筛选三阴性乳腺癌特异性血清代谢标志物的方法

摘要

本发明公开了一种筛选三阴性乳腺癌特异性血清代谢标志物的方法，采用LC/MS仪器分别对实验组A和对照组B的血清样本进行代谢组学分析，对所有样本中物质的峰的响应强度数据进行模型判别分析，分别对实验组A和对照组B进行PCA分析，并在此基础上进行PLS?DA、OPLS?DA的模型构建，从而获得差异性表达代谢物，筛选并鉴定与乳腺癌发生、转移相关的生物标志物：溶血性卵磷脂、鞘磷脂和小分子氨基酸。其结果对于阐明三阴性乳腺癌患者血清特征性代谢物含量变化规律以及代谢物在肿瘤的发生发展过程中的作用具有重要的意义；同时应用此筛选方法可以获得有效的乳腺癌早期诊断靶点，并为建立特异性癌症诊断模型提供数据基础。

说明书

技术领域

本发明涉及一种代谢组学对肿瘤引起机体代谢变化做出整体评价并筛选出有价 值的生物标志物的方法，尤其涉及一种筛选三阴性乳腺癌特异性血清代谢标志物的方法。

背景技术

代谢组学(metabolomics)是近年来发展起来的一项技术，用于评估生物样品在受 到环境或其他因素刺激下，其中的各种小分子化合物的变化情况。肿瘤的早发现、早治疗及 个性化诊疗方案是肿瘤治疗的发展方向，新兴的代谢组学开辟了辅助肿瘤早期诊断、疗效 评价及预后判断的新思路。肿瘤的发生、发展伴随着机体代谢产物的变化，代谢组学能对肿 瘤引起的机体代谢变化做出整体评价，筛选出有价值的生物标志物，用于肿瘤的早期诊治。

但现有技术中，并没有一种筛选三阴性乳腺癌引起机体代谢变化的生物标志物的 方法。

发明内容

针对现有技术中存在的上述不足，本发明提供了一种筛选三阴性乳腺癌特异性血 清代谢标志物的方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用了如下技术方案：

筛选三阴性乳腺癌特异性血清代谢标志物的方法，该方法包括如下步骤：

(1)选取多个三阴性乳腺癌女性患者血清作为实验组A；选取与实验组A数量相等 的正常女性血清作为对照组B；

(2)室温解冻实验组A和对照组B的血清后，分别精准吸取100μL血清样本在不同的 1.5mLEP管中，采用甲醇沉淀蛋白，其比例为样品：甲醇＝1:4，涡旋30s，进行4℃，12000rpm 离心15min，吸取200μL上清液，转入的进样小瓶中待检测；

(3)将不同血清样本的小瓶分别放置在LC-Q/TOF-MS实验仪器的分析平台上进行 色谱分离和质谱检测；

色谱分离条件为：柱温为40℃，流速0.35mL/min；流动相组成：①实验组A为：水+ 0.1％甲酸；②对照组B为：乙腈+0.1％甲酸；进样量为4μL，自动进样器温度4℃；

质谱条件：①采用正离子模式进行检测条件：以氮气作为雾化、锥孔气；飞行管检 测模式V型，毛细管电压4kV、锥孔电压35kV、离子源温度100℃；脱溶剂气温度350℃、反向锥 孔气流50L/h、脱溶剂气600L/h、萃取锥孔4V；②负离子模式条件：毛细管电压3.5kV、锥孔电 压50kV、离子源温度100℃；脱溶剂气温度300℃、反向锥孔气流50L/h、脱溶剂气700L/h、萃 取锥孔4V；离子扫描时间0.03s、扫描时间间隔0.02s、数据采集范围：50-1000m/z；

(4)通过MassProfiler软件对LC-Q/TOF-MS实验仪器获得的LC/MS数据进行预处 理，并在EXCEL2010软件中进行后期编辑，将最终结果组织为二维数据矩阵，包括变量、观 察量和峰强；然后将所有数据归一化到总信号积分；

(5)将编辑后的数据矩阵导入SIMCA-P软件进行主成分分析，获得正模式下的主成 分和负模式下的主成分累积R²X值和Q²值，R²X值为模型的解释率，Q²值为模型的预测率；

(6)采用监督性的偏最小二乘方判别分析PLS-DA对两组样本进行分析，其模型质 量参数为：正模式下的主成分和负模式下的主成分累积R²X值、R²Y值和Q²值；R²X值为模型的 解释率，R²Y值为模型的解释率，Q²值为模型的预测率；

(7)进一步采用监督式方法OPLS-DA进行建模分析，获得正模式下的主成分和负模 式下的主成分累积R²X值、R²Y值和Q²值，R²X值为模型的解释率，R²Y值为模型的解释率，Q²值 为模型的预测率；

