N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶AiiO的高效生产方法及检测

摘要

本发明涉及N-酰基高丝氨酸内酯(AHL)酰基转移酶AiiO的高效生产方法及检测，通过构建能够表达AHL酰基转移酶的基因重组菌，对该酰基转移酶利用复合自诱导培养基及变温分批发酵方式进行发酵罐水平的高效发酵，得到高酶活力的发酵液及高比活力的AHL酰基转移酶；利用Quantity？one软件对蛋白定量分析，能够快速地对发酵过程不同时间细胞内AHL酰基转移酶总浓度进行准确定量；同时本发明还构建了专用于该酶活力检测的体系，实现准确快速检测酶活力的目的。本发明可以降低AHL酰基转移酶的生产成本，实现AHL酰基转移酶的高效生产，同时对发酵过程中AHL酰基转移酶的浓度及纯化后AHL酰基转移酶的活力进行准确快速的测定，该酶可作为一种新型的病害防治酶制剂使用。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程与发酵工程领域，具体地涉及N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶AiiO的高效生产方法及检测。

背景技术

细菌中存在群体感应(quorumsensing,QS)调节系统，细菌能够分泌特定的信号分子并感应其浓度，当信号分子达到一定阈值时，能够与信号分子受体蛋白相结合，进而启动群体感应通路下游多种基因的表达，使菌体适应环境中的变化。革兰氏阴性细菌中典型的一类信号分子为N-酰基高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserinelactones，AHL)，AHL介导的QS系统被证实参与多项细菌生物学功能的调控，包括生物发光、抗生素的合成、群集、生物膜的形成和毒力因子的产生等。

由于多种革兰氏阴性病原细菌的致病性均受QS系统的调控，因此，通过降解AHL实现群体感应猝灭，能够有效干扰病原菌QS系统，破坏其参与调控的毒力基因表达，该方法有望成为一种新型的微生物病害防治策略。研究发现，细菌能够产生群体感应猝灭酶，主要包括酰基高丝氨酸内酯酶和AHL酰基转移酶。其中，AHL酰基转移酶能够作用于AHL中与内酯环相连的酰基侧链，切断酰胺键，使信号分子失去活性。该类酶的合成与生产对于开发新型的病原菌防治药物具有重要意义。目前的研究主要集中于酰基高丝氨酸内酯酶的酶学性质及应用^[1～2]对于AHL酰基转移酶的高效发酵生产及检测则鲜有报道。

发明内容

为弥补现有技术的不足，本发明提供了一种N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶AiiO的高效生产方法及检测方法。本发明通过构建一种能够表达AHL酰基转移酶的基因重组菌，对该酰基转移酶利用本发明的复合自诱导培养基及变温分批发酵方式进行发酵罐水平的高效发酵，得到高酶活力的发酵液及高比活力的AHL酰基转移酶；利用Quantityone软件对蛋白定量分析，以已知浓度的纯化样品作为定量依据，能够快速地对发酵过程不同时间细胞内AHL酰基转移酶总浓度进行准确定量；同时本发明还构建了专用于该酶活力检测的体系，实现准确快速检测酶活力的目的。为解决上述问题，本发明采用以下技术方案，N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶AiiO的高效生产方法及检测包括以下步骤：

S1：构建含aiiO基因的重组表达载体；

S2：将重组表达载体转化大肠埃希氏菌得到重组菌；

S3：利用重组菌进行发酵罐高密度发酵，培养过程中采用复合自诱导培养基，获得重组蛋白AiiO；利用QuantityOne软件，测定发酵过程中不同时间细胞内AiiO全蛋白表达量；

S4：利用镍亲和层析对重组蛋白AiiO进行纯化；

S5：建立酶活力测定体系，用反相高效液相色谱测定AHL酰基转移酶活力；

高密度增殖培养基组成为：Na₂HPO₄2～5g/L，KH₂PO₄2～5g/L，NH₄Cl2～4g/L，Na₂SO₄0.5～1g/L，MgSO₄·7H₂O0.3～0.8g/L，FeCl₃·6H₂O0.01～0.05g/L，葡萄糖4～6g/L，六水琥珀酸钠2～4g/L，二水柠檬酸钠0.2～0.4g/L；

