褐藻多糖硫酸酯在制备预防和/或治疗下肢外周动脉血管病的产品中的应用

摘要

本发明公开了褐藻多糖硫酸酯在制备预防和/或治疗下肢外周动脉血管病的产品中的应用。本发明褐藻多糖硫酸酯应用于制备预防和/或治疗下肢外周动脉血管病的产品中。低分子量褐藻多糖硫酸酯(LMWF)来源于天然存在的海带之中，其易得、安全；能对下肢外周血管病有一定改善作用。含低分子量褐藻多糖硫酸酯的产品，口服可吸收，副作用少等优点，对防治下肢外周动脉血管病具有潜在的应用意义。

说明书

技术领域

本发明涉及一种褐藻多糖硫酸酯在制备预防和/或治疗下肢外周动脉血管病的产品中的应用。

背景技术

周围动脉疾病(peripheralarterialdisease,PAD)，特别是下肢周围动脉疾病是临床常见的一种疾病，发病人群很广。病理改变为动脉内粥样物质不断增多和继发血栓形成，引起动脉管腔狭窄、闭塞，使肢体出现慢性或急性缺血症状。病因尚未完全清楚，一般认为与年龄、吸烟、血脂、糖尿病、高脂血症、高血压、遗传因素、精神紧张等多种因素有关。临床表现以间歇性跛行、静息痛、难治性溃疡等症状为特点[Mascarenhas.JV.,etal.,Peripheralarterialdisease.EndocrinolMetabClinNorthAm.2014；43(1):p.149-66.]。流行病学调查显示：PAD在自然人群中发病率为3.08％；对PAD住院患者的回顾性分析，合并2型糖尿病占比54.1％，高血压病占比70.9％，高脂血症占比45.9％。糖尿病(diabetesmellitus,DM)患者PAD发病率较非DM者高20倍，8％的患者诊断为DM时即存在PAD，并随年龄、病程增加而增多，DM病程20年后其发病率可达45％[Chen,Q.,etal.,Patternsofdiseasedistributionoflowerextremityperipheralarterialdisease.Angiology.2015；66(3):p.211-8.]。目前，临床常用的治疗手段及存在的缺陷是：1)血管旁路术等手术治疗，预后好，但有的患者无法手术，以及出现术后再狭窄；2)血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)等促进血管新生的生长因子的治疗，但其价格昂贵，在机体内不稳定，极易被降解，半衰期短；3)血管内皮前导细胞等细胞水平的治疗，目前尚缺乏更多的临床证据证明其有效性；4)抗血小板聚集、抗凝、扩张血管等相关药物的治疗，可在一定程度上缓解症状，但长期服用，有出血等不良反应[Forsythe,RO.,etal.,Managementofperipheralarterialdiseaseandthediabeticfoot.JCardiovascSurg(Torino).2014；55(2Suppl1):p.195-206.]。