(8)采用OPLS-DA模型的VIP值，并结合t-test的p值来寻找差异性表达代谢物；差 异性代谢物的定性方法为：搜索在线数据库，比较质谱的质荷比m/z或者精确分子质量 mass；筛选并鉴定与三阴性乳腺癌发生、转移相关的生物标志物为：溶血性卵磷脂、鞘磷脂 和小分子氨基酸。

作为本发明的一种优选方案，将编辑后的数据矩阵导入SIMCA-P软件进行主成分 分析前，对数据组进行归一化处理。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1、在利用高通量、高灵敏度、快速的LC-Q/TOF-MS技术，对三阴性乳腺癌患者以及 正常人的血清进行代谢组学分析并比对，从而寻找乳腺癌早期诊断的特异性的血清代谢标 志物。其结果对于阐明三阴性乳腺癌患者血清特征性代谢物含量变化规律以及代谢物在肿 瘤的发生发展过程中的作用具有重要的意义。

2、应用此筛选方法可以获得有效的乳腺癌早期诊断靶点，并为建立特异性癌症诊 断模型提供数据基础。

附图说明

图1为实验组A单个样本离子流色谱图(A:pos,B:neg)；

图2为A-B及QC的PCA得分图(pos)；

图3为A-B及QC的PCA得分图(neg)；

图4为A-B两组的PLS-DA得分图(pos)；

图5为图4对应的A-B两组的PLS-DA排序验证图(pos)；

图6为A-B两组的PLS-DA得分图(neg)；

图7为图6对应的A-B两组的PLS-DA排序验证图(neg)；

图8为A-B两组的OPLS-DA得分图(pos)；

图9为A-B两组的OPLS-DA得分图(neg)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细地描述。

筛选三阴性乳腺癌特异性血清代谢标志物的方法，该方法包括如下步骤：

(1)选取多个三阴性乳腺癌女性患者血清作为实验组A；选取与实验组A数量相等 的正常女性血清作为对照组B。本实施例中，分析了31例三阴性乳腺癌女性患者血清，并以 31例正常女性血清为对照。

(2)室温解冻实验组A和对照组B的血清后，分别精准吸取100μL血清样本在不同的 1.5mLEP管中，采用甲醇沉淀蛋白，其比例为样品：甲醇＝1:4，涡旋30s，进行4℃，12000rpm 离心15min，吸取200μL上清液，转入进样小瓶中待检测。甲醇为HPLC级甲醇，购自Merck公司 (Dannstadt，Gennany)。

(3)将不同血清样本的小瓶分别放置在LC-Q/TOF-MS(Agilent,1290InfinityLC, 6530UHDandAccurate-MassQ-TOF/MS)实验仪器的分析平台上进行色谱分离和质谱检 测；分离色谱柱为C₁₈色谱柱(Agilent,100mm×2.1mm，1.8μm)。

色谱分离条件为：柱温为40℃，流速0.35mL/min；流动相组成：①实验组A为：水+ 0.1％甲酸；②对照组B为：乙腈+0.1％甲酸；梯度洗脱程序见表1。进样量为4μL，自动进样器 温度4℃。甲酸购自CNW公司，水为屈臣氏蒸馏水。

表1.Thegradientofmobilephase

质谱条件：①采用正离子模式进行检测条件：以氮气作为雾化、锥孔气；飞行管检 测模式V型。正离子模式条件为：毛细管电压(capillaryvoltage)4kV、锥孔电压(Sampling cone)35kV、离子源温度(Sourcetemperature)100℃；脱溶剂气温度(Desolvation temperature)350℃、反向锥孔气流(Conegasflow)50L/h、脱溶剂气(Desolvationgas flow)600L/h、萃取锥孔(Extractioncone)4V。②负离子模式条件：毛细管电压(capillary voltage)3.5kV、锥孔电压(Samplingcone)50kV、离子源温度(Sourcetemperature)100 ℃；脱溶剂气温度(Desolvationtemperature)300℃、反向锥孔气流(Conegasflow)50L/ h、脱溶剂气(Desolvationgasflow)700L/h、萃取锥孔(Extractioncone)4V；离子扫描时 间(Scantime)0.03s、扫描时间间隔(Interscantime)0.02s、数据采集范围：50-1000m/ z。为确保质量的准确性和重复性，应用亮氨酸-脑啡肽作为锁定质量(Lockmass)，正离子 模式下产生[M+H]+离子556.2771Da。负离子模式下产生[M-H]-离子554.2615Da。通过优化 条件，在正离子模式及负离子模式下，分别得到三阴性乳腺癌血清的色谱图，如图1所示。

