一种与水稻江南晚穗瘟抗性基因紧密连锁的分子标记及其应用

摘要

本发明属于作物分子遗传育种学领域，公开了一种与水稻江南晚穗瘟抗性基因紧密连锁的分子标记及其应用，包括如下步骤：(1)取水稻样品，提取水稻样品基因组DNA；(2)利用RM27273和BS33中的任意一对分子标记的引物对，对水稻样品基因组DNA进行PCR扩增，PCR扩增产物进行电泳检测，如果扩增出对应大小的分子标记DNA片段，标志着Pb?jn1基因的存在。通过本发明提供的水稻穗瘟抗性基因Pb?jn1的分子标记可以检测水稻江南晚及其杂交、回交和复交后代是否含有该基因，可预测其对稻瘟病的抗性水平，大大提高水稻抗穗瘟材料的选择效率，加快抗病育种进程。

说明书

技术领域

本发明属于农作物分子遗传育种学领域，涉及一种与水稻江南晚穗瘟抗性基因紧密连锁 的分子标记及其应用。

背景技术

水稻是我国最重要的粮食作物之一，对保障我国粮食安全和国民经济增长具有重要意 义。稻瘟病是我国水稻生产上最严重的病害，具有传播快、发生广、危害重等特点(凌忠专 等，1989，我国北方稻区稻瘟病菌生理小种研究.中国农业科学，22(3):7-13)。进一步发掘和 利用我国抗稻瘟病基因资源，培育和种植抗病品种是控制稻瘟病发生和减少水稻产量损失最 经济有效的途径。

迄今，各国科学家从水稻中鉴定了80多个抗稻瘟病基因，其中有24个抗病基因被成功克 隆。这些抗病基因可以引入或聚合到现代品种，选育出高抗、广谱的品种。但传统育种方法费 时、费力、表型鉴定困难、育种效率低，由于抗病基因多为显性、基因间往往存在上位性互作， 抗病基因聚合更为困难。通过分子标记辅助育种可以有效解决这一问题。

我国太湖流域稻作历史悠久，被认为是粳稻起源地之一，蕴藏有丰富的稻种资源，李培富 等(2007，4个太湖流域粳稻地方品种抗稻瘟病性的遗传分析，遗传，2007年10期)报道我 国太湖流域粳稻地方品种江南晚对稻瘟病菌的抗性表现广谱和高抗的特点。从我国特有的种质 资源中鉴定和克隆穗瘟抗性基因，可以获得具有自主知识产权的基因，对提高我国水稻抗稻瘟 病育种水平，尤其是粳稻的抗稻瘟病育种有重大意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测与水稻稻瘟病抗性基因紧密连锁的分子标记的引物 对或引物对组及其应用。

本发明的另一目的在于提供一种用于检测或辅助检测水稻抗稻瘟病基因的试剂盒及其应 用。

本发明的又一目的在于提供一种检测水稻抗稻瘟病基因或选择水稻抗稻瘟病品种的分子 标记方法及其应用。

本发明主要提供水稻品种江南晚穗瘟抗性基因Pb-jn1的分子标记方法。通过检测与抗病 基因Pb-jn1紧密连锁的分子标记，可以确定有无抗病基因Pb-jn1，并预测水稻植株的稻瘟病 抗性，加快抗稻瘟病水稻新品种的选育进度。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种用于检测与水稻稻瘟病抗性基因紧密连锁的分子标记的引物对或引物对组，所述的 引物对为引物对A或引物对B；所述的引物对组由引物对A和引物对B组成；所述引物对A为 由如SEQIDNO.1所示的核苷酸片段和如SEQIDNO.2所示的核苷酸片段组成的引物对；所 述引物对B为由如SEQIDNO.3所示的核苷酸片段和如SEQIDNO.4所示的核苷酸片段组成 的引物对。

