一种检测胞外蛋白酶酪蛋白水解活性及耐热性的方法

摘要

本发明提供了一种检测胞外蛋白酶酪蛋白水解活性及耐热性的方法。该方法包括：(1)将微生物培养液离心、取上清液；(2)将一部分上清液加热；(3)将经过与未经过热处理的上清液与反应缓冲液混合，35-45℃反应2-3小时，终止反应，离心，取上清转移至多孔板，加入强碱溶液，检测450nm吸光值；(4)将450nm吸光值换算为胞外蛋白酶酪蛋白水解活性；胞外蛋白酶的耐热性为经过热处理与未经过热处理的上清液中的胞外蛋白酶酪蛋白水解活性的比值。本发明方法可以同时对微生物胞外蛋白酶酪蛋白水解活性及耐热性进行定量测试，更加精确比较菌株之间的差异，使操作更便捷，节省了培养基，能够实现批量操作并可直接检测菌液上清。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体地涉及一种检测胞外蛋白酶酪蛋白水 解活性及耐热性的方法。

背景技术

微生物在牛乳生产链过程中分泌的胞外耐热蛋白酶会导致牛乳及制品 产生凝胶，沉淀和变苦。现有的脱脂乳平板筛查技术，利用向培养基中添加 脱脂乳，通过对微生物的培养，观察是否有水解圈的形成来判断微生物的酪 蛋白水解活力，操作简单，但是只能检测微生物是否有酪蛋白水解活力，而 不能精确定量地检测和比较酪蛋白水解活力。现有的偶氮酪蛋白检测技术， 利用微生物对偶氮酪蛋白底物的降解，释放具有特定紫外吸收波长的产物， 通过检测产物的紫外吸收值，同时结合检测菌体生长浓度，可以实现对微生 物酪蛋白水解活力的定量检测，但是由于需要同时检测菌体浓度，导致检测 过程复杂且不能实现批量检测。最近报道的偶氮酪蛋白检测技术直接对培养 基上清进行检测，可以不依赖菌体浓度，能够对胞外蛋白酶的酪蛋白水解活 力定量测试，但未能对其酪蛋白水解活力及耐热性同时进行定量、批量检测 未能实现对胞外蛋白耐热性的检测，且在菌株复壮培养中，培养基体积在5- 8毫升，需要用试管培养，不利于批量操作。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服目前检测胞外蛋白酶活性的方 法不能同时批量地检测胞外蛋白酶耐热性，提供了一种检测胞外蛋白酶酪蛋 白水解活性及耐热性的方法。本发明的检测胞外蛋白酶酪蛋白水解活性及耐 热性的方法可以1)可以同时对微生物胞外蛋白酶酪蛋白水解活性及耐热性 进行定量测试，通过得到的不同样品之间的胞外蛋白酶酪蛋白水解活性和耐 热性差异可以更加精确比较菌株之间的差异；2)所有处理操作，都可以在 1.5ml的离心管中进行，节省了试管到离心管的转移步骤，菌株培养以及处 理后可以直接离心，使得操作更加便捷；3)节省了培养基的使用；4)通过 酶标板的使用能够实现批量操作；5)不需要考虑菌体浓度，可以直接检测菌 液上清，比较一定体积单位中胞外蛋白酶酪蛋白水解活性及耐热性。

本发明为解决上述技术问题提供了以下技术方案：

本发明技术方案之一：一种同时、批量检测微生物胞外蛋白酶酪蛋白水 解活性及耐热性的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将微生物培养液离心、取上清液；

(2)将一部分步骤(1)所述上清液90-100℃加热1-3min，得经过热处 理的上清液，剩余的步骤(1)所述上清液为未经过热处理的上清液；

(3)将步骤(2)中所述经过与未经过热处理的上清液与反应缓冲液按体 积比1∶0.5-1∶2分别混合，所述反应缓冲液的组分为2-4.5g/L偶氮酪蛋白、 25-45mM吗啉丙磺酸(MOPS)和1.5-3mM氯化钙，35-45℃反应2-3h，加 入1.5-3M三氯乙酸溶液或三氟乙酸终止反应，离心，取上清转移至多孔板， 向所述上清中加入强碱溶液至强碱终浓度为0.2-0.5M，分别检测450nm吸 光值；