复合自诱导培养基组成为：蛋白胨10～20g/L，酵母粉5～10g/L，Na₂HPO₄2～5g/L，KH₂PO₄2～5g/L，NH₄Cl2～4g/L，Na₂SO₄0.5～1g/L，MgSO₄·7H₂O0.3～0.8g/L，FeCl₃·6H₂O0.01～0.05g/L，甘油4～25mL，葡萄糖0.3～1g/L，α-乳糖1～3g/L，六水琥珀酸钠3～8g/L，二水柠檬酸钠0.2～0.4g/L。

进一步的，所述步骤S1具体为：将小麦苍白杆菌接菌至LB培养基中，30℃培养12h，提取基因组，PCR扩增aiiO；用限制性内切酶NdeⅠ和EcoRⅠ双酶切纯化后的PCR扩增产物和载体pET-28a(+)，将酶切产物和载体骨架连接。

进一步的，所述步骤S2具体为：将步骤S1得到的连接产物热击转化大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)感受态细胞，经培养及鉴定得到重组菌。

进一步的，所述步骤S3具体为：将重组菌接种于高密度增殖液体培养基中，37℃，220rpm振摇培养过夜；取重组菌过夜培养液，以1‰接种于复合自诱导培养基中，发酵罐装液量为总容积的60％～75％，转速300～500rpm，通气量3～4L/min，以二甲基硅油为消泡剂，消泡剂用量为0.3‰。OD₆₀₀达到0.8～1.0，将发酵温度降低至25～30℃。控制相对溶氧20％～30％左右，通过发酵获得重组蛋白AiiO。利用Quantityone软件分析SDS-PAGE电泳胶中蛋白电泳条带的光密度值，以分子筛纯化蛋白的上样量为参照，对发酵过程中不同时间的全蛋白表达量进行定量。

作为本发明一个优选的实施例，所述的高密度增殖培养基组成为：Na₂HPO₄3.55g/L，KH₂PO₄3.4g/L，NH₄Cl2.68g/L，Na₂SO₄0.71g/L，MgSO₄·7H₂O0.49g/L，FeCl₃·6H₂O0.027g/L，葡萄糖5g/L，六水琥珀酸钠2.5g/L，二水柠檬酸钠0.3g/L。

作为本发明一个优选的实施例，所述的复合自诱导培养基组成为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，Na₂HPO₄3.55g/L，KH₂PO₄3.4g/L，NH₄Cl2.68g/L，Na₂SO₄0.71g/L，MgSO₄·7H₂O0.49g/L，FeCl₃·6H₂O0.027g/L，甘油20ml，葡萄糖0.5g/L，α-乳糖2g/L，六水琥珀酸钠5.4g/L，二水柠檬酸钠0.3g/L。

进一步的，本发明构建的酶活力测定体系：信号分子C6-HSL溶液与AiiO蛋白的质量浓度比为99.625:1，缓冲液为100mmol/LTris-HCl溶液，pH7.0。反应条件为30℃反应15min，用反应体系总体积10％的乙腈终止反应。紫外检测波长为190nm，流动相：乙腈/水(30/70)；流速：0.5mL/min。

采用本发明的复合自诱导培养基及变温分批发酵方式进行发酵培养，其中利用乳糖诱导代替常规的IPTG诱导手段进行异源蛋白表达，发酵温度由37℃降低至25℃，可高效表达一种新型的AHL酰基转移酶，酶比活力高达19.24±3.71U/mg，按发酵罐发酵并纯化后得到AHL酰基转移酶计算，酶活力为2.62U/mL发酵液。由于本发明中对酶活力的定义与张美超等人^[3]不同，张美超等人对酶活力定义为在30℃下1min分解1nmol信号分子所需的酶量被定义为一个酶活单位。因此，按其提出的酶活力单位进行推算，本发明得到的AHL酰基转移酶的比活力约为其33倍。本发明中，在发酵罐中经乳糖诱导得到的发酵液的酶活力是摇瓶中经IPTG诱导得到的发酵液酶活力的7.6倍。

