NCoR/SMRT蛋白复合体在调节细胞命运转变中的应用

摘要

本技术涉及NCoR/SMRT蛋白复合体在调节细胞命运转变中的应用，尤其涉及一种通过干扰NCoR/SMRT蛋白复合体的功能而实现细胞重编程的方法。本发明创造通过对一种蛋白复合体的调节，实现了更快更高效的细胞重编程。具体包括通过降低表达水平、添加化学小分子或过表达显性负抑制蛋白来干扰NCoR/SMRT共抑制复合体的功能，从而加速体细胞(somatic cells)到诱导多功能干细胞(iPSCs)的重编程过程，并极大的提高重编程的效率。

说明书

技术领域

本技术涉及生物技术领域，尤其涉及一种通过干扰NCoR/SMRT蛋白复合体的功能而实现细胞重编程的方法。

背景技术

NcoR/SMRT是属于同一家族的一对具有高度同源性的蛋白因子，在进化上非常保守，存在于从低等生物到人类的所有物种。他们最早是作为激素受体的共抑制因子而被发现，可以结合甲状腺激素受体和视黄酸受体，在没有配体的情况下，由受体带到它们的靶基因上，抑制这些基因的表达。而当激素受体与激素配体相结合，NcoR/SMRT将从受体上解离下来，激素受体与转录共激活因子如P300相结合，行使转录激活功能。除了激素受体，很多其他的转录因子也可以和NcoR/SMRT相结合并发挥调节作用。NcoR/SMRT的生理功能非常广泛。在小鼠胚胎中对NcoR/SMRT进行敲除，绝大多数胚胎分别在胚胎第15.5天和第16.5天死亡，前者死于神经系统，红细胞和胸腺发育障碍；后者则出现了前脑发育不正常，最终致死原因为心力衰竭。敲除实验显示了NcoR/SMRT在神经、造血、心脏的发育和功能中起到重要作用。

除了发育中的功能，NcoR/SMRT在表观遗传调控上也起到关键作用。NcoR/SMRT可以和包括HDAC3在内的几乎所有组蛋白去乙酰化酶(histonedeacetylase，HDAC)家族成员相互作用，调节组蛋白的乙酰化修饰，决定染色质的开放程度。NcoR/SMRT总是以转录抑制复合体的形式存在并发挥作用，其核心成分包括NcoR或SMRT、组蛋白去乙酰酶HDAC3，这两个组分总是存在于复合体中。其他成分如TBL1，TBLE1，GPS2，ZBTB3等则根据不同的细胞环境而选择性存在。作为核心成分的HDAC3可以去掉组蛋白的乙酰化修饰，使染色质结构变得更紧凑，抑制基因的表达。

人们长期认为，随着分化过程的进行，动物细胞的多向分化潜能会消失，逐渐限定为某种特异的功能，这种变化是不可逆的。然而最近的研究表明，体细胞核移植、细胞融合、过表达胚胎干细胞(EmbryonicStemCells)中的三个核心转录因子Sox2,Oct4,Klf4都可以把体细胞重编程为诱导多潜能干细胞(PluripotentStemCells)。这些发现使人们认识到细胞内存在一些因子可以决定细胞的命运，通过对这些因子进行调控，就可以控制细胞的命运，得到人类想要的细胞类型。这种细胞命运的转化为未来更广泛的进行临床上的细胞替代治疗奠定了基础。人们将来可以通过重编程将体细胞诱导为多能干细胞，进一步分化为自己想要的细胞类型；也可以通过转分化，使一种细胞直接转变为另一种细胞类型，以此来获得数量上足够，质量上安全的临床级细胞制品。

转分化是人为的对不同细胞命运转变进行调控的一大成功。不同于重编程，转分化是通过体外操作，直接将一种细胞类型诱导为其他细胞类型，这种转换既可以是同一胚层细胞间的转换，也可以是跨胚层的细胞命运转变。目前已经有包括三个胚层在内的很多细胞类型实现了转分化。这些转分化的实现多依赖于不同转录因子的组合，尤其是与目的细胞命运相关的关键转录因子。当这些关键转录因子被过表达之后，细胞从基因表达到形态变化都会经历一个转变的过程，最终成为另一种细胞类型。转录因子具有位点识别功能，它们能特异性的靶定到基因组的某些区域，并招募一系列共同作用因子来实现调控功能。这些共同作用因子经常形成大的复合物，并可以调控重要的表观遗传修饰，如组蛋白甲基化或乙酰化，DNA甲基化等等，它们在转分化中的重要性还没有得到很好的研究。