(4)通过MassProfiler软件(Agilent公司)对LC-Q/TOF-MS实验仪器获得的LC/MS 数据进行预处理，并在EXCEL2010软件中进行后期编辑，将最终结果组织为二维数据矩阵， 包括变量(rt_mz，即保留时间_质荷比)、观察量(样本)和峰强；样本在正模式下共得到1856 个features，负模式下获得1004个features。然后将所有数据归一化到总信号积分。

(5)将编辑后的数据矩阵导入SIMCA-P软件(版本13.0)进行主成分分析，获得正模 式下的主成分和负模式下的主成分累积R²X值和Q²值，R²X值为模型的解释率，Q²值为模型的 预测率。

对样本进行主成分分析能从总体上反映两组样本之间的总体代谢差异和组内样 本之间的变异度大小。在SMICA-P软件正式分析前，对数据组进行归一化处理，以获得更加 直观且可靠的结果。为了判别两组之间是否具有差异，采用PCA建模方法对样本进行分析， 本分析在正模式下共获得9个主成分，累积R²X＝0.379，Q²＝0.0839；负模式下共获得9个主 成分，累积R²X＝0.378，Q²＝0.0406。PCA得分图(Scoresplot)如图2和图3所示。对于PCA这 种非监督性模型分析来说，判别模型质量好坏的主要参数为R²X，该值代表模型的解释率。 一般来说这该值大于0.4就表示该模型可靠。PCA分析是一种非监督性的模型分析方法，相 对于监督性的模型分析方法如PLS-DA分析来说，PCA更可靠地反映不同组之间的最真实差 异。

(6)为了获得导致这种显著差异的代谢物信息，进一步采用监督性的多维统计方 法即偏最小二乘方判别分析(PLS-DA)对两组样本进行分析，其模型质量参数为：正模式下 的主成分和负模式下的主成分累积R²X值、R²Y值和Q²值；R²X值为模型的解释率，R²Y值为模型 的解释率，Q²值为模型的预测率。

本实施例中，在正模式下，其模型质量参数为：具有3个主成分，R²X＝0.209，R²Y＝ 0.99，Q²＝0.93；负模式下4个主成分，R²X＝0.208，R²Y＝0.997，Q²＝0.894。判别模型质量好 坏的主要参数为R²Y(该值代表模型的解释率)及Q²值(该值为模型的预测率)，如图4、图5、图 6和图7。一般来说这该值大于0.4就表示该模型可靠。另外还会对模型进行排序验证，检验 模型是否“过拟合”，从模型的参数来看，模型对于解释两组之间差异及寻找差异物质是可 靠的，且排序验证图来看模型不存在“过拟合”现象。

(7)进一步采用有监督式方法OPLS-DA进行建模分析，获得正模式下的主成分和负 模式下的主成分累积R²X值、R²Y值和Q²值，R²X值为模型的解释率，R²Y值为模型的解释率，Q²值为模型的预测率。

本实施例中，在正模式下得到2个主成分和1个正交成分，R²X＝0.209，R²Y＝0.99， Q²＝0.883；负模式下得到2个主成分和1个正交成分，R²X＝0.183，R²Y＝0.984，Q²＝0.833， 模型的参数R²Y表示模型的解释率，Q²表示模型的预测率，一般来说此参数大于0.4即表明此 模型可靠。其得分如图8和图9所示。

(8)采用OPLS-DA模型的VIP(VariableImportanceintheProjection)值(阈值 >1)，并结合t-test的p值(p＜0.05)来寻找差异性表达代谢物。差异性代谢物的定性方法 为：搜索在线数据库(Metlin)，比较质谱的质荷比m/z或者精确分子质量mass。差异性代谢 物数据如表2和表3所示。筛选并鉴定与三阴性乳腺癌发生、转移相关的生物标志物为：溶血 性卵磷脂、鞘磷脂和小分子氨基酸。

表2正模式下A-B两组的差异性代谢物

表2负模式下A-B两组的差异性代谢物

Foldchange(A/B)为A与B组均值之比的对数值(以2为底)，正号表示A组相对于B 组上升，负号表示下降。

本发明采用LC/MS仪器分别对62例人血清样本进行代谢组学分析。对所有样本中 物质的峰的响应强度数据进行模型判别分析，分别对实验A-对照B进行PCA分析，并在此基 础上进行PLS-DA、OPLS-DA的模型构建，从而获得差异性表达代谢物。筛选并鉴定与乳腺癌 发生、转移相关的生物标志物。其中占大多数的溶血性卵磷脂和小部分鞘磷脂被证实在肿 瘤发生及发展时发生紊乱，以及一些小分子氨基酸的代谢发生改变，为进一步寻找三阴性 乳腺癌肿瘤标志物提供依据，对探索三阴性乳腺癌的发生及转移机制以及、治疗措施的选 择指明方向。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较 佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技 术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本 发明的权利要求范围当中。