利用本发明中应用Quantityone软件对蛋白定量分析的方法，以已知浓度的纯化样品作为定量依据，能够快速地对发酵过程不同时间的AHL酰基转移酶(细胞全蛋白)浓度进行准确定量，而现有技术中并没有能够对发酵过程不同时间的AHL酰基转移酶(细胞全蛋白)浓度进行定量的方法。

利用本发明提供的酶活力测定方法及建立的酶活力测定用反应体系，可以比周志刚等人^[4]的同类酶活力测定方法更为准确快速地测定AHL酰基转移酶的活力。列举文献中的方法需要多于24h的检测时间才能测定酶活力，而本发明仅需要酶与底物反应15min，进而利用高效液相色谱分析15min，即可测定酶活力。

本发明可以降低AHL酰基转移酶的生产成本，实现AHL酰基转移酶的高效生产，同时对发酵过程中AHL酰基转移酶的浓度及纯化后AHL酰基转移酶的酶活力进行准确快速的测定，该酶可作为一种新型的病害防治酶制剂使用。

附图说明

图1为aiiO基因的PCR扩增；其中，M：DNAmarkerDL2000；泳道1：aiiO基因；

图2转化后菌落质粒提取的电泳检测；其中，M：SupercoiledDNAMarker；泳道1：质粒pET-28a；泳道2～3：提取质粒；

图3质粒双酶切后电泳检测；其中，M：DNAmarkerDL10000；泳道1：质粒pET28a-aiiO双酶切；

图4AiiO蛋白纯化总图；其中，M：BluePlusⅡProteinMarker；1：未诱导全蛋白；2：诱导全蛋白；3：诱导破碎前上清；4：诱导破碎后沉淀；5：诱导破碎后上清；6：镍柱纯化；7：酶切后；8：分子筛纯化；

图5全蛋白检测电泳图；其中，M：BluePlusⅡProteinMarker；1：4h全蛋白；2：8h全蛋白；3：12h全蛋白；4：16h全蛋白；5：20h全蛋白；6：24h全蛋白；7：分子筛纯化样品；

图6发酵过程分析；其中，■-OD600；▽-AiiO全蛋白浓度；▲-甘油浓度；○-pH；

图7AiiO蛋白的活性检测；其中，A：紫色视杆菌CV026+AHL；B：紫色视杆菌CV026+AHL+AiiO蛋白纯化溶液；

图8C6-HSL与AiiO、灭活的AiiO反应15min的色谱图；其中A为1mmol/LC6-HSL与2μg/mL灭活的AiiO反应15min的色谱图；B为1mmol/LC6-HSL与2μg/mLAiiO反应15min的色谱图；图中，1、2：Tris-HCl溶液峰；3：信号分子C6-HSL峰。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例中所用载体及菌株如下：pET-28a(+)、大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)DH5α、大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)购自TaKaRa公司，小麦苍白杆菌(Ochrobactrumtritici)购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)编号1.8739；检测菌株紫色视杆菌CV026(ChromobacteriumViolaceum026)^[5]：公众可从中国农业科学院饲料研究所获得。

实施例中所用酶类及其他生化试剂如下：限制性内切酶及连接酶购自TaKaRa公司，N-己酰基高丝氨酸内酯(C6-HSL)购自Sigma公司。基因组提取试剂盒、切胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、PCR纯化试剂盒购自TaKaRa公司。NiSepharoseHighPerformance填料，Cat.No.17-5268-01，购自GE公司。

