一种可改善烟叶感官品质的复合生物制剂微胶囊

摘要

本发明属于烟草加工技术领域，具体涉及一种用于改善烟叶感官品质的复合生物制剂微胶囊。该复合生物制剂微胶囊由混合均匀的芯材和壁材通过喷雾干燥制备而成；所述芯材为枯草芽孢杆菌菌液、鞘氨醇单胞菌菌液和碱性蛋白酶的混合物；所述壁材为玉米糖浆、阿拉伯胶和麦芽糊精混合而成的质量浓度为30~50%的混合液。本发明通过微胶囊化技术将微生物制剂和酶制剂进行包裹，形成了利于微生物存活的微环境，从而利于微生物制剂及生物酶在烟叶表面较长时间内发挥作用，从而加速烟叶中大分子物质的降解，缩短烟叶醇化周期。本发明对于烟叶品质改善效果较为明显，能够明显缩短烟叶醇化时间，对于烟草生产企业具有较为重要的应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于烟草加工技术领域，具体涉及一种用于改善烟叶感官品质的复合生物 制剂微胶囊。

背景技术

烟叶醇化是提高烟叶感官品质的关键加工环节，烟叶经过采收、打叶复烤后，通常 还需要两到三年的醇化周期才能达到最佳的应用品质。通过醇化改善烟叶内在品质、提高 烟草的工业可用性，一直是烟草科研工作的热点之一。

烟叶醇化过程的本质是各种复杂的化学降解转化、生物酶催化转化和微生物促进 转化等协同作用的过程，其主要原理是通过烟叶中的大分子物质（如蛋白质、淀粉、多酚、色 素等）降解形成小分子致香化合物或致香前体物质，从而改善烟叶的品质。已有研究表明， 利用适当的微生物和酶制剂可有效加速烟叶醇化过程，进而提高烟叶质量。因而开发可降 解多种大分子物质的复合微生物制剂，是改善烟叶醇化过程的研究中最具应用前景的热点 研究方向。

但是现有微生物和酶制剂在应用于烟叶醇化时也存在一定的限制和难题，一是合 适的微生物菌株的筛选尚较为缺乏，二是微生物和酶作用需要一定的条件，尤其是对于环 境中水分需求较为严格，而烟叶醇化期间，为避免过高水分含量所导致霉变现象发生，往往 需要严格限制烟叶中的水分含量，而过低的水分含量显然又限制了微生物和酶制剂活性的 发挥。因此较大程度限制了微生物和酶制剂在烟叶醇化过程中的应用。

微胶囊技术是一种将微量物质包裹在聚合物薄膜等壁材中的技术，是一种储存固 体、液体、气体的微型包装技术。具体来说是指将某一目的物（芯或内相）用各种天然的或合 成的高分子化合物或无机材料（壁或外相）包覆起来，依靠囊壁的屏蔽作用起到保护芯材， 然后通过某些外部刺激（温度、压力等）或缓释作用使目的物的功能再次在外部呈现出来。 目前该技术在食品、化妆品、饲料、香精香料等领域已经广泛应用。

现有技术中，通过微胶囊化技术来保持微生物活性的研究已有较大进展，但目前 尚未见到较好地将该技术用于烟叶醇化的报道。

发明内容

本发明目的是提供一种用于改善烟叶感官品质的复合生物制剂微胶囊，使用该复 合生物制剂微胶囊后，不仅可以改善烟叶感官品质，而且可以缩短烟叶醇化周期，从而为新 的微生物制剂在烟叶醇化生产过程中的应用提供借鉴和参考，同时也为提高烟草工业的生 产效率奠定良好基础。

本发明所采取的详细技术方案介绍如下。

一种用于改善烟叶感官品质的复合生物制剂微胶囊，该复合生物制剂微胶囊由混 合均匀的芯材和壁材通过喷雾干燥制备而成；

所述芯材为枯草芽孢杆菌菌液、鞘氨醇单胞菌菌液和碱性蛋白酶的混合物，其中枯草 芽孢杆菌菌菌液中菌体数量为40~60亿个/mL，鞘氨醇单胞菌菌液中菌体数量为10~30亿个/ mL，所述碱性蛋白酶酶活为100-400U/mg；以质量比计，枯草芽孢杆菌菌液：鞘氨醇单胞菌 菌液：生物酶=0.8~1.0:0.8~1.0:1.0~1.2，

