和黄瓜白粉病抗性基因紧密连锁的AFLP分子标记研究

摘要

黄瓜是全球广泛栽培的蔬菜作物，对保障我国的蔬菜周年供应起着重要的作用。因此全球都广泛开展了黄瓜育种方面的研究。白粉病是黄瓜生产的主要病害之一，但是控制黄瓜白粉病抗性基因的鉴定是比较复杂，而分子标记辅助育种技术的出现为选育抗白粉病黄瓜新品种提供了快捷的途径。分子标记技术使黄瓜育种中的间接选择成为可能，同时它还能提高基因分析的准确性和效率。所以开展黄瓜白粉病抗性相关基因的分子标记研究具有重要的实践意义。 本实验以抗白粉病的美国露地黄瓜自交系‘WLS2757’和感白粉病的欧洲温室品种与华北温室品种杂交后代自交系‘19032’及其597株F2单株为材料，对亲本、F<,1>和F<,2>单株进行了苗期抗病性接种鉴定，首先进行了抗性遗传规律分析，然后利用AFLP标记方法进行相关连锁分子标记研究，获得与黄瓜白粉病抗性相关基因连锁的AFLP分子标记并将其转换为SCAR标记。 实验取得如下结果： 1．经抗病鉴定，597株F<,2>群体接种后分离为完全抗病、中抗和感病三种表型，完全抗病单株有35株，中等抗性单株有106株，感病单株有456株，X<'2>值为0.57，分离比例基本符合1：3：12的理论比例，说明在本实验中黄瓜对白粉病的抗性受三对基因控制，即抗性由一对隐性主基因s，一对显性加强基因R和一对抑制基因，控制，s是抗白粉病的主基因，决定下胚轴抗性；R基因是构成叶部抗性的基础，只有在s基因纯合时才能够加强抗性的表达；抑制基因，存在时，植株只能表现出部分抗性，但I不影响s基因的表达，本结果与Shanmugasundarum等(1971)的研究结果一致。 2．本研究用512对(32条PstI引物×16条Mse I引物的全组合)AFLP引物对抗病亲本“WLS2757”、感病亲本“19032”进行了筛选，得到255对在双亲间表现差异的引物，多态性比率是49.8﹪。在这255对引物中，有93对引物在两个亲本和抗感基因池(每池10个单株)中都扩增出稳定可重复的多态性条带，比率为18.2﹪。发现引物组合p63-m51扩增出的特异条带p63-m51-384与白粉病主效感病基因连锁，连锁距离为7cM。 3．将p63-m51-384特异条带进行测序，采用NCBI的Blast软件对GeneBank中的非冗余数据库(GeneBank+EMBL+DDBJ)进行查询，没有发现与该标记片段同源性高于30﹪的片段，说明该片段为新发现的黄瓜序列。根据测序结果设计SCAR引物，成功的将其转换为SCAR标记，该标记与白粉病主效感病基因的连锁距离为7cM。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词

首都师范大学位论文原创声明及授权使用声明

1引言

1.1概述

1.2遗传标记技术的研究进展

1.2.1形态学标记(Morphological Markers)

1.2.2细胞学标记(Cytological Markers)

1.2.3生化标记(Biochemical Markers)

1.2.4 DNA分子标记(DNA Molecular Markers)

1.3分子标记技术在作物育种中的应用

1.3.1分子标记辅助选择(Molecular Marker-assisted Selection，MAS)

1.3.2基因定位

1.3.3种质资源遗传多样性鉴定

1.3.4种质资源亲缘关系分析

1.4分子标记技术在黄瓜育种研究中的应用

1.4.1亲缘关系分析和种质资源鉴定

1.4.2品种纯度鉴定

1.4.3重要农艺性状的基因定位

1.4.4连锁图谱的构建

1.4.5 比较基因组学研究

1.4.6展望

1.5黄瓜白粉病的研究进展

1.5.1葫芦科白粉病菌生理小种的研究

1.5.2黄瓜白粉病抗性遗传规律研究现状

1.6本试验的研究目的、意义和主要内容

2材料与方法

2.1实验材料

2.2黄瓜白粉病苗期鉴定

2.2.1鉴定材料的准备

2.2.2白粉病菌源

2.2.3接种菌源的制备

2.2.4接种方法

2.2.5病情调查与分级标准

2.3基因组DNA的提取

2.4提取的DNA的检测

2.5与黄瓜白粉病抗性相关基因连锁的AFLP标记分析

2.5.1酶切及与接头连接

2.5.2预扩增

2.5.3选择性扩增

2.5.4聚丙烯酰胺凝胶的制备

2.5.5凝胶电泳

2.5.6银染

2.6与黄瓜白粉病抗性相关基因连锁的SCAR标记的获得

2.6.1 AFLP产物的重扩增

2.6.2目标片段的回收纯化

2.6.3目标片段与载体的连接

2.6.4目标片段的克隆

3结果与分析

3.1黄瓜对白粉病抗性基因的抗性遗传分析

3.2基因组DNA的提取及检测

3.3与黄瓜白粉病抗性相关基因的AFLP分子标记分析

3.3.1预扩增的检测

3.3.2双亲间的AFLP多态性分析

3.3.3 F2代抗白粉病池与感白粉病池的AFLP多态性分析

3.3.4具多态性的AFLP引物在F2分离群体中的验证

3.4 AFLP标记的获得及验证

3.4.1 AFLP特异片段的获得

3.4.2 AFLP特异片段的群体验证

3.4.3与黄瓜白粉病抗性相关基因的AFLP分子标记的遗传分析

3.5 AFLP标记转SCAR标记

3.5.1特异AFLP片段的回收与纯化

3.5.2重组质粒的筛选

3.5.3重组质粒的提取及检测

3.5.4 AFLP特异片段的测序结果和SCAR引物的设计

3.6 AFLP、SCAR标记与黄瓜白粉病抗性相关基因连锁关系分析

4讨论

4.1 F2代分离群体用于分子检测的可靠性

4.2 AFLP实验操作的几点体会

4.3目的片段的克隆

4.4 SCAR引物设计原则

4.5 SCAR标记在辅助选择育种上的可行性

4.6所得AFLP、SCAR标记在遗传育种中的用途

5结论

参考文献

致谢