褐藻多糖硫酸酯(fucoidan)是从褐藻中分离得到的一类富含岩藻糖的天然硫酸多糖，其生物活性的强弱与来源种属、分子量、组成和结构等相关[Fitton,J.H.,etal.,Therapiesfromfucoidan；multifunctionalmarinepolymers.MarDrugs,2011；9(10):p.1731-60.]。从海带中提取出的低分子量褐藻多糖硫酸酯(lowmoleculeweightfucoidan,LMWF)是一种水溶性杂多糖，其主要成分为L-岩藻糖-4-硫酸酯。LMWF具有抗氧化、抗炎、抗凝血等作用。LMWF褐藻多糖硫酸酯及其片段来源广泛，其多种生物活性和天然产物的口服无毒性，使其在治疗骨性关节炎、肝纤维化、肾脏疾病及辐射损伤的保护等方面成为有希望的治疗药物。近期研究发现，LMWF能保护肾脏的缺血再关注损伤[Chen,J.,etal.,LowMolecularWeightFucoidanagainstRenalIschemia-ReperfusionInjuryviaInhibitionoftheMAPKSignalingPathway.PLoSOne,2013.8(2):p.e56224.]。课题组前期研究结果发现：1)LMWF通过特异性抑制凝血酶原的活性抗血小板聚集，另外，其对胶原、胰蛋白酶、ADP、5-HT引起的血小板聚集也有一定作用[Zhu,Z.,etal,Higherspecificityoftheactivityoflowmolecularweightfucoidanforthrombin-inducedplateletaggregation.ThrombRes.2010；125(5):419-26.]；2)LMWF通过降低氧化应激改善离体血管收缩的高反应性，通过激活血管内皮一氧化氮合成酶(eNOS)的活性，促进一氧化氮(NO)的释放，扩张肾上腺素(PE)诱导的离体血管的收缩[Cui,W.,etal.,Low-molecular-weightfucoidanprotectsendothelialfunctionandamelioratesbasalhypertensionindiabeticGoto-Kakizakirats.LabInvest.2014Apr；94(4):p.382-93.)。此外，文献报道，LMWF通过增强碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的活性，提高基质细胞衍生因子(SDF-1)的水平，促进血管新生，改善下肢肌肉等组织的血供[Luyt,CE.,etal.,Low-molecular-weightfucoidanpromotestherapeuticrevascularizationinaratmodelofcriticalhindlimbischemia.JPharmacolExpTher.2003；305(1):p.24-30.]。

发明内容

本发明的目的是提供一种褐藻多糖硫酸酯在制备预防和/或治疗下肢外周动脉血管病的产品中的应用。

本发明提供的褐藻多糖硫酸酯在制备预防和/或治疗下肢外周动脉血管病的产品中的应用。

上述的应用中，所述下肢外周动脉血管病为动脉粥样硬化、大动脉炎、血栓闭塞性脉管炎和糖尿病等所致的慢性动脉闭塞症中的至少一种，本领域内下肢动脉闭塞的外周血管病均包含在此。

上述的应用中，所述褐藻多糖硫酸酯的重均分子量为3-30KD，称为低分子量褐藻多糖硫酸酯。

上述的应用中，所述褐藻多糖硫酸酯中岩藻糖含量为25～35％，硫酸基含量为25～35％。

上述的应用中，所述褐藻多糖硫酸酯是从海带、马尾藻、裙带菜、羊栖菜、鼠尾藻、海黍子、昆布、泡叶藻和墨角藻中的至少一种中提取得到。

上述的应用中，所述褐藻多糖硫酸酯是从所述海带中提取得到的。

本发明中，所述海带(Laminariajaponica)为天然海带和/或人工养殖的海带。

本发明中，所述褐藻多糖硫酸酯的活性成分是L-褐藻糖-4-硫酸酯，还含有少量的半乳糖、甘露糖、木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、糖醛酸、蛋白质、K⁺、Na⁺、Ca²⁺、Mg²⁺等金属离子，它的结构特征是1,2-联结的聚α-L吡喃褐藻糖，而硫酸酯主要是在C-4位的羟基上。

上述的应用中，所述产品为药物和/或保健品。

上述的应用中，所述药物包含有效治疗量的所述褐藻多糖硫酸酯和药学上可接受的载体；所述药物可通过口服、注射、喷射、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体；所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂。

上述的应用中，所述药物的剂型为口服制剂或注射剂。

上述的应用中，所述药物的剂型为注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊或口服液。

本发明中，所述低分子量褐藻多糖硫酸酯的制备方法，包括如下步骤：取海带粉碎后用蒸馏水提取，得到提取液；将所述提取液用水透析，然后将透析液浓缩，加乙醇析出沉淀，所述沉淀为粗褐藻多糖硫酸酯，然后将粗褐藻多糖硫酸酯分离纯化，得到褐藻多糖硫酸酯；将褐藻多糖硫酸酯配成水溶液，加入抗坏血酸和过氧化氢降解，分离纯化，即得到低分子量褐藻多糖硫酸酯。

