制备：将能够对L-ESH 进行编码的基因片段连接至质粒载体上，并导入E.coli细胞，获得重组 工程菌。工程菌的宿主细胞为北京全式金生物技术有限公司以商品名 BL21ChemicallyCompetentCell销售的大肠杆菌感受态细胞，表达质粒 为上海闪晶分子生物科技有限公司以商品名pBV220销售的质粒载体， 编码基因例如GenBank数据库中注册号为JQ267565的DNA片段(具体 为下述SEQIDNO：1)。

SEQIDNO：1

ATGCAACTGAACAATGCGAACGACAACACGCAGTTCCGGGCCC TGCTTTTCGACGTGCAGGGGACTCTGACAGATTTCCGTTCCACACTC ATCGAGCACGGCTTATCGATTCTCGGAGACAGAGTGGATCGAGAAC TCTGGGAGGAATTGGTCGACCAATGGCGCGGCTGCTATCGAGACGA GCTCGATTCCTTGGTCAAACAGGAGAAATGGCGCTCGGTCCGCGCC GTGTACCGAGATTCTCTTATCAATCTTCTCGCAAAATTCTCTGACAGT TTCTGCGCCACCTCGGCCGAAGTGGAATTGCTGACCGATGGTTGGG AACGTCTTCGGTCGTGGCCGGACGTCCCCTCTGGATTGGAACAGCT GCGGTCTAAGTACCTCGTCGCGGCACTGACGAATGCGGACTTTTCTG CCATCGTCAACGTCGGGCGTAGCGCCAAACTGCAATGGGACGCTGT TCTTTCAGCTCAACTCTTTGGAGCCTACAAGCCCCACCGGTCAACAT ATGAGGGAGCCGCGACACTCCTGGGTATCGCTCCGTCAGAGATCCT CATGGTCGCCTCCCATGCATACGATCTCGAAGCGGCGCGGGAAGTG GGAGCCGGCACAGCGTACGTCAGACGGCCACTGGAATACGGACCG ACGGGGCGAACCGAGGACGTTCCCGATGGACGTTTCGATTTCTTGG TCGACAGCATCAGTGAACTGGCTGATCAGCTGGGCTGCCCACGACT CGGTGGAACTGCCGGTATCGATTGA

在一个优选的实施方式中，顺式环氧琥珀酸水解酶催化剂的用量为 160-300酶活力/100mL底物，优选240U酶活力/100mL底物。对于顺式 环氧琥珀酸水解酶催化剂为游离ESH的情况，上述用量即表示ESH本身 的用量。对于顺式环氧琥珀酸水解酶催化剂为产ESH的菌体细胞的情况， 则意味着根据该菌体细胞的产酶能力进行折算，使得所产出的ESH满足 上述用量。

在本发明的一个实施方式中，步骤(5)中的两次分离相互独立地采 用带滤机和/或离心机进行。在本发明的一个实施方式中，步骤(5)中 的纯化步骤是指常规的浓缩、结晶、干燥等步骤。

在本发明优选的实施方式中，硫酸钠助溶剂可以反复套用(即，将 硫酸钠助溶剂从所述步骤(5)的废液中回收，并重新用于所述步骤(4))， 从而减少了排放量。

实施例

接下来，通过实施例对本发明进行进一步详细地说明，但本发明不 仅限于这些实施例。

实施例1

顺式环氧琥珀酸钙悬浊液的合成

将2.5L纯净水预热至55℃，然后加入0.8kg顺丁烯二酸酐，用机械 搅拌器搅拌，并缓慢加入0.8kg碳酸钙，待其充分混合后，加入2g钨酸 钠，同时流加双氧水(3L/h，共1.5L，含量为27.5％)，然后，将温度升 至65～69℃之间，保温反应约4.5h后结束，得到约4.5L顺式环氧琥珀酸 钙悬浊液。

硫酸钠助溶剂促进顺式环氧琥珀酸钙的连续催化水解

首先在转化反应釜中加入2L1.2M的硫酸钠助溶剂，然后将上一步 骤中所制得的顺式环氧琥珀酸钙悬浊液以0.5L/h连续流加入反应釜中， 同时加入一定量的产顺式环氧琥珀酸水解酶的大肠杆菌工程菌(按照其 所能产生的顺式环氧琥珀酸水解酶折算，加入量为240U酶活力/100mL 底物)，控制反应温度为37℃，搅拌转速为200rpm，利用酶的催化作用 产生L-(+)-酒石酸钙悬浊液。