实施例中所涉及的培养基：

LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH7.0。

高密度增殖培养基：Na₂HPO₄3.55g/L，KH₂PO₄3.4g/L，NH₄Cl2.68g/L，Na₂SO₄0.71g/L，MgSO₄·7H₂O0.49g/L，FeCl₃·6H₂O0.027g/L，葡萄糖5g/L，六水琥珀酸钠2.5g/L，二水柠檬酸钠0.3g/L。

复合自诱导培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，Na₂HPO₄3.55g/L，KH₂PO₄3.4g/L，NH₄Cl2.68g/L，Na₂SO₄0.71g/L，MgSO₄·7H₂O0.49g/L，FeCl₃·6H₂O0.027g/L，甘油20mL，葡萄糖0.5g/L，α-乳糖2g/L，六水琥珀酸钠5.4g/L，二水柠檬酸钠0.3g/L。

实施例1、重组菌的制备

一、提取小麦苍白杆菌基因组

苍白杆菌接菌至LB培养基中，30℃培养12h。取l-3ml菌液，使用细菌基因组提取试剂盒提取基因组DNA，-20℃保存备用。

二、PCR扩增

以步骤一提取的基因组DNA为模板，用aiiO-F和aiiO-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。PCR反应条件：98℃5min；98℃30s，58℃30s，72℃1min，30个循环；72℃，10min。

aiiO-F：GGGAATTCCATATGATGAAATCCCATGAAAT

aiiO-R：CGGAATTCTTAAGCCGTGCAGTC

扩增得到810bp左右的片段(见图1)。

三、重组表达载体的构建

1、将PCR扩增产物进行琼脂糖电泳，切胶回收810bp左右的条带。

2、用限制性内切酶NdeI和EcoRI双酶切纯化后的PCR扩增产物，回收酶切产物。

3、用限制性内切酶NdeI和EcoRI双酶切载体pET-28a(+)，回收载体。

4、将步骤2的酶切产物与步骤3的载体骨架连接。

四、重组菌的构建

1、用上述连接产物热击转化大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)感受态细胞。

2、挑取阳性克隆过夜液体培养，提取质粒进行电泳检测(图2)，泳道2对应质粒大小正确。对大小正确的质粒进行双酶切(图3)，可见pET28a-aiiO质粒被EcoRI、NdeI双酶切后存在810bp左右的aiiO片段。将该质粒送至宝生物公司进行测序，根据测序结果，对重组质粒pET28a(+)-aiiO的结构描述如下:在载体pET28a(+)的NdeI和EcoRI酶切位点之间插入了序列自aiiO5′末端第1至810位核甘酸所示的DNA。

3、将重组菌中的一株命名为大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)-pET28a(+)-aiiO。

实施例2、重组蛋白AiiO的高密度发酵与分离纯化

一、重组菌在摇瓶水平上的发酵及AiiO蛋白表达分析

1、将重组菌接种于50mLLB液体培养基(卡那霉素配制浓度为50mg/mL，LB培养基中加其终浓度为2‰)中，37℃，220rpm振摇培养过夜。

2、取重组菌过夜培养液，以3％接种于1LLB培养基(卡那霉素加入浓度与步骤1中相同)中，同时进行两组实验，分别作为样品组和对照组，37℃，220rpm振荡培养，至OD₆₀₀＝0.6-0.8。

3、在样品组培养液中加入诱导剂IPTG至终浓度为0.5mmol/L，30℃，220rpm继续培养8h左右。

4、将诱导和未诱导的培养液分别在4℃，6000rpm条件下离心15min，分别收集上清液和细胞沉淀。将细胞沉淀重新悬浮于缓冲液(20mmol/LTris-HCl(pH8.0)、150mmol/LNaCl)中，超声破碎后于4℃，12000rpm条件下离心30min，收集上清液。