所述褐藻多糖硫酸酯的制备方法中，粗褐藻多糖硫酸酯分离纯化采用MgCl₂存在时乙醇沉淀，除去水溶性褐藻胶，然后滤液透析、浓缩后乙醇沉淀，干燥沉淀，得到褐藻多糖硫酸酯；

将褐藻多糖硫酸酯降解后的反应体系分离纯化采用自来水和蒸馏水透析，之后浓缩，冻干，得到低分子量褐藻多糖硫酸酯。

本发明具有以下优点：

低分子量褐藻多糖硫酸酯(LMWF)来源于天然存在的海带之中，其易得性与安全性；能对下肢外周血管病有一定改善作用。具体如下：1)LMWF可以改善下肢动脉闭塞的外周血管病大鼠足底血流；2)LMWF可以改善下肢动脉闭塞的外周血管病大鼠足底温度；3)LMWF减轻外周血管病大鼠腓肠肌和主动脉血管的病理改变。4)LMWF促进下肢缺血大鼠血管侧枝循环的建立和血管新生。含低分子量褐藻多糖硫酸酯的产品，口服可吸收，副作用少等优点，对防治下肢外周动脉血管病具有潜在的应用意义。

附图说明

图1为低分子量褐藻多糖硫酸酯(LMWF)对下肢动脉闭塞的外周血管病大鼠足底血流的影响。

图2为低分子量褐藻多糖硫酸酯(LMWF)对下肢动脉闭塞的外周血管病大鼠足底温度的影响。

图3为LMWF减轻下肢动脉闭塞的外周血管病大鼠腓肠肌的病理改变图(×100)；其中，A：正常对照组；B：模型组；C：褐藻多糖硫酸酯组；D：西洛他唑组。

图4为LMWF减轻下肢动脉闭塞的外周血管病大鼠主动脉血管病理改变图(×400)；其中，A：正常对照组；B：模型组；C：褐藻多糖硫酸酯组；D：西洛他唑组

图5为手术后Day28评价MRA，观察侧枝循环的建立和血管新生密度。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用的褐藻多糖硫酸酯为低分子量褐藻多糖硫酸酯(LMWF)，其按照下述方法制备得到：

1)提取褐藻多糖硫酸酯：

取海带粉碎后添加蒸馏水，沸水提取，提取液以硅藻土助滤过滤，滤液先以自来水流水透析一天，然后以蒸馏水透析一天，将透析液浓缩，向浓缩液中加乙醇至终浓度为75％沉淀，干燥沉淀，得粗褐藻多糖硫酸酯(简称粗品)。将粗品重溶于水，在0.05mol/LMgCl₂存在下20％乙醇沉淀除去水溶性褐藻胶，滤液透析、浓缩后75％乙醇沉淀，干燥后即得纯化的褐藻多糖硫酸酯。经分析，海带褐藻多糖硫酸酯主要由岩藻糖、半乳糖组成的硫酸多糖，其中岩藻糖含量为31％，硫酸基含量为32％，重均分子量180KD。

2)制备低分子量褐藻多糖硫酸酯：

取上述海带褐藻多糖硫酸酯50g配成质量浓度为1.5％的水溶液，在该溶液中加入终浓度为30mM的抗坏血酸和终浓度为30mM的过氧化氢，常温反应2小时。将该反应液用截留分子量为3600Da的透析袋依次在自来水和蒸馏水透析，之后浓缩，冻干，得到低分子量褐藻多糖硫酸酯样品。对其进行化学分析结果表明岩藻糖含量为30％，测定方法参照下述文献：[K.A.G.MichelDubois,J.K.Hamilton,P.A.Rebers,FredSmith,Colorimetricmethodfordeterminationofsugarsandrelatedsubstances,AnalyticalChemistry28(1956)350–357)，硫酸基含量为31％，测定方法参照下述文献：(Y.Kawai,N.Seno,K.Anno,Amodifiedmethodforchondrosulfataseassay，AnalyticalBiochemistry32(1969)314–321.]。

