氨基酸修饰的杂多酸盐化合物及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了氨基酸修饰的杂多酸盐化合物，它的通式为Am[B3XMo6O21] · nH2O，它是将Na2MoO4·H2O，Se、As、Sb、或Bi的氧化物，甘氨酸、丙氨酸、组氨酸、赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或精氨酸，KCl溶解于H2O中，置于磁力搅拌器之上混合搅拌，用HCl将溶液pH调节至3.4?3.6，搅拌加热回流0.5?2h；冷却后，过滤，静置1～2d，收集晶体；经MTT法测定，HL?60细胞的IC50值为0.127μM，U937细胞的IC50值为2.731μM，HUVECs细胞的IC50 为889.18μM。抗白血病活性高，毒性较低，价格低廉。

说明书

技术领域

本发明属于化学药物领域，具体涉及氨基酸修饰的杂多酸盐化合物及其制备方法 和应用。

背景技术

目前，白血病是我国致死率第六位的高发性恶性肿瘤。其中，急性白血病是一组造 血干细胞、祖细胞来源的恶性克隆性血液系统疾病，其特点是骨髓和外周血中细胞增殖失 控。急性白血病的治疗最常用的方法有放疗、化疗、免疫治疗、骨髓移植等方法。其中，化疗 药物维甲酸和三氧化二砷在治疗急性早幼粒细胞白血病具有显著作用，但仍然存在副作用 及耐药等问题，所以寻找新型的抗急性白血病药物是研究的热点。

多金属氧酸盐（polyoxometalates，POMs）是由前过渡金属离子特别是钒，钼，钨元 素与氧通过共价键形成的金属-氧簇类化合物。多金属氧酸盐性质优异，种类众多，在催化、 光化学、磁化学、功能材料、分析化学等领域都有广泛的应用。近年来，杂多化合物的药物化 学研究取得了重要进展，其药理、生理活性被予以确认，在抗艾滋病毒、抗肿瘤方面的研究 异常活跃。1971年法国科学家发现多酸[SiW₁₂O₄₀]^4-具有抑制鼠科肉瘤病毒在胚胎鼠纤维原 细胞中的转移活动后，相继发现HPA23，PM8等多酸能够抑制鼠的白血病、肉瘤病毒、鼠乳腺 癌细胞，肉瘤和腺癌，并对PM-8的抗肿瘤作用机制进行了较为深入的探讨。目前，多酸化合 物已经进入了分子设计阶段，通过在分子内部或外部引入一些有机基团，生物小分子，可以 在分子水平上调节多酸的性质，同时扩展或改善其性能，使其具有更为广阔的应用范围。在 抗白血病方面，王晓红报道了K₆H₂[CoW₁₁TiO₄₀]·12H₂O(CoW₁₁Ti)¹³和淀粉结合而成的纳米粒 子对白血病细胞株HL-60具有一定的活性IC₅₀为46.7μg/mL。刘巨涛报道了杂多酸环戊二烯 钒衍生物[Bu₄N]₄[(CpV)PW₁₁O₃₀]对HL-60的抗肿瘤活性研究，其浓度为51.10μg/mL时，对HL- 60的抑制率为42.21%。BisongZhang报道了Na₁₂H[Fe(HPW₇O₂₈)₂]·44H₂O对K562细胞的IC₅₀值约为115μM。效果均不理想。

发明内容

本发明的目的是为了解决杂多化合物抗白血病活性低的问题，而提供一种活性 高，毒性较低，价格低廉的杂多酸盐化合物，氨基酸修饰的杂多酸盐化合物。

氨基酸修饰的杂多酸盐化合物，它是由以下通式构成：

A_m[B₃XMo₆O₂₁]·nH₂O，其中：

A为碱金属离子Na、K或NH₄⁺；

B为质子化氨基酸，分别为甘氨酸、丙氨酸、组氨酸、赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨 酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或精氨酸；

X为Se、As、Sb、或Bi；

m=2~3，n=0~20；

所述的氨基酸修饰的杂多酸盐化合物的分子式为:K₂Na[AsMo₆O₂₁(O₂CCH₂NH₃)₃]· 6H₂O。

本发明另一个目的是提供氨基酸修饰的杂多酸盐化合物的制备方法，它包括：将 Na₂MoO₄·H₂O，Se、As、Sb、或Bi的氧化物，甘氨酸、丙氨酸、组氨酸、赖氨酸、色氨酸、苯丙氨 酸、甲硫氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或精氨酸，KCl溶解于H₂O中，置于磁力搅拌器之上 混合搅拌，用HCl将溶液pH调节至3.4-3.6，搅拌加热回流0.5-2h；静置溶液直至完全冷却 后，过滤，静置1～2d，收集晶体；