除了正常的细胞命运转变过程，癌症的发生可以看做是一种非正常的细胞命运转变。一种说法认为，癌细胞由正常细胞获得基因变异，变异积累后成为恶性的癌细胞。另一种说法认为体内存在癌症干细胞，该细胞在正常情况下处于静息状态，不会恶性爆发。而当环境发生变化后，受到细胞内外综合因素的影响，会无限制的增值，形成肿瘤。这两种说法，均为从正常状态，向非正常状态转变，而内在的转变因素，是什么原理触发了该种转变，尚不清楚。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种实现细胞重编程的方法。

本发明的内容包括NCoR/SMRT蛋白复合体在调节哺乳动物细胞命运转变中的应用，所述哺乳动物细胞尤其是小鼠细胞或人类细胞。

进一步地，该应用是通过调节所述NCoR/SMRT蛋白复合体中NCoR/SMRT蛋白或其他部分，主要是HDAC3的活性或表达水平实现的。

进一步地，所述细胞命运转变是a)体细胞到诱导多功能干细胞的退分化过程或b)从体细胞到其他细胞类型特别是神经细胞、血液细胞、肝脏细胞的转分化过程或c)细胞癌变等非正常的细胞命运转变过程。

另一方面，本发明的内容还包括NCoR/SMRT蛋白复合体在促进成体细胞体外成熟中的应用。

另一方面，本发明的内容还包括一种实现细胞命运转变的方法，，通过干扰NCoR/SMRT蛋白复合体的功能而实现。

进一步地，所述细胞命运转变为细胞重编程。

进一步地，所述干扰NCoR/SMRT蛋白复合体的功能的方法包括但不限于基因敲除、降低其表达水平、添加化学小分子或过表达显性负突变体。

进一步地，所述显性负突变体为HDAC3蛋白的显性负抑制突变体。

进一步地，所述化学小分子包括但不限于降低NCoR/SMRT的活性的小分子，调节HDAC3活性的小分子，和阻断NCoR/SMRT与HDAC3相互作用的小分子。

另一方面，本发明的内容还包括调节NCoR/SMRT蛋白复合体的活性或表达水平在癌症相关药物筛选和癌症治疗中的应用。

进一步地，该应用是通过调节NCoR/SMRT蛋白复合体被癌基因c-Myc招募的过程实现的。

本发明创造通过对一种蛋白复合体的调节，实现了更快更高效的细胞重编程。具体包括通过降低表达水平、添加化学小分子或过表达显性负抑制蛋白突变体来干扰NCoR/SMRT共抑制复合体的功能，从而加速体细胞(somaticcells)到诱导多功能干细胞(iPSCs)的重编程过程，并极大的提高重编程的效率。这种重编程包括小鼠细胞、人类细胞、其他物种细胞。我们预期从体细胞到其他细胞类型如神经细胞，血液细胞，肝脏细胞的转分化过程中，NCoR/SMRT复合体也将发挥重要功能，通过对其调节，可以达到更快更高效的细胞命运转变，同时提高目的细胞的质量，如肝脏细胞的解毒功能的成熟。

同时，因为NCoR/SMRT与癌基因c-Myc有密切的相互作用，他们在正常细胞向癌细胞的非正常转变中也将发挥重要的作用。通过筛选得到的，能调节NCoR/SMRT与c-Myc的相互作用或调节NCoR/SMRT的活性的小分子，有可能会在未来的癌症治疗中发挥作用。我们也希望对这一方面进行保护。

本发明为再生医学获得高效、优质、快捷的细胞源提供了保障，对于转分化细胞的移植应用也有重要的帮助。

为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。

附图说明

图1.降低NCoR和SMRT的表达水平可以极大地促进重编程。(A)NCoR和SMRT的shRNA引起的重编程效率变化，统计时间为重编程第9天和第16天；(B-C)NCoR和SMRT的shRNA在血清加Vc的条件下对重编程效率的影响；(D)NCoR和SMRT的shRNA对细胞增殖的影响。