3)分子量测定

分析条件：ShiamdzuLC-20ATHPLC，TSKG3000PWxl色谱柱，流动相2.84％Na₂SO4溶液，流速1ml/min，检测器：示差检测器RID10A。结果：Mn：5765(number-average，数均)；Mw：7102(weight-average，重均)，Mw/Mn：1.23。重均分子量为3-30KD范围内的其它低分子量褐藻多糖硫酸酯，可通过调节上述步骤2)降解反应体系中抗坏血酸和过氧化氢的摩尔比获得。

实施例1、褐藻多糖硫酸酯在制备预防和/或治疗下肢外周动脉血管病的产品中的应用

材料与方法

1、实验动物的分组、给药与造模：

实验选取300～330g的Wistar大鼠，适应性饲养一周后，随机分组。实验分为模型组(生理盐水，灌胃)，药物治疗组(LMWF,100mg/kg，灌胃)，阳性药组(西洛他唑，25mg/kg，灌胃)。外周血管病(PAD)模型前两天给药，记为Day(-2)。月桂酸钠注射致外周动脉血栓栓塞模型在手术前五天给药，记为Day(-5)。

2、外周血管病(PAD)手术造模：

用6％水合氯醛，按0.006ml/kg剂量麻醉大鼠，碘伏擦拭手术部位，用刀片备皮，从大鼠腹股沟中点向膝盖方向做长约2.5cm的切口，棉签浸润PBS后，钝性剥离股动脉周围的脂肪组织和肌肉组织，弯镊和棉签配合钝性分离股动脉。从腹股沟韧带下，借助股动脉的分支，用弯镊牵拉出髂外动脉(以观察到双分支的髂内动脉为标志)，双线双节扎；股动脉远端分支为股深动脉和肤浅动脉，在此分叉处，双线双结扎；用电凝笔去除两个结扎点中间的动脉及其分支，造成下肢动脉严重闭塞的外周血管病模型。用4-0缝合线缝合，青霉素肌肉注射3天，预防感染。

3、月桂酸钠注射致外周动脉血栓栓塞模型：

禁食12h，6％水合氯醛(0.006ml/g)麻醉。从大鼠腹股沟中点向膝盖方向做长约2.5cm的切口，棉签浸润PBS后，钝性剥离股动脉周围的脂肪组织和肌肉组织，弯镊和棉签配合钝性分离股动脉，近心端用动脉夹阻断血流，向远心端注入0.1mL月桂酸钠溶液(5g/L)，医用蛋白胶封闭穿刺点，脱脂棉球按压止血，15min后检查无活动性出血即用4-0缝合线缝合皮肤。术后给予青霉素40万单位/天，前肢肌肉注射三天预防感染。

4、测大鼠足底血流和温度：

用10％水合氯醛麻醉大鼠，将大鼠麻醉后以仰卧位放置在加热板上，加热板温度设定为37℃以保证受试动物体温的恒定，将探头(Probe407-1，光纤距离0.22mm，Perimed，Sweden)插在探头座上通过生物胶粘贴在大鼠下肢足底表面第一肉垫和第五肉垫连线的中点，平衡10分钟，皮肤血流通过单点激光多普勒血流仪测定(Single-pointlaserDopplerflowmetry，LDF，PerifluxSystem5000,780nmlaserdiode，Perimed，Sweden)记录3分钟。激光多普勒血流仪检测的血流量是红细胞的数量乘以其平均速度的值，单位是自定义的arbitraryunits(AU)。测完血流，再测加压阻断后反应性充血情况(PORH)，观察足底血流的变化曲线。用红外线温度计测定足底温度，测定位置同血流仪探头放置位置(第1,5肉垫的连线中点)左右肢足底交替测量，每只鼠记录5次结果。