5、将步骤4得到的上清液进行亲和层析。层析柱于冰浴条件下振荡20min后，弃去过柱液体。在层析柱中分两次共加入上样体积2-3倍的Washingbuffer(WB)，弃去过柱液体。再向层析柱中加入15mLElutionbuffer(EB)，收集过柱液体。

Washingbuffer(WB)：20mmol/LTris-HCl(pH8.0)、150mmol/LNaCl、30mmol/L咪唑。

Elutionbuffer(EB)：20mmol/LTris-HCl(pH8.0)、150mmol/LNaCl、300mmol/L咪唑。

6、切除表达蛋白上组氨酸标签(此步骤通常用于分析蛋白结构时使用，当目的为获得具有活性的蛋白溶液时，该步骤可以省略)。向步骤5得到的过柱液体中加入Thrombin酶(购自sigma公司，用无菌水配制成100U/ml的储存液，按5U/mg表达蛋白量加入)进行酶切。20℃水浴处理12h，SDS-PAGE检测酶切结果。

7、将步骤6中得到的蛋白溶液进行凝胶过滤层析(此步骤可以省略)。洗脱液中含有终浓度为20mmol/LTris-HCl和150mmol/LNaCl。压强为0.4MPa，流速为0.7mL/min。根据洗脱峰谱图，收集对应的峰的样品进行SDS-PAGE检测分析。

8、利用超微量分光光度计(购自英国柏楉(Biochrom)有限公司)测定纯化蛋白浓度。

二、重组菌在发酵罐水平上的高密度发酵及AiiO蛋白表达分析

1、将重组菌接种于10mL高密度增殖液体培养基(卡那霉素配制浓度为50mg/mL，LB培养基中加其终浓度为2‰)中，37℃，220rpm振摇培养过夜。

2、取重组菌过夜培养液，以1‰接种于乳糖自诱导培养基(卡那霉素加入浓度与步骤1中相同)中，利用瑞士比欧生物工程公司发酵罐KLF2000(3.7L)，装液量2.6L，转速300rpm，通气量3L/min，以二甲基硅油为消泡剂，消泡剂用量为0.3‰。OD₆₀₀达到0.8左右，将发酵温度降低至25℃。控制相对溶氧20％左右。

3、蛋白纯化具体步骤与实施例2一、重组菌在摇瓶水平上的发酵及AiiO蛋白表达分析中步骤4～8相同。

蛋白纯化见图4，与未诱导的菌体蛋白表达量相比，经乳糖自诱导后，能够有效表达AiiO蛋白；泳道3、4、5相比，说明目的蛋白存在于细胞内且主要为可溶性蛋白。经镍柱亲和层析后，得到纯化的目的蛋白。经Thrombin酶酶切后，成功切除组氨酸标签。凝胶过滤层析可得到纯化的目的蛋白(约30kD)，条带大小与预期相符。

4、发酵过程中不同时间全蛋白表达量的测定按如下步骤进行：每隔4h定量取50mL发酵液，6000rpm离心后用2.5mL20mmol/LTris-HCl、150mmol/LNaCl缓冲液悬浮菌液并超声破碎，超声破碎条件为40％功率，工作2s，停3s，每次5min，共3次进行破碎。进行SDS-PAGE电泳：不同时间全蛋白样品与5倍LoadingBuffer混匀并煮沸5min后上样，上样量为2μL；分子筛纯化样品稀释5倍后与5倍LoadingBuffer混匀并煮沸5min后上样，上样量为7μL。蛋白电泳条带光密度值利用Quantityone软件分析，根据分子筛纯化样品的浓度(5938μg/mL)和上样量，对发酵过程中不同时间的全蛋白表达量进行定量。发酵过程中不同时间的全蛋白SDS-PAGE电泳图见图5，可见随时间增加，发酵液中全蛋白浓度逐渐增加。

5、发酵过程中甘油浓度测定利用北京普利莱(APPLYGEN)基因技术有限公司的甘油测定试剂盒进行。标准曲线公式：y(mmol/L)＝0.5717x(OD600)-0.0052，R2＝0.9989。