图2.敲减HDAC3对重编程效率的影响。(A)筛选另外两个HDAC3的有效shRNA；(B)敲减HDAC3在一般重编程条件下的作用；(C)敲减HDAC3在添加Vc重编程条件下的作用；(D)敲减HDAC3在添加VPA重编程条件下的作用。

图3.HDAC3及突变体在重编程中的作用。(A)HDAC3及突变体的结构示意图；(B)HDAC3及突变体在重编程引起的细胞形态变化；(C)HDAC3及突变体对重编程效率的影响(D)HDAC3突变体对细胞增殖的影响；(E)HDAC3突变体在各种条件下对重编程效率的影响；control或者ctrl为空载体,以下若非说明，均为空载体。

图4.HDAC3双突变体在重编程中的作用。左图为突变位点示意图，右图为重编程效率统计图。Mock为空载体。

图5.shNCoR和shSMRT形成的克隆鉴定。(A)shNCoR和shSMRT的iPSCs的细胞形态和免疫荧光分析；(B)外源重编程因子在iPSCs克隆株的沉默检测；(C)内源多能性基因在iPSCs克隆株的表达检测；(D)外源因子在iPSCs克隆株基因组上的整合检测；(E)iPSCs克隆株的核型分析；(F)iPSCs克隆株形成的嵌合小鼠。

图6.NCoR/SMRT在重编程过程中于基因组上的结合位点，图上显示了多能性基因的基因座。

图7.癌基因编码蛋白c-Myc可以招募NCoR/SMRT复合体。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；

下述实施例中所用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径获得。

使用的细胞及其来源

1)293T：由腺病毒E1永生化的人胚肾HEK293细胞中插入恒定表达的SV40大T抗原，该细胞系购自ATCC。

2)Plat-E：由293T细胞衍生而来，用于包装小鼠逆转录病毒以及进行体外蛋白纯化实验。

3)OG2-MEF：自129品系雌性小鼠和OG2雄性小鼠杂交后怀孕小鼠第13.5天的胚胎分离制得。129小鼠，品系为129/sv，购自北京维通利华公司。OG2小鼠，品系为CBA/CaJ×C57BL/6J，购自Jackson实验。

4)ICR-MEF：自ICR小鼠雌雄小鼠杂交后怀孕小鼠第13.5天分离胚胎得到。ICR品系小鼠购自北京维通利华公司。

主要材料和试剂

1)细胞培养相关试剂

a)DMEM高糖培养基(Hyclone、Corning、Gibco)

b)青霉素和链霉素双抗混合液：Penicillin/Streptomycin(Hyclone)

c)GlutaMax(Gibco)

d)非必须氨基酸：nonessentialaminoacidsolution，NEAA(Gibco)

e)β-巯基乙醇：β-Mercaptoethanol(Gibco)

f)丙酮酸钠：SodiumPyruvate，(Gibco)

g)胎牛血清：fetalbovineserum，FBS(Hyclone、Biowest)

h)特级胎牛血清：FBS(Gibco)

i)小鼠白血病抑制因子：leukemiainhibitoryfactor，LIF(Millipore)

j)转染试剂PEI(polysciences23966)，OPTI-MEM(LifeTechnologies),Lipofectamine3000(Invitrogen)。

k)0.05％胰酶(Trypsin)

细胞培养相关小分子化合物

2)维生素C(sodiumL-ascorbate,Sigma)

3)GSK3β抑制剂：CHIR99021

4)MEKK抑制剂：PD0325901

5)组蛋白去乙酰化酶抑制剂：valproicacid，VPA(Sigma)；trichostatinA，TSA(Sigma)

9)Polybrene:储存浓度为8mg/ml(Sigma-Aldrich)。

细菌培养相关试剂和耗材

1)常用的细菌感受态：Top10、DH5α(北京天根)，Stbl3(复能基因)。

2)限制性内切酶(Takara、NEB)。

3)T载体：pMD18-T(Takara)。

4)连接酶：SolutionI(Takara)。

5)质粒小提试剂盒(北京天根)，质粒大提试剂盒(北京天根)。

【实施例1】利用NCoR/SMRT调节小鼠成纤维细胞重编程的方法

本实施例涉及体细胞到多能性干细胞转变的方法，具体包括以下步骤：1)将转录调控因子Sox2，Oct4，Klf4，c-Myc共同导入成纤维细胞中，得到共同表达四个转录因子的细胞系；2)分别导入干扰NCoR或SMRTmRNA的小发夹RNA(shRNA)，降低NCoR/SMRT的表达水平；3)或导入存在于同一复合体的组蛋白去乙酰化酶HDAC3的显性负抑制突变体，干扰NCoR/SMRT复合体的正常功能；5)将成纤维细胞的培养基换为重编程培养基进行培养。