所述的氧化物为As₂O₃，所述的氨基酸为甘氨酸，调整pH调节至3.5。

本发明的又一个目的是氨基酸修饰的杂多酸盐化合物在制备治疗白血病药物方 面的应用。

本发明提供了氨基酸修饰的杂多酸盐化合物，它的通式为A_m[B₃XMo₆O₂₁]·nH₂O， 它是将Na₂MoO₄·H₂O，Se、As、Sb、或Bi的氧化物，甘氨酸、丙氨酸、组氨酸、赖氨酸、色氨酸、苯 丙氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或精氨酸，KCl溶解于H₂O中，置于磁力搅拌器 之上混合搅拌，用HCl将溶液pH调节至3.4-3.6，搅拌加热回流0.5-2h；冷却后，过滤，静置1 ～2d，收集晶体；经MTT法测定，HL-60细胞的IC₅₀值为0.127μM，U937细胞的IC₅₀值为2.731μ M，HUVECs细胞的IC₅₀为889.18μM。抗白血病活性高，毒性较低，价格低廉。

附图说明

图1化合物（AsK₂NaMo₆O₃₃C₆H₂₇N₃）的紫外光谱图；

图2化合物（AsK₂NaMo₆O₃₃C₆H₂₇N₃）的X射线衍射图；

图3不同浓度的受试物作用不同时间对HL-60细胞系的影响；

图4不同浓度的受试物作用不同时间对U937细胞系的影响；

图524h培养后不同浓度的受试物对HUVEC细胞的影响；

图6HL-60细胞系经24h的培养，每个细胞周期细胞相对数量；

图72.5μM受试物对HL-60细胞系细胞周期的阻滞影响；

图85μM受试物对HL-60细胞系细胞周期的阻滞影响；

图910μM受试物对HL-60细胞系细胞周期的阻滞影响；

图10G₁,SandG₂期细胞相对数量的统计结果。三组独立实验的结果等于mean± SD。S期与对照组*P<0.05；G₂期与对照组**P<0.05；G₁期与对照组***P<0.05；

图11添加了5μM受试物培养24h后，经Hoechst33342染色的细胞形态图：HL-60(a); U937(b)；

箭头指示凋亡的细胞(60×)；

图12添加不同浓度受试物培养后，经Hoechst33342/PI染色的HL-60细胞形态图(10 ×)；

图13添加不同浓度受试物培养后，经Hoechst33342/PI染色的U937细胞形态图(10 ×)。

实施例1K₂Na[AsMo₆O₂₁(O₂CCH₂NH₃)₃]·6H₂O的合成

将Na₂MoO₄·H₂O(6.0mmol)，As₂O₃(1.1mmol)，甘氨酸(6.0mmol)，KCl(6.0mmol)溶解于 H₂O中，置于磁力搅拌器之上混合搅拌，用HCl将溶液pH调节至3.50，搅拌加热回流1h。静置 溶液直至完全冷却后，过滤装入100ml小烧杯中，静置1～2d，生成黄色晶体，产率：89%。

实施例2K₂Na[AsMo₆O₂₁(O₂CCH₂NH₃)₃]·6H₂O的结构鉴定

（1）化合物（AsK₂NaMo₆O₃₃C₆H₂₇N₃）的红外光谱检测

采用AlphaCentauriFT/IR红外光谱仪，用KBr压片，在400-4000cm^-1的范围内测定化 合物的IR光谱。IR(KBr):3536,3157,2708,2639,1611,1496,1462,1416,1332, 1115,1052,905,778,652,556,425cm^-1_。

（2）化合物（AsK₂NaMo₆O₃₃C₆H₂₇N₃）的紫外光谱检测

将化合物溶解在水中，利用UV-1800型紫外可见吸收光谱仪于波长190~400nm条件下， 测定化合物的吸收峰。紫外光谱图见图1，UV：207nm、226nm。

（3）化合物（AsK₂NaMo₆O₃₃C₆H₂₇N₃）的元素分析

采用Perkin-Elmer2400CHN元素分析仪对化合物（AsK₂NaMo₆O₃₃C₆H₂₇N₃）中C,H和N 进行元素分析；采用ICP等离子体色谱分析仪(Leemaninductivelycoupledplasma( ICP)spectrometer)对化合物（AsK₂NaMo₆O₃₃C₆H₂₇N₃）的金属元素进行分析。理论值：Mo, 40.51;As,5.27;K,5.50;C,5.07;N,2.96;H,1.92(%)；实验值：Mo,40.39;As, 5.62;K,5.78;C,5.26;N,2.73;H,1.99(%)。

（4）化合物（AsK₂NaMo₆O₃₃C₆H₂₇N₃）的X射线衍射

采用日本Rigaku公司的型号为aRigakuD/max-rA的X射线衍射仪Mo-Kα(l=0.71073?) 扫描范围为10-80^o，温度为293K，测定结果如图2所示。

