一种用于鉴定美洲黑杨优良无性系的专用引物及其鉴定方法

摘要

本发明公开了一种用于鉴定美洲黑杨优良无性系的专用引物及其鉴定方法，该方法针对经优良选育得到的43株无性系，开发出6对SSR高效鉴别引物。本发明的突出优点包括：利用6对美洲黑杨专用微卫星引物，进行43个优良无性系遗传鉴定，鉴定方法操作简单、快捷，鉴定的准确率高，为美洲黑杨优树鉴定提供了可靠技术手段。本发明将为美洲黑杨优良无性系的使用提供重要的监督检验方法，其应用前景广阔，具有很好的实用性，能够产生较好的经济效益和社会效益。

说明书

技术领域

本发明涉及美洲黑杨优良无性系的遗传鉴定方法，具体涉及一种用于鉴定美 洲黑杨优良无性系的专用引物及其鉴定方法。

背景技术

美洲黑杨(PopulusdeltoidesMarsh.)为杨柳科(Salicacae)杨属(Populus L.)黑杨(Aigeiros)树种。落叶乔木，树形高大，干形通直圆满，尖削度小， 分枝粗度中等，叶片大，心形，叶色鲜绿，观赏价值较高；美洲黑杨木材材质洁 白、柔软，易加工，可广泛用于包装用材、旋切用材和纤维用材，在解决胶合板 材、纸浆材、薪碳材以及生态造林等方面均发挥着重要作用。此外，美洲黑杨还 具有以下优点：①生长快，产量高；②耐旱、耐寒、耐热；③用途广泛，经济效 益好等。优良无性系的选用是速生、丰产的基础，因此美洲黑杨在我国长期的栽 培过程中，培育出了大量的无性系、品种，目前已广泛投入到了生产中。生产上， 为保持亲本的优良性状，多采用扦插苗进行造林。因此，美洲黑杨产业发展中， 建立准确可靠的无性系真实性鉴定技术，是一个急需解决的难题。

植物品种遗传真实性鉴定的关键是所依赖的技术手段。以往植物品种鉴别 所采用的方法主要是依据植物的形态特征。但植物品种间在形态上的差异，特 别是苗期的差异，往往并不十分显著。尤其对杨树这类世代周期长的物种，性 状的差异一般到了成熟期才能表现出来。自上世纪八十年代以来，现代分子标 记技术的应用，为植物新品种的鉴定提供了准确可靠的技术手段。分子标记是 以DNA为基础的标记技术，是指能反映生物个体或种群间基因组差异的特征 DNA片段，也称DNA指纹图谱。随着分子标记技术的发展，通过DNA指纹技 术鉴别生物个体已经成为一项成熟的技术，并在许多植物新品种鉴别中得到了 广泛应用。分子标记技术直接以植物DNA为分析对象，从根本上克服了环境的 影响，同时也不受基因表达的限制，在DNA水平上进行品种真实性鉴定不仅可 靠性高，而且大大提高了检测效率。常见的分子标记有RFLP(RestrictionFrag mentLengthPolymorphism限制片段长度多态性)、ISSR(Inter-simplesequenc erepeat简单重复序列)、RAPD(RandomamplifiedpolymorphicDNA随机扩 增多态性)、AFLP(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism，扩增片段长度 多态性)、SSR(SimpleSequenceRepeat，简单重复序列)等。应用分子标记 对植物品种进行真实性鉴定需要考虑以下因素：1.简便、快速，易于在实际检 验工作中推广使用；2.标记针对待检物种有高度特异性，使检测结果不受内源 和外源微生物或病原菌影响；3.标记扩增基因位点多态性高，可以利用较少的 引物组合达到较高的检测精度。考虑上述要求，微卫星标记是目前不同标记类 型中，用于植物品种真实性鉴定的最高效的分子标记。微卫星DNA也称简单重 复序列，是由长度为1-6bp串联重复序列组成，微卫星是基因组中变异最为迅 速的序列，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。微卫星标记是基于PCR 扩增为基础的标记，微卫星标记分析相对于基于分子杂交为基础的标记更为简 便、快速。同时微卫星引物是由待检物种的基因组序列开发而来，具有极高的 种属特异性，这样既使样品中含有不同的内源和外源微生物或病原菌污染，检 测结果也不会受到干扰，这一优点是RAPD或AFLP等这类随机标记所不具备 的。

美洲黑杨不同个体间同一位点的SSR重复次数存在差异，造成了个体间等 位位点的长度多态性。根据微卫星序列两端的互补序列来设计引物，通过PCR 反应扩增微卫星片段，由于微卫星串联重复数目不同，通过扩增片段的电泳分 离，可以获得不同微卫星位点的基因型以及基因型频率信息。

发明内容

发明目的：针对现有植物品种真实性鉴别技术中存在的不足，本发明的目 的是提供一种用于鉴定美洲黑杨优良无性系的专用引物，可真实、简便、快 速、可靠的鉴定美洲黑杨优良无性系。本发明的另一目的是提供一种利用上述 专用引物鉴定美洲黑杨优良无性系的方法。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种用于鉴定美洲黑杨优良无性系的专用引物，所述专用引物能高效鉴别 美洲黑杨的43个优良无性系，共包括6对引物，名称和序列如下：