1.1病毒载体的构建

1.1.1逆转录病毒载体A为将转录共调节因子NCoR编码基因的小发夹RNA即shRNA(序列表SeqIDNo.1或SeqIDNo.2)插入pSUPER-Oct4(Addgene)表达载体的BglⅡ和HindⅢ酶切位点间得到的重组载体；

1.1.2逆转录病毒载体B为将转录共调节因子SMRT编码基因的小发夹RNA即shRNA(序列表SeqIDNo.3或SeqIDNo.4)插入pSUPER-Oct4(Addgene)表达载体的BglⅡ和HindⅢ酶切位点间得到的重组载体；

1.1.3逆转录病毒载体C为将组蛋白去乙酰酶HDAC3编码基因的小发夹RNA即shRNA(序列表SeqIDNo.5或SeqIDNo.6)插入pSUPER-Oct4(Addgene)表达载体的BglⅡ和HindⅢ酶切位点间得到的重组载体；

1.1.4逆转录病毒载体D为将组蛋白去乙酰酶HDAC3编码基因的显性负抑制突变体(序列表SeqIDNo.7)插入pMXs-EGFP(Addgene)载体的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点间得到的重组载体；

1.1.5逆转录病毒载体D为将组蛋白去乙酰酶HDAC3编码基因的显性负抑制和NCoR/SMRT结合位点双突变体(序列表SeqIDNo.8)插入pMXs-EGFP(Addgene)载体的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点间得到的重组载体；

1.1.6pMXs载体表达的Oct4/Klf4/Sox2/c-Myc质粒购自Addgene。

1.2逆转录病毒的制备

1.2.1转染前一天将Plat-E细胞分盘，Plat-E培养基，放入细胞培养箱过夜培养；

1.2.2次日，使用PEI转染重编程因子Sox2，Oct4，Klf4，c-Myc和NCoR/SMRT的shRNA，或HDAC3显性负抑制突变体，或HDAC3的shRNA。按操作步骤加入质粒和OPTI-MEM，混合均匀后加入PEI，然后迅速剧烈均匀摇晃或用1mL移液枪吹打20下左右，静置15分钟；将混合液均匀滴加到预先换过液的Plat-E细胞中。将完成转染的细胞放入培养箱，培养8-16h，之后换液。转染48小时后收集病毒。可在荧光显微镜下观察转染的GFP的荧光强度以判定转染效率。

1.2.348小时后，用注射器收集细胞上清，经0.45μm的滤器过滤至收集病毒的器皿中，可保存在4℃冰箱最多5天。病毒待重编程使用。

1.3小鼠MEF细胞的诱导重编程

1.3.1复苏一只带有GFP绿色荧光报告基因的OG2-MEF细胞到100mm培养皿中，培养2天，MEF培养基如表1；

1.3.2待细胞快长满时，分细胞，进行细胞计数，将细胞种到12孔板中，每孔种15000个细胞；

1.3.3待细胞贴壁，一般6个小时之后可进行病毒感染；

1.3.4病毒感染前需添加30％的新鲜培养基和Polybrene，病毒滴度为OSKM每种病毒加500μL，该天计为重编程D0(D＝day)。

1.3.512小时后再感染其他例如shRNA或过表达质粒的逆转录病毒，病毒滴度为每个孔1mL，逆转录病毒可感染过夜，重编程中的细胞培养使用mES培养基如表2；若感染HDAC3的显性负抑制突变体，病毒滴度为0.5ml，然后加0.5ml新鲜培养基，用1ml混合液感染。