所述壁材为玉米糖浆、阿拉伯胶和麦芽糊精混合而成的质量浓度为30~50%的混合液， 以质量比计，混合液中，玉米糖浆：阿拉伯胶：麦芽糊精=3：5：4。

所述用于改善烟叶感官品质的复合生物制剂微胶囊，芯材中以质量比计，枯草芽 孢杆菌菌液：鞘氨醇单胞菌菌液：生物酶=1.0:1.0:1.2。

所述用于改善烟叶感官品质的复合生物制剂微胶囊，以质量比计，复合生物制剂 微胶囊中，芯材：壁材=1：1。

所述用于改善烟叶感官品质的复合生物制剂微胶囊的制备方法，具体包括以下步 骤：

（1）制备芯材：

枯草芽孢杆菌菌液按如下方法制备而成：取枯草芽孢杆菌菌株，LB液体培养基，30℃、 200rpm摇床培养扩增，以无菌培养液为空白对照，记录菌液在600nm处的吸光度值OD₆₀₀， 当菌液中菌体数量达到40~60亿个/mL时，OD₆₀₀≈6.0，此时作为应用菌剂；所述枯草芽孢杆 菌，具体例如采用中国典型培养物保藏中心的保藏号为：CCTCCNo：M2011452的枯草芽孢 杆菌菌株xp，其分类命名为Bacillussubtilis；

鞘氨醇单胞菌菌液按如下方法制备而成：取鞘氨醇单胞菌菌株，无机盐液体培养基，30 ℃、200rpm摇床培养扩增，以无菌培养液为空白对照，记录菌液的在600nm处的吸光度值 OD₆₀₀，当菌液中菌体数量达到10~30亿个/mL时，OD₆₀₀≈2.0，此时作为应用菌剂；所述鞘氨醇 单胞菌，具体采用例如中国典型培养物保藏中心的保藏号为：CCTCCNo：M2011453的鞘氨 醇单胞菌菌株xp，其分类命名为Sphingomonassp.；

制备鞘氨醇单胞菌菌液时所述无机盐液体培养基，具体每升培养基中含有：绿原酸0.2 g；Na₂HPO₄·12H₂O6.15g；KH₂PO₄1.52g；(NH₄)₂SO₄1.5g；MgSO₄·7H₂O0.20g；CaCl₂· 2H₂O0.05g；

所述碱性蛋白酶的酶活为100-400U/mg，具体可采用例如Amresco公司的一种酶活为 200U/mg的碱性蛋白酶商业化产品；

枯草芽孢杆菌菌液、鞘氨醇单胞菌菌液、碱性蛋白酶分别制备，制备复合生物制剂微胶 囊前再按如下质量比混合均匀，枯草芽孢杆菌菌液：鞘氨醇单胞菌菌液：生物酶=0.8~1.0: 0.8~1.0:1.0~1.2，优选配比为，枯草芽孢杆菌菌液：鞘氨醇单胞菌菌液：生物酶=1.0：1.0： 1.2；

（2）制备壁材：

将玉米糖浆、阿拉伯胶和麦芽糊精按比例混合均匀，制备成质量浓度为30~50%的溶液 作为壁材溶液；

以质量比计，玉米糖浆：阿拉伯胶：麦芽糊精=3：5：4；

（3）制备复合生物制剂微胶囊：

取步骤（2）中壁材溶液，搅拌条件下，按比例加入步骤（1）中混合均匀的芯材，混合均匀 后作为原料溶液；以质量比计，壁材：芯材=1：1；

将该原料溶液在40~60℃、30~40MPa条件下高压均质化，形成稳定的料液；

将所形成的稳定的料液在喷雾干燥塔内进行喷雾干燥，具体参数为：喷雾进料温度为 50℃~60℃，进料流量为130~150mL/min，进风温度为170℃~180℃，出风温度为50℃~60℃；

最终所得粉末产品即为本申请中的复合生物制剂微胶囊。

所述用于改善烟叶感官品质的复合生物制剂微胶囊在烟叶醇化中的应用，将复合 生物制剂微胶囊按不超过烟叶质量的2.5%进行掺兑，优选条件下，按烟叶质量的1.0~2.5% 进行掺兑，进一步地，按烟叶质量的2%进行掺兑；烟草仓库中自然条件下存放4~8个月后，可 明显改善烟叶感官品质。

本发明中，通过微胶囊化技术将微生物制剂和酶制剂进行包裹，形成了利于微生 物存活的微环境，从而利于微生物制剂及生物酶在烟叶表面较长时间内发挥作用，从而加 速烟叶中大分子物质的降解，缩短烟叶醇化周期。实际检测表明，本发明所提供的复合生物 制剂微胶囊中的微生物能够在较长时间周期内保持较好的生物活性，而不依赖于烟叶中的 微环境；而且对于烟叶品质改善效果较为明显，能够明显缩短烟叶醇化时间，对于烟草生产 企业具有较为重要的应用价值。