NJFUP-poly01：

5’-GACACCGTTTCTTTTCTGAG-3’，5’-ACCAGATCTTCATCTTCCAA-3’；

NJFUP-poly02：

5’-TCGAATAGCTGGGATACTTC-3’，5’-TATCACCCGAACAAAAACTC-3’；

NJFUP-poly05：

5’-CCTTAGCCTTCTCACACAAC-3’，5’-GGTCTCCATTTTAGCTGTCA-3’；

NJFUP-poly06：

5’-GCCCAAACTCTTATTTGATG-3’，5’-TGGTGGAGGCTAGGATAGTA-3’；

NJFUP-poly07：

5’-ATTGCTCTTGCAGAAATCAT-3’，5’-GGATACCAAGTCATCGGTAG-3’；

NJFUP-poly10：

5’-AGAACTTGTGAGGCAGGTAA-3’，5’-AAAGCTCTCCCCTAACAAAG-3’。

一种用于美洲黑杨优良无性系遗传鉴定的方法：分别以待鉴定的美洲黑杨 样品的DNA和标准对照样的DNA为模板，在任一对专用引物对引导下进行PC R扩增获得产物，对产物进行毛细管电泳(ABI3730)，利用GeneMapper基因 型分析软件进行基因型比对，若检测到基因型不同则为不同品种；若相同，查 表4相应引物基因型出现的频率，计算待检样品与标准样品基因型相同的概 率；若相同概率达不到检测要求时，继续选取其他引物进行检测，直至相同概 率达到检测要求；其中，引物对选自权利要求1所述的6对专用引物，表4为说 明书中的表4。

所述的用于鉴定美洲黑杨优良无性系的方法，PCR反应体系为：模板DNA 30ng，0.27mMdUTPs，1.5μgBSA，上下游引物各10pmol，2UTaqDNA聚 合酶，3uL含20mMMgCl₂的10×buffer，加灭菌去离子水补充反应体积到 15uL；PCR反应条件为：95℃预变性3min；9个TouchDown循环：95℃变性 30s，59℃到50℃(每个循环退火温度下降1℃)退火30s，72℃延伸30s；然后 进行25个常规PCR循环：95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s；72℃延 伸5min。

上述方法中，是以抽样的方法，用43个美洲黑杨优良无性系的DNA模 板，在权利要求1的引物对引导下进行PCR扩增，采用ABI-3730和GeneMapper 分析软件进行基因型分析，获得不同品种在不同引物位点的基因型频率信息， 然后利用获得的基因型频率，选择引物，若待检样品和对照标准品种基因型在 任何一个微卫星引物位点上表现不同，即否定待检品种和标准对照是同一品 种，若所有选用引物在待检样品和对照标准品种中产生的基因型均一致，可查 表4的基因型频率，计算出待检样品和对照标准品种是同一品种的鉴定准确概 率。

有益效果：与现有技术相比，本发明的突出优点包括：利用6对美洲黑杨 专用引物，进行美洲黑杨优良无性系的遗传鉴定，鉴定方法操作简单、快捷， 鉴定的准确率高，检测结果可靠、稳定、准确，为美洲黑杨优良无性系鉴定提 供了可靠技术手段，应用前景广阔，具有很好的实用性，能够产生较好的经济 效益和社会效益。

附图说明

图1是引物NJFUP-poly02对标准样品与待检测样品基因组DNA扩增得到 的基因型(GeneMapper)；

图2是引物NJFUP-poly07对标准样品与待检测样品N2基因组DNA扩增得 到的基因型(GeneMapper)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

下述实例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所用微卫星引物 合成工作由上海捷瑞生物技术有限公司完成。

实施例1

用于鉴定美洲黑杨优树的引物组合物，为表1中的6对引物。

表1引物序列详情表

名称 上游引物(5’-3’) 下游引物(5’-3’) NJFUP-poly01 GACACCGTTTCTTTTCTGAG ACCAGATCTTCATCTTCCAA NJFUP-poly02 TCGAATAGCTGGGATACTTC TATCACCCGAACAAAAACTC NJFUP-poly05 CCTTAGCCTTCTCACACAAC GGTCTCCATTTTAGCTGTCA NJFUP-poly06 GCCCAAACTCTTATTTGATG TGGTGGAGGCTAGGATAGTA NJFUP-poly07 ATTGCTCTTGCAGAAATCAT GGATACCAAGTCATCGGTAG NJFUP-poly10 AGAACTTGTGAGGCAGGTAA AAAGCTCTCCCCTAACAAAG