(4)将步骤(3)所得450nm吸光值分别换算为步骤(2)所述经过热处 理与未经过热处理的上清液中的胞外蛋白酶酪蛋白水解活性，所述换算的方 法为将样品在450nm处的吸光值减去空白对照在450nm的吸光值得吸光值 增值，再将所述吸光值增值换算为每毫升样品每小时的吸光值增值即得所述 胞外蛋白酶酪蛋白水解活性；所述胞外蛋白酶的耐热性为所得经过热处理与 未经过热处理的上清液中的胞外蛋白酶酪蛋白水解活性的比值。

本发明中，步骤(1)为：将微生物培养液离心、取上清液。步骤(1) 中，所述微生物培养液可以通过本领域常规的方法获得，较佳地通过包括以 下步骤的方法获得：1)将微生物接种于复壮培养基中30℃培养24h，得复 壮培养液；2)将步骤1)所述复壮培养液转接至灭菌脱脂乳，30℃继续培养 48h，即得。步骤1)中，所述复壮培养基可以为本领域常规的细菌培养基， 较佳地为MPC培养基，所述MPC培养基的组分为5.0g/L胰化蛋白胨、2.5g/L 酵母提取物和1.0g/L葡萄糖。所述培养可以按本领域常规的培养细菌的方法 进行，较佳地为振荡培养，所述振荡的培养的转速较佳地为150-250rpm，更 佳地为180-220rpm，最佳地为200rpm。步骤2)中，所述灭菌脱脂乳可以为 本领域常规的灭菌脱脂乳，如灭菌脱脂生鲜乳或灭菌脱脂复原乳，较佳地为 灭菌脱脂复原乳。所述转接的比例可以为本领域常规的转接比例，较佳地为 体积比1∶10。所述培养可以按本领域常规的培养细菌的方法进行，较佳地 为振荡培养，所述振荡的培养的转速较佳地为150-250rpm，更佳地为180- 220rpm，最佳地为200rpm。

本发明中，步骤(2)为：将一部分步骤(1)所述上清液90-100℃加热 1-3min，得经过热处理的上清液，剩余的步骤1)所述上清液为未经过热处 理的上清液。步骤(2)中，所述加热的温度较佳地为95-100℃，更佳地为 100℃，最佳地为100℃，所述加热的时间较佳地为2-3min，更佳地为2min。 所述加热可以通过本领域常规的方法进行，较佳地为水浴或金属浴加热，更 佳地为金属浴加热。所述一部分可以为本领域常规所指的比例，较佳地为1/2。

本发明中，步骤(3)为：将步骤(2)中所述经过与未经过热处理的上 清液与反应缓冲液按体积比1∶0.5-1∶2分别混合，所述反应缓冲液的组 分为2-4.5g/L偶氮酪蛋白、25-45mM吗啉丙磺酸(MOPS)和1.5-3mM氯 化钙，35-45℃反应2-3h，加入1.5-3M三氯乙酸溶液或三氟乙酸溶液终止反 应，离心，取上清转移至多孔板，向所述上清中加入强碱溶液至强碱终浓度 为0.2-0.5M，分别检测450nm吸光值。

步骤(3)中，所述经过与未经过热处理的上清液与反应缓冲液按体积比 1∶0.5-1∶2分别混合，较佳地按体积比1∶1混合。所述偶氮酪蛋白的浓度 较佳地为3-4.5g/L，更佳地为4.5g/L；所述吗啉丙磺酸的浓度较佳地为35- 45mM，更佳地为45mM；所述氯化钙的浓度较佳地为1.5-2mM，更佳地为 2mM。所述反应的温度为35-45℃，较佳地为40℃。所述反应的时间为2-3h， 较佳地为2h。所述终止反应为加入三氯乙酸溶液或三氟乙酸终止反应，所述 三氯乙酸或三氟乙酸的浓度较佳地为2M，所述三氯乙酸溶液或三氟乙酸溶 液的体积较佳地为占反应体系总体积的1/10。所述强碱的终浓度为0.2-0.5M， 较佳地为0.2M。所述强碱可以为本领域常规的强碱，较佳地为氢氧化钠或氢 氧化钾，更佳地为氢氧化钠。所述强碱溶液的浓度可以为本领域常规的浓度， 较佳地为1M。所述离心的转速可以为本领域常规的转速，较佳地为10000rpm。 所述离心的时间可以为本领域常规的时长，较佳地为15min。所述离心的温 度可以为本领域常规的温度，较佳地为25℃。所述多孔板可以为本领域常规 的多孔板，如96孔板和384孔板，较佳地为96孔板。检测所述450nm处的 吸收值可以用本领域常规的方法进行，较佳地为将样品批量置于所述多孔板 中用酶标仪进行检测。