附图说明

图1为本发明所提供的用于改善烟叶感官品质的复合生物制剂微胶囊的结构示意 图，其中A为复合生物制剂微胶囊内部的芯材，B为复合生物制剂微胶囊外部包裹的壁材。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，对本发明 所涉及部分物料情况简要介绍说明如下。

主要原材料：

枯草芽孢杆菌采用中国典型培养物保藏中心的保藏号为：CCTCCNo：M2011452的枯草 芽孢杆菌菌株xp，其分类命名为Bacillussubtilis；本实施例中所采用菌株由原保藏单位 惠赠提供；当然，该菌株也可从上述保藏机构获得；为确保技术效果，也可采用其他同种的 菌株；

鞘氨醇单胞菌采用中国典型培养物保藏中心的保藏号为：CCTCCNo：M2011453的鞘氨 醇单胞菌菌株xp，其分类命名为Sphingomonassp.；本实施例中所采用菌株由原保藏单位 惠赠提供；当然，该菌株也可从上述保藏机构获得；为确保技术效果，也可采用其他同种的 菌株；

下述实施例中所采用碱性蛋白酶为购自Amresco公司的一种酶活为200U/mg的商业化 碱性蛋白酶成品；当然也可采用其他公司的具有类似酶活的碱性蛋白酶成品；

下述实施例中所涉及的玉米糖浆（DE值，38~42%）、阿拉伯胶和麦芽糊精（DE值，13~17%） 等原料均为食品级，购自河南明瑞食品添加剂公司；

下述实施例中所涉及烟叶原料有：2014年许昌打叶复烤CJ91模块烟叶和2014年许昌 DBK54打叶复烤模块烟叶，均由申请人所属的河南中烟工业有限责任公司相关单位提供；烟 叶保藏仓库为河南中烟工业有限责任公司所属的十里铺烟叶仓库，烟叶在自然条件下保 存，烟叶水分含量在11%~13%左右。

另外需要说明的是，菌液中菌体数量检测采用倾注平板计数法。

还需说明的是，烟叶感官品质评价采用河南中烟工业有限责任公司所属的、随机 抽取的16名专业评吸人员参照《河南中烟单料烟感官质量评价方法》对烟叶的感官质量进 行评价；具体操作为：

将烟叶切丝，制成烟支规格（20+64）×24.5mm的烟支样品，经过质量筛选，在22℃±1 ℃、相对湿度60±2%的恒温恒湿箱中平衡48h后评吸；

感官指标包括香气质、香气量、浓度、柔细度、余味、杂气、刺激性、劲头、燃烧性、灰色 等，每项指标均按9分制打分，然后按不同权重系数（详见下表）换算相加求和得到感官总 分；

各项感官指标的权重系数表如下所示：

实施例1

本实施例所提供的用于改善烟叶感官品质的复合生物制剂微胶囊，按如下步骤制备而 成。

（1）制备芯材：

枯草芽孢杆菌菌液按如下方法制备而成：取枯草芽孢杆菌菌株，LB液体培养基，30℃、 200rpm摇床培养扩增，以无菌培养液为空白对照，记录菌液在600nm处的吸光度值OD₆₀₀， 当OD₆₀₀=6.0，作为应用菌剂，此时计数表明菌液中菌体数量=70亿个/mL（具体为7.02×10⁹cfu/mL）；

鞘氨醇单胞菌菌液按如下方法制备而成：取鞘氨醇单胞菌菌株，无机盐液体培养基，30 ℃、200rpm摇床培养扩增，以无菌培养液为空白对照，记录菌液的在600nm处的吸光度值 OD₆₀₀，当OD₆₀₀=2.0，作为应用菌剂，此时计数表明菌液中菌体数量=53亿个/mL（具体为5.31 ×10⁹cfu/mL）；

每升无机盐液体培养基中含有：绿原酸0.2g；Na₂HPO₄·12H₂O6.15g；KH₂PO₄1.52 g；(NH₄)₂SO₄1.5g；MgSO₄·7H₂O0.20g；CaCl₂·2H₂O0.05g；

碱性蛋白酶的酶活为Amresco公司的一种酶活为200U/mg的碱性蛋白酶商业化产品；

枯草芽孢杆菌菌液、鞘氨醇单胞菌菌液、碱性蛋白酶分别制备，制备复合生物制剂微胶 囊前再按比例混合均匀。

（2）制备壁材：

将玉米糖浆、阿拉伯胶和麦芽糊精按比例混合均匀，制备成质量浓度为40%的溶液作为 壁材溶液；

以质量比计，玉米糖浆：阿拉伯胶：麦芽糊精=3：5：4。

（3）制备复合生物制剂微胶囊：

取步骤（2）中壁材溶液，保持600r/min高速搅拌，按比例缓缓加步骤（1）中混合均匀的 芯材，添加完毕后，继续搅拌30min确保混合均匀，作为原料溶液；以质量比计，壁材：芯材= 1：1；