1.3.6D3开始根据实验需要更换重编程培养基如mES培养基，mES加Vc培养基，mES加组蛋白去乙酰酶抑制剂VPA/TSA培养基，直至GFP荧光阳性克隆出现；

1.3.7重编程效率判定：我们的实验采用Oct4-GFP阳性克隆的数目作为效率统计标准。当GFP阳性的克隆出现并可进行计数统计时，在荧光显微镜(ZesisSteREOLumarV12)下对Oct4-GFP阳性克隆数进行统计。统计结果显示，NCoR/SMRT蛋白复合体敲低后，重编程的效率会增加十倍以上。且荧光出现的时间提前，在更早的时间点，得到更多的重编程细胞。实验结果如附图1所示。

表1MEF培养基

MEF Medium 浓度 DMEM高糖 FBS 10％ NEAA 1％ GlutaMAX 1％ 青霉素/链霉素(可选) 50U mL^-1

表2mES培养基

研究证明，NcoR/SMRT在体细胞重编程中发挥了重要的作用。当利用shRNA降低NcoR/SMRT的表达水平时，重编程的效率被大大的提高，同时重编程所需的时间也更短(图1)。

【实施例2】NCoR/SMRT蛋白复合体主要功能原件为HDAC3

NcoR/SMRT作为一个非常大的蛋白，它们本身没有酶活性，主要通过和其他调节蛋白的结合实现功能。为了研究NcoR/SMRT蛋白复合体主要通过什么原件发挥功能，我们在重编程过程中做了如下实验。

首先，HDAC3是NcoR/SMRT复合体中具有酶功能的部分，且恒定的与NcoR/SMRT结合，因此我们构建了NcoR/SMRT复合体中的恒定原件HDAC3的shRNA，利用该shRNA进行重编程，我们发现重编程效率出现了类似的提高。如果加入HDAC蛋白家族的抑制剂VPA、TSA在重编程培养基中，重编程效率也可以被提高(图2)。

其次，为了进一步验证该结果，我们利用HDAC3的显性负抑制突变体，进行了重编程。该突变体不具有去乙酰酶功能。我们在感染了SKOM的第二天感染HDAC3显性负抑制突变体病毒。结果显示，若在重编程细胞中过表达HDAC3的无去乙酰化功能突变体，突变体会和正常功能的HDAC3竞争性的与NcoR/SMRT结合，从而产生无抑制功能的NcoR/SMRT复合体，重编程效率因此被极大提高(图3)。而如果我们将无去乙酰化功能的HDAC3突变体进一步突变，产生无法和NcoR/SMRT相结合的HDAC3无去乙酰化突变体，在重编程细胞中过表达这个突变体，则不能促进重编程，显示出NcoR/SMRT在重编程中的抑制功能主要由HDAC3来实现，二者相互结合，并且通过组蛋白去乙酰化功能发挥作用(图4)。

【实施例3】小鼠诱导多能干细胞的功能检测

3.1小鼠ESC及iPSC传代培养：

为了检测通过调节NCoR/SMRT复合体得到的重编程细胞是否具有诱导多能干细胞的正常功能，我们首先在体外对iPSCs进行克隆挑选。挑选的克隆在体外进行传代培养，我们将传代的克隆按照10-20×10⁴每孔的密度种于铺有feeder的六孔板中，使用mES培养基或者N2B27+2i培养基培养，每天更换新鲜培养基，可根据细胞的长势适当增加培养基，一般3天传一代，每天仔细观察iPSCs和ES细胞的细胞状态，观察克隆有无分化状态出现，若出现细胞分化可在显微镜下刮除分化细胞；若分化细胞比例太大可在显微镜下重新挑取状态良好的iPSCs和ES细胞进行后续的培养。