本发明中，步骤(4)为：将步骤(3)所得450nm吸光值分别换算为步 骤(2)所述经过热处理与未经过热处理的上清液中的胞外蛋白酶酪蛋白水 解活性，所述换算的方法为将样品在450nm处的吸光值减去空白对照在 450nm的吸光值得吸光值增值，再将所述吸光值增值换算为每毫升样品每小 时的吸光值增值即得所述胞外蛋白酶酪蛋白水解活性；所述胞外蛋白酶的耐 热性为所得经过热处理与未经过热处理的上清液中的胞外蛋白酶酪蛋白水 解活性的比值。步骤(4)中，所述空白对照较佳地为去离子水。

本发明中，所述热处理可以为本领域常规的对胞外蛋白酶的热处理，

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发 明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明提供的方法1)可以同时对微生物 胞外蛋白酶酪蛋白水解活性及耐热性进行定量测试，通过得到的不同样品之 间的胞外蛋白酶酪蛋白水解活性和耐热性差异可以更加精确比较菌株之间 的差异；2)所有处理操作，都可以在1.5ml的离心管中进行，节省了试管 到离心管的转移步骤，菌株培养以及处理后可以直接离心，使得操作更加便 捷；3)节省了培养基的使用；4)通过酶标板的使用能够实现批量操作；5) 不需要考虑菌体浓度，可以直接检测菌液上清，比较一定体积单位中胞外蛋 白酶酪蛋白水解活性及耐热性。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在 所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常 规方法和条件，或按照商品说明书选择。

本发明实施例中用到的培养基如下：

MPC培养基：5.0g/L胰化蛋白胨、2.5g/L酵母提取物和1.0g/L葡萄糖

MPC固体培养基：在上述MPC培养基中加入脱脂乳粉至1g/L，琼脂至 18g/L，调pH值7.0±0.1，115℃灭菌15min

灭菌脱脂乳：取10g脱脂乳粉溶于1L水中，115℃，15min灭菌即得

本发明以下实施例所用到的菌株均为假单胞菌(Pseudomonassp)，编号 分别为N2-3、N5-3、N9-2、M41、M46、J937、N96、D11、D13、M13、N97、 D62、D72、D81、D104、D15、D19、D44、J435、J436、J737、D21、D22、 D46、D84、D105、J935、J225和N71。以上菌株由本实验室从原料乳中分 离获得，分离方法包括以下步骤：对原料乳用无菌水进行梯度稀释，取10^-2～10^-5四个稀释度样品各100μL，涂布于MPC固体培养基上，挑单菌落划线， 重复两次，所得的菌株即为实验菌株。

实施例1一般细菌胞外蛋白酶酪蛋白水解活性及耐热性的检测

(1)将冻存的假单胞菌菌株N2-3、N5-3和N9-2从-20℃冰箱中取出置 于冰盒上，以2％体积比的接种量接种到含1mLMPC培养基的EP管中，30℃ 培养箱200rpm振荡复壮培养24h，得复壮细菌培养液；取所述复壮细菌培 养液100μL转接至含1mL灭菌脱脂乳的EP管中30℃200rpm振荡培养48h， 将培养好的菌液25℃12000rpm离心15min，得上清液；

(2)取100μL步骤(1)上清液于金属浴中100℃加热2min，4℃冷却 30s后，另取100μL步骤(1)上清液不加热备用；

(3)将步骤(2)经过加热与未经加热的上清液分别与反应缓冲液100μL 混合，40℃反应2h，所述反应缓冲液的组分为4.5g/L偶氮酪蛋白、45mM MOPS和1.5mM氯化钙。两组样品均用20μL2M的三氯乙酸终止反应，25℃ 10000rpm离心15min；取离心后的上清150μL至96孔细胞培养板中，加 50μL1M氢氧化钠溶液，立即用酶标仪测450nm的吸光值；

(4)将步骤(3)测得的样品吸光值减去同一空白样品(菌液上清由去离 子水替代)的吸光值即得吸光值增值(DA)。450nm处每毫升样品每小时的 吸光值增值即为蛋白酶活性(ΔAh^-1mL^-1)。菌株的蛋白酶活性大于0.3ΔAh^-1mL^-1被认为是有蛋白酶活性的。每次试验进行两次，取平均值。耐热性的计 算方法是，将热处理后样品的蛋白酶活性值除以未经热处理的样品的蛋白酶 活性值，得到的残留酶活性百分比作为耐热性值。测得的蛋白酶活性及耐热 性结果如表1所示：