发酵罐分批发酵进程见图6，菌体浓度随发酵时间增加逐渐趋于饱和，当菌体浓度趋于饱和时停止发酵。24h全蛋白浓度达到510.30mg/L，甘油浓度剩余5.62g/L。

实施例3、重组蛋白AiiO酶活力测定

1、AiiO蛋白的活性检测用指示菌紫色视杆菌C.Violaceum026进行，用无菌刀片从LB平板培养基中间切割下一条，将整个平板分为两部分。平板上涂布过夜培养的紫色视杆菌菌液，左右两侧各粘附无菌滤膜一张，对照实验在无菌滤膜上滴加80μM信号分子C6-HSL溶液10μL，另一侧无菌滤膜上滴加80μM信号分子C6-HSL溶液和200μg/mLAiiO蛋白纯化溶液混合反应液(10μL，v/v1:1，30℃反应4h)。滤膜周围紫色区域半径越小，则AiiO酶活性越高。

通过上述方法检测纯化后的AiiO蛋白活性，结果如图7所示，AiiO蛋白能够成功降解C6-HSL信号分子，使得滤膜周围不显紫色。

2、AiiO蛋白酶活力的定量检测利用高效液相色谱分析信号分子的降解程度，色谱柱为依利特SinoPakC18柱，高效液相色谱仪型号为岛津LC-10AvpPlus，紫外检测波长为190nm，流动相：乙腈/水(30/70)；流速：0.5mL/min。酶活力测定所用反应体系为：AiiO蛋白浓度为2μg/mL，信号分子C6-HSL溶液浓度为1mmol/L，缓冲液为100mmol/LTris-HCl溶液(pH7.0)；反应条件为30℃反应15min，用反应体系总体积10％的乙腈终止反应，用高效液相色谱分析信号分子C6-HSL(出峰时间为14.5min)降解程度(图8)，计算酶活力。

根据信号分子C6-HSL(甲醇溶解)浓度(x,mmol/L)和高效液相色谱中对应峰面积(y)的关系，构建标准曲线方程为y＝1.3×10⁷x+1.8×10⁶(R²＝0.9948)。

酶活力定义为：在30℃下1min分解1μmol信号分子C6-HSL所需的酶量被定义为一个酶活力单位(U)。酶的比活力定义：每毫克酶蛋白所具有的酶活力。单位是U/mg。

通过三次平行试验，测定发酵得到的酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶AiiO酶的比活力19.24±3.71U/mg。发酵罐操作条件下，经乳糖诱导发酵并纯化后获得的蛋白AiiO酶活力为2.62U/mL发酵液。摇瓶操作条件下，经IPTG诱导发酵并纯化后获得的蛋白AiiO酶活力为0.345U/mL发酵液。可见，在发酵罐中经乳糖诱导得到的发酵液的酶活力是摇瓶中经IPTG诱导得到的发酵液酶活力的7.6倍。

参考文献

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[2]杨梅，谢盼盼，简思美，林丽玉，杨彩云。定点突变提高N-酰基高丝氨酸内酯酶酶活和温度稳定性,微生物学报,2014,54(8)：905-912。

[3]张美超，曹雅男，姚斌，白东清，周志刚。淬灭酶AiiO-AIO6酶学性质及对嗜水气单胞菌毒力因子的表达调控，水产学报，2011，35(11)：1720-1728。

[4]CN101705212AN-酰基高丝氨酸内酯酶及其生产方法与专用重组菌。

[5]McCleanKH,WinsonMK,FishL,TaylorA,ChhabraSR,CamaraM,DaykinM,LambJH,SwiftS,BycroftBW,StewartGS,WilliamsP.QuorumsensingandChromobacteriumviolaceum:exploitationofviolaceinproductionandinhibitionforthedetectionofN-acylhomoserinelactones,Microbiology,1997,143(Pt12):3703-3711。