实施例3MTT法测定受试物的抗肿瘤活性和细胞毒性

（1）主要实验材料

细胞株：HL60、U937和HUVEC细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

（2）受试物的抗肿瘤活性测定

将HL-60、U937细胞培养至对数生长期，然后以1.0×10⁴cells/mL的密度接种在96孔 板上，加入不同浓度梯度的受试物（1.25、2.5、5、10、20μM），对照孔加入不含药物的培养基， 设复孔。在阴性对照组给于相同体积的培养液。在体积分数5%CO2、37℃培养箱中，培养24、 48和72h后，分别加入MTT在CO₂培养箱中培养4h后，每孔加入100μL三联溶解液（10% SDS、5%异丙醇,12mmol/LHCl）孵化过夜后，在490nm波长下用酶标仪测定每孔OD值。根据 以下公式计算受试化合物对HL-60，U937细胞的抑制率：

用寇氏法计算细胞的半数抑制浓度（IC₅₀）。

实验结果表明HL-60细胞系上随着受试物的浓度升高对细胞的抑制作用增强，成 剂量效应关系，但从时效上看，48h时药物作用效果最好。如图3所示，经计算在48h时受试物 的IC₅₀值为0.127μM。实验结果表明U937细胞系上随着受试物的浓度升高和时间的增加，药 物对细胞的抑制作用增强，表现出剂量效应关系和时间效应关系，且受试物在72h时抑制作 用最好。如图4所示，经计算在72h时受试物的IC₅₀值为2.731μM。

（3）受试物对正常细胞HUVECs细胞的毒性检测

将取处于对数生长期的细胞HUVECs，细胞以1.0×10⁴cells/mL的密度接种在96孔板 上，置37℃，5%CO₂孵箱，培养24h。弃掉上清，加入不同浓度的受试物（62.5、125、250、500、 1000和2000μM），对照孔加入不含药物的培养基200μL/孔，设复孔。在阴性对照组给于相 同体积的培养液。将细胞培养24h后，加入MTT在CO₂培养箱中培养4h，每孔加入150μL二甲 基亚砜，震荡溶解10min。在490nm波长下用酶标仪测定每孔OD值并计算细胞的半数抑制 浓度IC₅₀为889.18μM。如图5所示。

实施例4细胞周期的测定

将HL-60细胞以1×10⁶接种于12孔板，加入不同浓度的受试物（2.5、5、10μM）作用24h后 用冷PBS洗三遍，1500rpm，5min离心，弃上清，加入300μL的PBS重悬细胞，用200目筛网过滤 到流式管中。分别加入200μL0.1%的TritonX-100，100μLRNaseA200μL浓度为50μg/ml的 PI染色液，室温避光孵育15min。用流式细胞仪测定细胞周期。每个样品检测10000个细胞进 行分析。如图6-10所示，经统计学分析，G₁期比对照组增加了，且浓度为5、10μM时与对照组 相比，差别有统计学意义。S期比对照组减小了，而且差别有统计学意义，表明受试物将细胞 周期阻滞在G₁期，且S期减少（P＜0.05）

实施例5Hoechst33342/PI荧光染色法

（1）Hoechst33342染色法测定细胞凋亡

将HL-60、U937细胞培养至对数期，接种于激光共聚焦培养皿上。设置对照组，实验组。5 μM的受试物作用24h后，细胞用甲醇/乙酸固定30分钟，PBS洗涤三次（pH7.4），在室温条件 下用Hoechst33342溶液染色在黑暗中染色10min。使用激光共聚焦显微镜观察细胞形态 （OLYMPUSFV1000，日本）由图11可见，对照组细胞生长良好，细胞膜较完整，5μM的受试物 作用24h后，细胞变圆，悬浮，细胞间的连接变得松散，并且细胞增殖减慢，在细胞核内可见 的凋亡小体形成，对照组没有凋亡小体形成。

（2）Hoechst33342/PI双染法检测细胞凋亡

采用Hoechst33342/PI双染法检测，经不同浓度梯度受试物诱导的白血病细胞株HL-60 和U937凋亡情况。使用激光共聚焦显微镜观察细胞形态（OLYMPUSFV1000，日本）其中，正常 细胞呈淡蓝色，细胞凋亡细胞呈亮蓝色和淡红色，死亡细胞呈亮红色。激光扫描共聚焦显微 镜下观察，如图12,13所示，当受试物的剂量增加，细胞皱缩和死亡和坏死细胞数逐渐增多， 并在10μM时达到高峰。这些结果表明受试物可以诱导细胞凋亡并表现出剂-效关系。

实施例6

将Na₂MoO₄·H₂O，Se、As、Sb、或Bi的氧化物，甘氨酸、丙氨酸、组氨酸、赖氨酸、色氨酸、苯 丙氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或精氨酸，KCl溶解于H₂O中，置于磁力搅拌器 之上混合搅拌，用HCl将溶液pH调节至3.4-3.6，搅拌加热回流0.5-2h；静置溶液直至完全 冷却后，过滤，静置1～2d，收集晶体；制备的氨基酸修饰的杂多酸盐化合物，对白血病细胞 HL60、U937和HUVEC细胞，用实施例2-5方法进行实验，其结果与实施例1制备的K₂Na [AsMo₆O₂₁(O₂CCH₂NH₃)₃]·6H₂O相近。