该引物是基于杨树全基因组序列获得的大量微卫星序列开发而来，采用Mi sa&Primer3.0程序批量设计引物，引物的长度一般在16-22bp，GC含量在4 0％-60％之间，理论退火温度在50-65℃之间，产物预测长度在150-300bp之间， 引物内不出现二级结构。选取96对微卫星引物由上海捷瑞生物技术有限公司进 行了合成。利用合成的引物对美洲黑杨DNA进行PCR扩增，用1.5％的琼脂糖 凝胶电泳对这96对SSR引物进行了初步筛选。

利用GeneMapper基因型分析软件对毛细管电泳(ABI3730)后的结果进行 基因型分析，对每一引物具有相同扩增谱带的品种进行基因型合并，统计获得 的基因型数以及特异基因型。根据引物扩增位点的多态性信息对引物的鉴别能 力(PowerofDiscrimination)进行了估算：PD＝1-∑G_i²，式中G_i为该位点第i 个基因型的频率。根据毛细管电泳谱带和引物扩增位点的PD指数，从这96对 引物中进一步筛选出了6对电泳指纹清晰、基因型容易判定、鉴别能力高的引 物，分别是：NJFUP-poly01，NJFUP-poly02，NJFUP-poly05，NJFUP-poly06， NJFUP-poly07，NJFUP-poly10，用于美洲黑杨优良无性系的遗传鉴定。对应引 物的PD指数分别为：0.86，0.94，0.93，0.91，0.94，0.80，具体见表2。

表2引物多态性及鉴别能力

实施例2

利用实施例1筛选得到的6对引物对引自美国的43株美洲黑杨优良无性系 进行基因型检测。具体方法如下：

DNA提取参照Murry和Thomson(1990)的方法，从美洲黑杨叶片中提取。 然后以此为模板，利用筛选得到的6对引物在ABI-9700热循环仪上进行PCR扩 增。PCR的总反应体系为15uL，反应体系包括：模板DNA30ng，0.27mMdU TPs,1.5μgBSA，上下游引物各10pmol，2UTaqDNA聚合酶，3uL含20mM MgCl₂的10×buffer，加灭菌去离子水补充反应积到15uL；PCR反应条件为：9 5℃预变性3min；9个TouchDown循环：95℃变性30s，59℃到50℃(每个循环 退火温度下降1℃)退火30s，72℃延伸30s；然后进行25个常规PCR循环：9 5℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s；72℃延伸5min。

每对引物具备较高的鉴别能力，见表3。用每一基因型所含的个体数除以检 测个体的总数，就可以得到每一基因型在某一微卫星位点的基因型频率。如采 用引物i，某一个体基因型在检测个体中的出现频率为G_fi，则采用6对引物，该 个体与该个体用所有6个微卫星位点都扩增出相同指纹图的概率为：

$P=\underset{i=1}{\overset{6}{\Pi }}{G}_{fi},$

式中G_fi为某一个体用第i引物所揭示的基因型频率。本专利检测的所有个体用 相应引物扩增获得的基因型频率，详见表4。表中每一个体与对应引物单元格 内的数字为该个体利用相应引物扩增得到的基因型在43个个体中出现的频率。 从表中概率值可以看出，43株美洲黑杨优树个体在6个微卫星位点上都出现相 同基因型的概率是极低的。在实际检验过程中选用不同品种基因型频率较低的 引物，可以减少所需引物的数量。

表36对引物鉴别个体统计

表443株美洲黑杨优树个体对应引物基因型出现频率表

实施例3

利用实施例1筛选的引物，对2个(N1，N2)不确定是否为优树C100-3的 样品进行了鉴定。在鉴定过程中采用标准的C100-3的样品为对照。本实施例以 选用基因型频率较低的引物为原则，在满足鉴定要求的前提下选用最少的引物 简便有效地获得样品的准确信息，扩增反应体系及扩增条件同实施例2。

首先以提取待鉴定的美洲黑杨样品N1，N2的DNA和标准对照样C100-3 的DNA为模板，根据表4数据选择引物NJFUP-poly02对3份样品进行PCR扩 增，扩增结束后，2个待检样品在引物NJFUP-poly02扩增后得到2种基因型， 将其与对照的标准样品的基因型比对可以鉴别得到待检样品N2可能为C100-3 号优良单株(图1)，待检样品N1不是C100-3号优良单株，查表4可知C100- 3号在引物NJFUP-poly02鉴定下的准确率为98％，不能满足鉴定要求；进而用 引物NJFUP-poly07对鉴定结果继续验证，结果如图2所示，待检样品N2在利 用引物NJFUP-poly07扩增后得到的基因型与标样一致，根据表4可知引物NJF UP-poly02和NJFUP-poly07共同鉴别的准确率高达99.6％，达到鉴定要求(≥9 9.5％)，最终可以确定待检样品N2即为C100-3号优良单株，待检样品N1不是 C100-3号优良单株。

SEQUENCELISTING

<110>南京林业大学

<120>一种用于鉴定美洲黑杨优良无性系的专用引物及其鉴定方法

<130>100

<160>12

<170>PatentInversion3.3

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<212>DNA

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<212>DNA

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tcgaatagctgggatacttc20

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