L-(+)-酒石酸钙形成L-(+)-酒石酸

将上一步骤中所制得的L-(+)-酒石酸钙悬浊液送入带滤机，分离出 固态的L-(+)-酒石酸钙粗产品，然后用硫酸酸解，再利用带滤机分离去 除硫酸钙，然后经浓缩、结晶、干燥等步骤，得到最终产品L-(+)-酒石 酸。总体工艺流程如图2所示。

整个反应过程中L-(+)-酒石酸的平均产率为18.25g/(L·h)，ESH的催 化效率为7.84×10^-3g/(U·h)。

对比例1：反应时间对顺式环氧琥珀酸钙合成的影响

按照与实施例1相同的物料比和反应温度合成顺式环氧琥珀酸钙悬 浊液，考察不同反应时间对顺式环氧琥珀酸钙合成的影响。结果发现， 当反应时间为3h时，约有30％的顺丁烯二酸酐残留，反应进行不彻底； 当反应时间大于4.5h时，反应进行的很彻底，顺丁烯二酸酐的反应率达 到98.5％以上。

对比例2：反应温度对顺式环氧琥珀酸钙合成的影响

按照与实施例1相同的物料比和反应时间合成顺式环氧琥珀酸钙悬 浊液，考察不同反应温度对顺式环氧琥珀酸钙合成的影响。结果发现， 当温度低于65℃时，反应进行的不彻底，顺丁烯二酸酐的残留达到20％； 当温度高于69℃时，反应可以完成进行，但由于温度过高，会导致产物 顺式环氧琥珀酸钙的水解，形成外消旋的酒石酸钙，即等量的D-(-)-酒石 酸钙和L-(+)-酒石酸钙，从而影响最终产品的纯度和质量。由顺丁烯二 酸酐的反应率和产物顺式环氧琥珀酸钙的水解角度来看，顺式环氧琥珀 酸钙的最适反应温度为65-69℃。

对比例3：顺式环氧琥珀酸钙的单一批次转化

按照与实施例1相同的方式进行顺式环氧琥珀酸钙悬浊液的合成。

将上一步骤中所制得的顺式环氧琥珀酸钙悬浊液加入反应釜中，同 时加入一定量的产顺式环氧琥珀酸水解酶的大肠杆菌工程菌(按照其所 能产生的顺式环氧琥珀酸水解酶折算，加入量为240U酶活力/100mL底 物)，控制反应温度为37℃，搅拌转速为200rpm，利用酶的催化作用产 生L-(+)-酒石酸钙悬浊液。上述过程以单一批次进行。

按照与实施例1相同的方式，由上一步骤中所制得的L-(+)-酒石酸 钙悬浊液得到最终产品L-(+)-酒石酸。

整个反应过程中L-(+)-酒石酸的平均产率为6.25g/(L·h)，ESH的催 化效率为1.26×10^-3g/(U·h)。

对比例4：不使用硫酸钠助溶剂情况下的连续催化水解

按照与实施例1相同的方式进行顺式环氧琥珀酸钙悬浊液的合成。

将上一步骤中所制得的顺式环氧琥珀酸钙悬浊液连续流加入反应釜 中(50L/h)，同时加入一定量的产顺式环氧琥珀酸水解酶的大肠杆菌工 程菌(按照其所能产生的顺式环氧琥珀酸水解酶折算，加入量为240U酶 活力/100mL底物)，控制反应温度为37℃，搅拌转速为200rpm，利用酶 的催化作用产生L-(+)-酒石酸钙悬浊液。

按照与实施例1相同的方式，由上一步骤中所制得的L-(+)-酒石酸 钙悬浊液得到最终产品L-(+)-酒石酸。

整个反应过程中L-(+)-酒石酸的平均产率为11.25g/(L·h)，ESH的催 化效率为4.69×10^-3g/(U·h)。

由L-(+)-酒石酸的平均产率和ESH的催化效率可见，相比于顺式环 氧琥珀酸钙的单批次转化效率和无助溶剂时的连续转化效率，本发明所 述方法的转化效率明显更高。