5、磁共振血管造影(magneticresonanceangiography,MRA)：

大鼠称重，尾静脉注射造影剂钆双胺注射液(0.2ml/kg)。接通气麻装置，腹卧位放于磁共振固定板上，进行磁共振血管造影。磁共振血管造影的参数设置：血管造影实验包含二维时间飞跃法梯度回波序列，此方法利用了梯度场施加于全部三个方向而产生的流动补偿，脉冲序列重复时间和回波时间分别为28毫秒和4.5毫秒，扳转角为76°；捕获了层厚为0.55mm的150轴向切割碎片。矩阵尺度200×256，分辨率0.49×0.49m2。平均值为2且总数据采集时间为18min。造影完，取出动物，等苏醒后放入笼内。

6、HE染色和胶原染色

HE染色：取4％甲醛液固定的心室组织，按常规石蜡切片过程进行梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋，7μm厚度切片。石蜡切片用二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化、HARRIS苏木精染色、0.5％盐酸分色、0.5％-1％氨水快速蓝化、0.5％伊红水溶液染色、梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片，37℃，24h烘片。显微镜下观察，细胞核被苏木精(带阳离子，呈碱性)染成紫蓝色，多数细胞质及非细胞成分被伊红(带阴离子，呈酸性)染成粉红色。每组选3只大鼠左心室做石蜡切片。

7、统计学方法

采用SPSS统计软件对所得数据进行处理。数据均以均数±标准差(X±SD)表示，两组数据进行独立样本t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

实验结果：

1、LMWF对下肢动脉闭塞的外周血管病大鼠足底血流的影响

首先，观察了LMWF对下肢动脉闭塞的外周血管病大鼠足底血流的影响。如图1所示，Day(-2)给药，Day0造模，造模后，缺血肢血流明显减少。通过多普勒血仪测定足底血流发现：与模型组相比，100mg/kg/Day剂量的LMWF和25mg/kg的西洛他唑促进缺血部位血流的恢复，特别是在缺血初期(Day3)和后期(Day28)，LMWF治疗组明显优于模型组(Day3,^*P<0.05代表LMWF与模型组的统计学差异，^#P<0.05代表西洛他唑与模型组的统计学差异；Day28，^**P<0.01代表LMWF与模型组的统计学差异，^##P<0.01代表西洛他唑与模型组的统计学差异)。由此可见：本发明LMWF对于缺血性PAD，可改善组织缺血状态，该药理作用与临床上治疗PAD的西洛他唑的药效相当。研究表明，西洛他唑通过增加外周血中内皮前导细胞(EPCs)数量，上调缺血部位肌肉的粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和血管内皮生长因子(VEGF)，促进血管新生，改善缺血部位血供[Biscetti,F.,etal.,CilostazolpromotesangiogenesisafterperipheralischemiathroughaVEGF-dependentmechanism.InternationalJournalofCardiology,2013；167(1):p.910–916]。

2、LMWF对下肢动脉闭塞的外周血管病大鼠足底温度的影响

如图2所示，测试足底温度时选用大鼠的缺血肢/正常肢的比值作为指标，在手术造模前，该比值为1，即足底温度没有差异。造模当天(Day0)，给药组与模型相比，无明显差异。而此后每周一次的评价，均发现：西洛他唑组缺血肢/正常肢的温度比值明显高于模型组(^#P<0.05，^##P<0.01代表西洛他唑与模型组的统计学差异)，本发明LMWF仅在Day21，与模型组无明显差异，其余时间段，足底温度恢复情况均明显高于模型组(^*P<0.05,^**P<0.01代表LMWF与模型组的统计学差异，n＝3)。该结果与足底血流的趋势是一致的，与NorihisaIshiwata等的研究基本一致，模型组缺血肢足底温度均缓慢恢复，给药组优于模型组[NorihisaIshiwata,etal.,NT-702(parogrelilhydrochloride,NM-702),anovelandpotentphosphodiesteraseinhibitor,improvesreducedwalkingdistanceandloweredhindlimbplantarsurfacetemperatureinaratexperimentalintermittentclaudicationmodel.LifeSciences,2007；81:970–978]。