表1为引物对及其所对应的分子标记

上述的引物对或引物对组在制备检测或辅助检测水稻抗稻瘟病基因的试剂盒中的应用。

一种用于检测或辅助检测水稻抗稻瘟病基因的试剂盒，该试剂盒包含有上述的引物对或引 物对组。

上述的用于检测或辅助检测水稻抗稻瘟病基因的试剂盒还包含有PCR技术常用的试剂。

上述的引物对、引物对组及试剂盒在检测或辅助检测水稻抗稻瘟病基因或选择水稻抗稻瘟 病品种中的应用。

一种检测水稻抗稻瘟病基因或选择水稻抗稻瘟病品种的分子标记方法，包括以下步骤：

(1)提取待测水稻样品基因组DNA；

(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，采用上述的引物对或引物对组进行PCR 扩增，获得PCR产物；

(3)检测PCR产物如果扩增出大小为117bp或/和162bp的分子标记片段，标志水稻样品 中晚穗瘟抗性基因Pb-jn1存在，则待测的水稻样品为抗稻瘟病品种或候选的抗稻瘟病品种。

所述PCR扩增的反应体系为：10×含Mg²⁺的缓冲液1.0μl，4pmol/μl的引物对或引物对 组1μl，2.5mMdNTPs0.2μl，5U/μl的Taq酶0.1μl，10ng/μl的水稻样品基因组模板DNA1 μl，加水至10μl。

所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5分钟后；94℃变性30秒，55℃退火30 秒，72℃延伸展1分钟，循环35次；最后72℃延伸10分钟。

本发明水稻江南晚穗瘟抗性基因Pb-jn1的分子标记方法的具体步骤为：

(1)取水稻样品，提取水稻样品基因组DNA；(2)利用与水稻江南晚穗瘟抗性基因 Pb-jn1紧密连锁的分子标记引物，对所述的水稻样品基因组DNA进行PCR扩增，PCR扩增 产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测，如果扩增出对应大小的分子标记DNA片 段，标志着Pb-jn1基因的存在。

上述的方法在提高水稻抗稻瘟病品种育种进程中的应用。

本发明的有益效果

本发明所提供的水稻江南晚穗瘟抗性基因的分子标记方法，具有以下优点：

(1)江南晚为太湖流域粳稻地方品种，具有广谱高抗穗瘟的特征，其主效抗病基因Pb-jn1 为一个新的穗瘟抗性基因，筛选获得与之紧密连锁的分子标记RM27273和BS33，为分子标记 辅助选择育种和克隆Pb-jn1基因奠定了基础。利用本发明任意一对与水稻江南晚穗瘟抗性基 因Pb-jn1紧密连锁的分子标记引物对，进行穗瘟抗性基因Pb-jn1的鉴别，选择效率都达到 98.8％以上，利用两对分子标记引物的选择效率达99.98％。

(2)通过本发明分子标记定位的基因位点精确，鉴定方便。由于这些标记与穗瘟抗性基因 Pb-jn1的重组率低(≤1.2％)，通过检测这些与抗病基因Pb-jn1紧密连锁的分子标记，可以确 定抗稻瘟病基因Pb-jn1(t)的存在与否，预测水稻植株的稻瘟病抗性，从而快速抗病育种进程。

(3)辅助育种选择目标明确，节约成本。在传统抗病育种方法中，对育种材料的穗瘟抗性 进行表型鉴定，受接种环境影响较大，表型鉴定的结果可靠性低。因此抗病育种不仅费时，而 且难度大，成本高。通过检测穗瘟抗性基因Pb-jn1，可以在苗期取样，提取DNA，利用上述 标记就可鉴定出抗稻瘟病的单株，淘汰其它植株，不仅节约生产成本、控制育种群体规模，而 且大大提高抗稻瘟病个体的选择效率。

附图说明

图1.水稻穗瘟抗性基因Pb-jn1紧密连锁SSR标记RM27273的8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电 泳图。

其中：M：分子量Marker；J：江南晚；S：苏御糯；F：杂合型；1-5：抗病重组自交系； 6-10：感病重组自交系。

图2.水稻穗瘟抗性基因Pb-jn1紧密连锁SSR标记BS33的8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