3.2多能性基因表达及外源因子沉默鉴定：

诱导多能干细胞的一个特征是完成重编程后，外源的逆转录病毒会被沉默，停止表达。为了检测我们得到的克隆是否已经完成重编程，我们首先检测了外源基因的沉默。同时我们检测了诱导多能干细胞内源多能性基因的表达水平是否达到多能性细胞应有的水平。具体的实验操作如下：待iPSCs长至克隆密度合适时，对iPSCs克隆消化并通过差速贴壁的方法去除feeder细胞后，剩余的细胞一部分用于传代，另一部分用于RNA的裂解。提取iPSCs克隆的RNA后，用oligo-dT进行反转录得到cDNA，用ES细胞特异性的多能性基因引物(Rex1、Oct4、Nanog)进行荧光定量PCR检测内源性多能性基因的表达情况(图5C)，以ES细胞和MEF细胞的cDNA分别作为阳性对照和阴性对照。同时用外源的四因子引物做荧光定量PCR检测外源基因的沉默情况(图5B)，用OSKMD6的样品作为阳性对照。实验结果显示，通过降低NCoR/SMRT的表达水平高效率重编程得到的诱导多能干细胞，内源多能性基因表达水平和小鼠ES细胞类似，外源重编程因子已经沉默，说明重编程在基因表达层面很好地达到了质量要求。

3.3外源因子插入鉴定：

为了检测我们用于重编程的因子是否顺利整合到基因组，我们还检查了外源因子的插入情况。提取小鼠细胞基因组DNA进行插入鉴定。将细胞用0.25％胰酶消化后离心，DPBS重悬，再次离心结束后用GenomicDNAPurificationkit里的核裂解液裂解细胞，之后按照试剂盒中说明书操作。提好的DNA加入1×TE，4℃溶解过夜。用PCR的方式进行插入鉴定，使用小鼠shRNA序列和外源四因子的序列作引物，用ES细胞或ddH₂O等作阴性对照(图5D)。

3.4核型鉴定：

核型是否正常，是衡量多能干细胞功能的一个重要方面。为了确保我们的细胞的安全性，我们检测了调节NCoR/SMRT蛋白复合体得到的诱导多能干细胞的核型。用于核型鉴定的iPSCs如培养在feeder上需首先除去feeder，去除feeder的方式根据iPSC以及成纤维贴壁能力不同，采用差速贴壁法。首先将消化下的细胞用mES培养基重新种植于提前用明胶包被的培养皿中，摇匀后放于37℃培养箱静置培养10-20min，这时大多数的iPSC仍存在于上清培养基中，而feeder细胞已经贴壁。将无feeder的细胞种于新的60mm培养皿。当生长密度在80-90％时，换新鲜培养基，加入终浓度为0.2μg/ml的秋水仙素，37℃继续培养1h。消化细胞，加入7ml37℃预热的KCl溶液，混匀后37℃水浴处理20min。加入1ml新鲜卡诺固定液预固定3min，1200rpm离心5min，弃上清后加入7ml固定液，37℃水浴固定40min。离心除去大部分固定液，留取少量重悬细胞，制作滴片，滴片后将载玻片放入75℃烘箱处理3h。之后将滴片放入胰酶消化液处理8s，放入生理盐水终止消化。Giemsa染色液染色5-10min，晾干玻片，在镜下观察统计分裂相(图5E)。结果显示，在挑选的诱导多能干细胞克隆中，绝大多数核型正常，可以被用于移植，分化等实验。

3.5嵌合小鼠实验：

为了进一步验证调节NCoR/SMRT蛋白复合体得到的诱导多能干细胞的全能性，我们进行了嵌合小鼠实验，观察这些细胞注射入囊胚后是否可以发育成正常的小鼠。我们消化iPSCs克隆并用差速贴壁的方法去除feeder细胞，用新鲜培养基重悬离心沉淀于管底的细胞并将其放置于冰上。断颈处死E3.5天的ICR孕鼠，冲洗输卵管得到囊胚，备用。使用Piezo电击透明带，将准备好的iPSCs按照约15个细胞/囊胚的量注入囊胚中。将注射过的囊胚在细胞培养箱培养2-3h后，移植入假孕的ICR雌鼠子宫内(10-15)个囊胚/鼠，单侧子宫移植)，缝合后继续饲养雌鼠至小鼠出生。观察新出生小鼠毛色来判断嵌合与否，也可通过观察虹膜来判断。具有黑色虹膜或是黑灰色毛皮的为嵌合小鼠。待到嵌合小鼠性成熟后，与纯的ICR异性合笼，如后代中产生纯黑色或是灰色的幼崽，则该株iPSC具有生殖系传递(图5F)。结果显示，我们得到的诱导多能干细胞具有全能性，可以发育为包括生殖系在内的所有细胞类型。