3、LMWF减轻外周血管病大鼠腓肠肌和主动脉血管的病理改变

为了检测LMWF对下肢动脉血管和腓肠肌结构是否有影响，对石蜡包埋的腓肠肌和主动脉血管组织切片进行HE染色。图3为LMWF减轻下肢动脉闭塞的外周血管病大鼠腓肠肌的病理改变。HE染色显示正常组大鼠下肢肌纤维呈多角形，肌纤维间存在一定的间隙，造模组大鼠缺血下肢肌纤维显著肿胀、变圆。出现肌肉结构破坏，期间大量炎性细胞浸润，后肢的肌肉出现萎缩，表现为肌间隙明显增加。LMWF组大鼠能够减轻上述病变，起到改善下肢缺血的作用。西洛他唑组大鼠肌纤维多角形，肌纤维间隙明显减小，无炎性细胞浸润。图4为LMWF减轻下肢动脉闭塞的外周血管病大鼠主动脉血管病理改变。光镜下，正常组大鼠主动脉内膜光滑，内皮细胞完整，且排列紧密，内膜无增厚，平滑肌细胞排列规则，弹力纤维排列整齐，未见浸润的炎性细胞等病理改变。模型组主动脉内膜排列不齐，内皮细胞有脱落，主动脉平滑肌细胞增生肥大且排列紊乱。平滑肌细胞和弹力纤维排列紊乱，内膜增厚，内皮细胞表面可见浸润的炎性细胞。与模型组相比，LMWF组平滑肌细胞排列整齐，内皮细胞完整，内膜增厚减轻，见少量炎性细胞浸润，说明褐藻多糖硫酸酯具有保护缺血下肢动脉血管的作用。西洛他唑组弹力纤维不整齐，内膜增厚比模型组程度轻，可见少量炎性细胞浸润。

4、LMWF促进下肢缺血大鼠血管侧枝循环的建立和血管新生

图5为手术后Day28通过MRA评价侧枝循环的建立和血管新生密度[KarolienJaspers,etal.Backes.AutomatedMultiscaleVesselAnalysisfortheQuantificationofMRAngiographyofPeripheralArteriogenesis.JMagneticResonanceImaging35:379–386(2012)，Soo-KyoungChoi,etal.ChronicInhibitionofEpidermalGrowthFactorReceptorTyrosineKinaseandExtracellularSignal-RegulatedKinases1and2(ERK1/2)AugmentsVascularResponsetoLimbIschemiainType2DiabeticMice.TheAmericanJournalofPathology,180(1),2012]，并用Quantityone4.6.2统计。由图可见，在阻断动脉的外侧，有造影显现，说明有侧枝循环的建立和血管新生。选定相同面积，计算缺血肢/正常肢的比值，结果显示，给药组：LMWF组和西洛他唑组侧枝循环的建立和血管新生明显优于模型组(^#P<0.05代表西洛他唑与模型组的统计学差异，^*P<0.05代表LMWF与模型组的统计学差异)，与足底血流和足底温度的结果相一致。

上述研究显示，长期使用LMWF治疗能对下肢动脉闭塞的外周血管病起到保护作用。

本发明研究发现：

(1)由图1可知，证明本发明LMWF能善下肢动脉闭塞的外周血管病大鼠足底血流。

(2)由图2可知，证明本发明LMWF能改善下肢动脉闭塞的外周血管病大鼠足底温度。

(3)由图3、4可知，说明本发明LMWF减轻外周血管病大鼠腓肠肌和主动脉血管的病理改变。

(4)由图5可知，本发明LMWF促进下肢缺血大鼠血管侧枝循环的建立和血管新生。

综上，本发明LMWF能对下肢外周血管病大鼠有一定改善作用。LMWF来源于天然存在的海带之中，其易得性与安全性均有利于其作为一种潜在的临床治疗药物，预防或治疗下肢外周动脉血管病。