将该原料溶液在60℃、40MPa条件下高压均质化，形成稳定的料液；

将所形成的稳定的料液在喷雾干燥塔内进行喷雾干燥，具体参数为：喷雾进料温度为 60℃，进料流量为150mL/min，进风温度为175℃，出风温度为60℃；

最终所得粉末产品即为本申请中的复合生物制剂微胶囊。

对所制备的复合生物制剂微胶囊进行显微观察，其结构如图1所示，活菌较为集中 的聚集在微胶囊的内部从而形成芯材A，而外部包裹部分活菌较少，主要为玉米糖浆、阿拉 伯胶和麦芽糊精所形成的壁材B，壁材B一方面对芯材A形成保护作用，一方面提供一定的营 养物质，从而使芯材A内的活菌能够存活较长时间。

以枯草芽孢杆菌菌液：鞘氨醇单胞菌菌液：生物酶=0.7：0.7：0.8的壁材作为对比 例，记为混合生物菌剂HJY-0，检测表明，活菌数=6.01×10⁹cfu/mL；

以枯草芽孢杆菌菌液：鞘氨醇单胞菌菌液：生物酶=0.7：0.7：0.8的壁材所制备的复合 生物制剂微胶囊，记为微胶囊HJY-1，检测表明，该胶囊粒径为20~60μm，活菌聚集在胶囊核 心部位，活菌数=5.77×10⁹cfu/mL；

以枯草芽孢杆菌菌液：鞘氨醇单胞菌菌液：生物酶=0.8：1.0：1.2的壁材所制备的复合 生物制剂微胶囊，记为微胶囊HJY-2，检测表明，该胶囊粒径为30~60μm，活菌聚集在胶囊核 心部位，活菌数=5.17×10⁹cfu/mL。

对上述所制备的HJY-0、HJY-1、HJY-2中的菌体的存活情况进行检测，相关实验简 要介绍如下。

将HJY-0、HJY-1、HJY-2分别置于25℃、相对湿度65%的恒温恒湿条件下存储，每隔 两个月取样，检测活菌数，与初始值相比计算存活率，考察菌体数量变化情况。具体检测结 果如下表所示：

从上表中可以看出，混合生物菌剂HJY-0在存放5个月后，菌体数量已经减少为初 始值一半左右，而通过微胶囊化处理后，即使在存放8个月后，菌体数量仍然较高，因而对于 加速烟叶醇化、持续改善烟叶品质均有应用的可能性。

实施例2

以实施例1所制备的HJY-0、HJY-1、HJY-2按一定比例分别与烟叶掺兑后，将烟叶仍然置 于烟草仓库中存放，烟叶存放期间，每隔两个月取样，对处理后烟叶进行评价。不同处理情 况下烟叶的品质变化情况介绍如下。

不添加菌剂（空白对照）的烟叶质量的变化情况如下表所示：

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HJY-0处理烟叶时，按烟叶质量的1.0%添加处理，处理后烟叶质量变化情况如下表 所示：

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HJY-1处理烟叶时，按烟叶质量的2.0%的比例进行添加，处理后烟叶质量变化情况 如下表所示：

。

同时HJY-1处理烟叶时，按烟叶质量的不同比例进行添加处理，处理5个月时，烟叶 质量的感官得分情况如下表所示：

从上述对比可以大致看出，直接采用微生物菌剂进行处理时，在处理初期，烟叶品 质改善效果较为明显，但随着时间的延长，烟叶品质改善效果已十分有限。而采用本申请所 提供的复合生物制剂微胶囊处理时，烟叶品质改善则较为平稳，随着时间的延长，烟叶品质 能够得到持续改善，而且改善效果也由于直接采用微生物菌剂处理；进一步就改善效果而 言，在复合生物制剂微胶囊的添加量不超过2.5%时，烟叶品质的改善效果均能得到较为明 显的提升。

HJY-2处理烟叶时，按烟叶质量的2.2%的比例进行添加，处理后烟叶质量变化情况 如下表所示：

从上表可以看出，就不同微生物比例的复合生物制剂微胶囊而言，相同添加量和 相同存放时间时，HJY-1处理后烟叶改善效果优于HJY-2处理效果，因而HJY-1是较佳实施 例。