【实施例4】NCoR/SMRT在基因组上的结合位点

为了理解NCoR/SMRT抑制重编程的机理，我们首先进行了ChIP-seq实验，通过这个实验，我们找到被NCoR/SMRT结合的DNA序列，并进一步比对到基因组，进行分析，找到了NCoR/SMRT调节的靶基因。实验证实，重编程过程中，NCoR/SMRT可以结合到多能性基因上(图6)，抑制多能性基因的激活，从而限制重编程的发生。例如，NcoR/SMRT可以结合在与多能性非常相关的基因如Oct4，Nanog上(图6)，抑制这些关键基因的有效激活，形成重编程的一个障碍。这个过程主要发生于重编程后期。

具体实验操作如下：培养在10cm培养皿的细胞，加入终浓度为1％甲醛，室温固定10min，加入终浓度为125mM的甘氨酸终止反应。用预冷的含有PMSF的DPBS洗两遍细胞，加入含有PMSF的DPBS在冰上将细胞刮下，转移到50ml离心管，4℃，3000rpm离心5min。沉淀用预冷的PBS洗两遍，同样条件离心。洗时先加几毫升PBS，将沉淀吹匀后再加入与固定时总体积一致的PBS。最后PBS重悬细胞，分装在1.5毫升的离心管中，大约每管1000万细胞。离心去上清，沉淀在液氮中速冻，置于-80℃保存。

将细胞从-80℃取出，置于冰上。融化后每管加1mlLB1buffer(50mMHEPES-KOHpH7.5；140mMNaCl；1mMEDTApH8.0；10％甘油；0.5％NP-40；0.25％TritonX-100；蛋白酶抑制剂cocktail)，冰上裂解10min，1400g，4℃离心5min。弃上清，沉淀每管加1mlLB2buffer(10mMTris-HCl[pH8.0],200mMNaCl,1mMEDTA,0.5mMEGTA和蛋白酶抑制剂cocktail)，然后同样离心，弃上清，沉淀2管合并加750μlLB3buffer(10mMTris-HCl[pH8.0],100mMNaCl,1mMEDTA,0.5mMEGTA,0.1％sodiumdeoxycholate,0.5％N-lauroylsarcosine和蛋白酶抑制剂cocktail)，冰上裂解至少10min。裂解好的细胞用于超声破碎，使用Bioruptor(Diagenode)，使用高频超声40个循环，每个循环超声30秒ON，然后中间停顿45secondsOFF。超声完成后进行DNA电泳鉴定，如果片段大小在200-500bp左右大小则较为合适。超声完成后的样品加入TritonX-100，使其终浓度为1％。最大转速低温离心10min，取上清作杂交反应。取50μl上清留作Input。

IP使用的proteinA/G磁珠，在使用前需要经过处理，并先与抗体孵育结合。取30-40μl的磁珠，用磁座吸附，弃掉液体，重悬于200μlpH7.4的PBS中，加入相应抗体，吹匀，4℃旋转结合至少6小时。然后用磁座吸附磁珠，去PBS。取350微升上清加入到处理好的磁珠中，4℃旋转结合过夜。第二天用洗脱液(50mMHEPES-KOH[pKa7.55],500mMLiCl,1mMEDTA,1.0％NP-40and0.7％sodiumdeoxycholate)洗四次，TEbuffer(10mMTris-HCl[pH8.0],1mMEDTA[pH8.0]and50mMNaCl)洗一次依次洗磁珠。洗时先用磁座吸附磁珠，然后去掉上清，加入相应吹匀，4℃旋转5min。

磁珠洗完后，吸附去掉TEbuffer，每管加入210μl(Input样品加160ul)elutionbuffer(50mMTris-HCl[pH8.0],10mMEDTAand1.0％SDS)放于65℃30min.16000g室温离心1min，把上清转移到新EP管，放于65度超过6个小时解交联。然后加入8μlRNAse，37度2h。加入4μlPK酶，混匀后，55℃，在恒温震荡仪上1000rpm反应2h，之后加入400μl苯酚：氯仿：异戊醇(pH8.0)混匀，加到2mlHeavyPhaselocktube中，震荡充分后离心取上清。然后把上清加入到一个新EP管中，加入16μL5MNaCl，800μlEtOH,1.5μL的20μg/μLglycogen，-20度过夜沉淀。20,000g4℃离心10min来沉淀DNA。500μl80％EtOH洗涤沉淀。离心去上清，充分晾干。加入30μLDNase-RNase-free-H₂O溶解沉淀，然后直接用作real-timePCR分析或者送往广州市锐博生物科技有限公司进行后续的建库和测序。

