酒石酸诺卡氏菌发酵产顺式环氧琥珀酸水解酶的研究

摘要

目前，工业上生产L(+)-酒石酸主要采用生物合成法，即利用顺式环氧琥珀酸水解酶（ESH）作为催化剂，将底物顺式环氧琥珀酸（ES）转化生成L(+)-酒石酸。本论文从应用的角度出发，对酒石酸诺卡氏菌高产ESH 菌株进行了筛选，并研究了其发酵特性，优化了发酵培养基，建立了一种快速测定ESH 酶活的新方法。本论文主要进行了以下几方面研究：
　　 1. 高产菌株的筛选：
　　 将工厂提供的菌株通过分离纯化获得50个菌株，经生长和产酶能力测定从中筛选出15 支活性较高的菌株，再通过多次传代复筛后，得到了两株活性较高且产酶稳定的菌株，其总酶活较出发菌株提高了21-30％。
　　 2. 酒石酸诺卡氏菌发酵特性研究研究考察了酒石酸诺卡氏菌发酵过程中碳源、氮源、pH 等主要控制参数和细胞量、总酶活、比酶活的变化特性。结果表明，当发酵培养基中同时含有葡萄糖和丙二醇时，葡萄糖作为优先碳源首先被利用；随着葡萄糖代谢副产物有机酸的积累导致pH 下降，当葡萄糖耗尽后，发酵液pH 开始上升；菌体的诱导产酶期位于对数生长期，此时发酵液中有L(+)-酒石酸生成，但菌体并不利用产生的酒石酸。在这一条件下，整个发酵周期约为40 h，菌体浓度可达30 g/L，酶活力可达515 U/g。
　　 3. 快速测定ESH 酶活方法的建立以酒石酸诺卡氏菌细胞超声破碎液为材料，通过对转化生成L（+）-酒石酸过程中的底物浓度，酶浓度，转化时间的正交实验研究，建立了一种快速检测细胞ESH 酶活的新方法。即1 g 湿细胞，30 mL 0.2 mol/L的ES，37℃保温转化10 min，通过HPLC测定酒石酸含量来计算酶活。此方法具有快速、准确、细胞用量少的特点。
　　 4. 酒石酸诺卡氏菌发酵培养基的优化通过单因子实验，考察了碳源种类与浓度，ES 浓度与添加时间，产物酒石酸对发酵产ESH的影响。研究表明，菌体生长的最佳碳源为葡萄糖，产ESH的最佳碳源为蔗糖，两者的最适浓度均为5 g/L；当ES 浓度小于40 g/L 时，ES 对菌体生长没有抑制作用，ES的最适浓度为20 g/L；在菌体生长到对数期添加ES 可以提高菌体的产酶量。实验还发现，酒石酸可延缓菌体利用ES的速率，从而延长了ESH的诱导产生期。综合以上条件，将培养基优化后，菌体总酶活较优化前提高了22.8％。