其中：M：分子量Marker；J：江南晚；S：苏御糯；F：杂合型；1-5：感病重组自交系； 6-10：抗病重组自交系。

具体实施方式

实施例1

(一)材料与方法：

1.李培富等利用抗稻瘟病水稻地方品种江南晚(♀)与感病品种苏御糯(♂)杂交获得F₁， 自交获得F₂分离群体，用于遗传分析，明确江南晚对“北1”菌系的抗性是由两对抑制基因互作 控制。本发明在此基础上，采用单粒传法构建F_2:7重组自交系群体，即两亲本杂交获得F₁，自 交获得F₂，F₂随机选取284个单株，单株自交产生株系，连续自交6代，最终构建成包括284 个株系的F_2:7重组自交系群体。利用该群体定位到一个与抗稻瘟病相关的主效位点，此位点位 于第11条染色体标记RM27273和BS33之间，并与这两个标记紧密连锁，遗传距离为4.2CM。 其提供不低于60％的抗性。进一步将江南晚与12个日本稻瘟病鉴别品种杂交进行等位性测定， 结果表明，江南晚对北1菌系的主效抗性基因与12个鉴别品种所携带的已知抗病基因是不等 位的，将该基因命名为Pb-jn1。

2.菌种培养和接种鉴定方法，参照李培富等(中国水稻科学,2007，21：579～584)。

3.DNA提取方法：用CTAB法提取分离群体各单株的DNA。

4.紧密连锁分子标记的确定：

(1)标记多态性筛选：以亲本江南晚和苏御糯的DNA为模板，用Gramene网站上公布的 水稻SSR标记(http://www.gramene.org)，经PCR反应进行多态性分析。

(2)多态性标记的抗感池筛选：在重组自交系群体中，随机选择5个接种鉴定为抗病表 型的家系材料(抗病重组自交系)和5个接种鉴定为感病表型的家系材料(感病重组自交系)， 提取DNA后分别混合，形成抗病池和感病池，对多态性标记进行筛选分析其与抗感之间的关 系，如果某一标记的抗病池电泳结果和抗病亲本一致，感病池电泳结果和感病亲本一致，则说 明该标记可能与抗病基因紧密连锁。

(3)紧密连锁分子标记的验证：将可能与抗病基因紧密连锁的分子标记分别在构成抗感 池的5个家系材料中进行验证，如果连锁关系确实存在时，再在所有的家系材料中进行验证， 根据连锁的多态性标记与对应的抗感表型，分析标记与基因间的重组频率，计算出标记对抗性 的选择效率。

PCR反应体系：体积为10μl，其中10×缓冲液(含Mg²⁺)1.0μl,分子标记引物对(4 pmol/μl)1μl，2.5mMdNTPs0.2μl,Taq酶(5U/μl)0.1μl,模板DNA(10ng/μl)1μl，加水 至10μl。反应程序为：DNA94℃预变性5分钟后，(94℃变性30秒，55℃退火30秒， 72℃延伸展1分钟)循环35次，最后72℃延伸10分钟。以水稻的基因组DNA为模板，采用 表2中的引物对在biometre扩增仪上进行PCR扩增，扩增产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶 (100ml聚丙烯酰胺溶液中含7.6克丙烯酰胺和0.4克甲叉双丙烯酰胺)上进行电泳分离，然 后在紫外透射仪上照相，记录结果。

(二)结果与分析：

研究结果发现，SSR标记RM27273、BS33与抗病基因Pb-jn1紧密连锁(图1，图2)， 在亲本中的扩增条带大小如表2所示。在重组自交系284个家系材料中(332个配子中)，选 择效率计算方法如下：

SSR标记RM27273与抗病基因Pb-jn1之间出现2个交换型配子，重组率仅为0.7％，该 标记对抗性的选择效率达99.3％；

SSR标记BS33与抗病基因Pb-jn1之间出现1个交换型配子，重组率仅为0.35％，该标记 对抗性的选择效率达99.65％；

SSR标记RM27273和BS33双标记筛选的选择效率为1-0.7％*0.35％＝99.99％；

通过上述2个分子标记可以高效鉴定抗稻瘟病基因Pb-jn1存在与否，单标记选择效率均 达到99.3％，双标记组合的选择效率达99.99％。可用于分子标记辅助选择有效提高水稻抗病 品种的育种进程，控制育种群体规模。

表2.扩增分子标记的引物对及扩增条带大小

标记 上游引物序列L 下游引物序列R 江南晚片段(bp) 苏御糯片段(bp) 选择效率(％) RM27273 SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.2 117 110 99.3 BS33 SEQ ID NO.3 SEQ ID NO.4 162 173 99.65