测序结果出来后通过生物信息学软件比对到基因组，找到NCoR/SMRT结合的位点如图6所述，并进行了后续qPCR验证。结果证实，NcoR/SMRT不仅可以结合在与多能性非常相关的基因如Oct4，Nanog上，抑制这些关键基因的有效激活，形成重编程的一个障碍，还可以结合在一些细胞谱系特异性基因上，调节这些基因的表达。鉴于NcoR/SMRT是一个广泛被招募的共同作用因子，而且可以被转分化所需的关键转录因子招募，因此我们发现的NCoR/SMRT共抑制蛋白复合体极有可能也将在转分化中发挥重要功能，通过对其调节，可以有效的加速重编程或转分化进程，同时提高效率。

【实施例5】癌基因c-Myc编码蛋白可以招募NCoR/SMRT蛋白复合体结合到基因组

在NCoR/SMRT结合位点分析实验后，我们发现这些结合位点中有一些经典的转录因子结合域。其中包括重要致癌基因c-Myc的结合域，如图7右侧结构域分析结果。

为了进一步验证我们的发现，我们在293T细胞中过表达了NCoR/SMRT和c-Myc，然后通过免疫沉淀技术，将NCoR/SMRT蛋白从细胞裂解液中拉出来，然后再体外利用免疫印迹的方法检测和NCoR/SMRT相互作用的蛋白。我们发现Sox2，Oct4，c-Myc，Klf4四个重编程因子均可以和NCoR/SMRT结合，其中c-Myc最为强烈(图7左侧)。从而证明了我们的信息学分析结果，NCoR/SMRT可以和c-Myc结合在基因组同一位置，并且存在蛋白间的相互作用。因为c-Myc作为转录因子，可以招募共同调节因子，所以NCoR/SMRT是被c-Myc招募到基因组上，调节靶基因的表达的。

具体实验操作如下：首先是收取细胞，首先用PBS洗两遍，然后0.05％胰酶消化下来计数，约1000万细胞一管，离心去上清。然后使用TNEbuffer(50mMTris-HCl[pH7.5],150mMNaCl,0.5％NP-40,1mMEDTAandproteaseinhibitors)约300微升放于冰上20-30min或4度rotation30min使细胞充分裂解。然后4度离心5min12000rpm。转移沉淀到一个新EP管中，取约20μL上清作input。然后把上清与事先与抗体结合的proteinA/GDynabeads(Lifetechnologies)孵育。珠子(约50微升)在反应前应首先用磁座把上清吸干，然后加入PBS(可以加入0.01％-0.1％吐温20)200微升，室温旋转至少10min，可以延长时间。然后用磁座吸干上清，加入裂解液重悬珠子和抗体复合物，4度旋转5h或过夜(时间根据抗体性质等来决定)。然后使用TBS清洗液(20mMTris-HCl[pH7.6],137mMNaCl)200微升洗珠子5次，每次4度旋转十分钟，然后加入loadingbuffer沸水煮10min，westernblot分析。注意，westernblot时尽量选择使用和免疫沉淀不同种属的抗体来进行分析验证。

通过本实施例，我们证实NCoR/SMRT与癌基因c-Myc有密切的相互作用。作为一个癌基因，c-Myc在正常细胞向癌细胞的非正常转变中也将发挥重要的作用。被其招募的NCoR/SMRT对于癌症的发生也很有可能存在影响。HDAC3是NCoR/SMRT复合体发挥功能的原件，而调节HDAC活性的小分子VPA、TSA已经被用于癌症相关的科学研究和治疗。因此通过对NCoR/SMRT复合体的活性进行筛选，找到能调节NCoR/SMRT与c-Myc的相互作用的小分子，调节NCoR/SMRT的表达水平或活性的小分子，调节HDAC3表达水平或活性的小分子，有可能会在未来的癌症治疗中发挥作用。我们也希望对这一方面进行保护。

本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的各种改动或变形不脱离本发明的精神和范围，倘若这些改动和变形属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变形。