表1

胞外蛋白酶活力在40℃条件下以偶氮酪蛋白为底物测得，实验结果为两 次实验的平均偏差。由表1可见N2-3、N5-3和N9-2三个菌株的耐热性之间 存在明显的差异。

实施例2一般细菌胞外蛋白酶酪蛋白水解活性及耐热性的检测

(1)将冻存的假单胞菌菌株M41、M46和J937从-20℃冰箱中取出置于 冰盒上，以2％体积比的接种量接种到含1mLMPC培养基的EP管中，30℃ 培养箱200rpm振荡复壮培养24h，得复壮细菌培养液；取所述复壮细菌培 养液100μL转接至含1mL灭菌脱脂乳的EP管中30℃200rpm振荡培养48h， 将培养好的菌液25℃12000rpm离心15min，得上清液；

(2)取100μL步骤(1)上清液于金属浴中90℃加热3min，4℃冷却30s 后，另取100μL步骤(1)上清液不加热备用；

(3)将步骤(2)经过加热与未经加热的上清液分别与反应缓冲液50μL 混合，35℃反应3h，所述反应缓冲液的组分为2g/L偶氮酪蛋白、25mMMOPS 和2mM氯化钙。两组样品均用20μL1.5M的三氯乙酸终止反应，25℃ 10000rpm离心15min；取离心后的上清100μL至96孔细胞培养板中，加 100μL1M氢氧化钾溶液，立即用酶标仪测450nm的吸光值；

(4)将步骤(3)测得的样品吸光值减去同一空白样品(菌液上清由去离 子水替代)的吸光值即得吸光值增值(DA)。450nm处每毫升样品每小时的 吸光值增值即为蛋白酶活性(ΔAh^-1mL^-1)。菌株的蛋白酶活性大于0.3ΔAh^-1mL^-1被认为是有蛋白酶活性的。每次试验进行两次，取平均值。耐热性的计 算方法是，将热处理后样品的蛋白酶活性值除以未经热处理的样品的蛋白酶 活性值，得到的残留酶活性百分比作为耐热性值。测得的蛋白酶活性及耐热 性结果如表2所示：

表2

胞外蛋白酶活力在40℃条件下以偶氮酪蛋白为底物测得，实验结果为两 次实验的平均偏差。由表2可见，菌株M41的胞外蛋白酶不具有耐热性， 菌株M46和J937的耐热性较接近。

实施例3嗜冷菌胞外蛋白酶酪蛋白水解活性及耐热性的检测

嗜冷菌是一类最高生长温度高于20℃，最适生长温度高于15℃，而在 0～5℃仍可以生长繁殖的微生物。本实施例检测20株嗜冷菌的胞外蛋白酶 活性及耐热性，具体如下：

(1)将20株嗜冷假单胞菌菌株N97、D62、D72、D81、D104、D15、 D19、D44、J435、J436、J737、D21、D22、D46、D84、D105、J935、J225 和N71从-20℃冰箱中取出置于冰盒上，以2％体积比的接种量接种到含1mL MPC培养基的EP管中，30℃培养箱培养24h，得复壮培养菌液；取复壮培 养菌液100μL转接至含1mL灭菌脱脂乳的EP管中30℃150rpm振荡培养 48h，将培养好的菌液25℃12000rpm离心15min得上清液；

(2)取步骤(1)100μL上清液于金属浴中100℃加热2min，4℃冷却 30s；另取步骤(1)100μL上清液不经过加热备用；

(3)将步骤(2)经过加热与未经加热的上清液分别与反应缓冲液100μL 混合，40℃反应2h，所述反应缓冲液的组分为4.5g/L偶氮酪蛋白、45mM MOPS和1.5mM氯化钙。两组样品均用20μL2M的三氯乙酸终止反应， 25℃10000rpm离心15min；取步骤(2)离心后的150μL上清至96孔孔细 胞培养板中，加50μL1M氢氧化钠溶液，立即用酶标仪测450nm的吸光值。

(4)将步骤(3)所得450纳米吸光值吸光值减去同一空白样品(菌液上 清由去离子水替代)的吸光值得到吸光值增值(DA)。450nm处每毫升样品 每小时的吸光值增值为蛋白酶活性(ΔAh^-1mL^-1)。菌株的蛋白酶活性大于0.3 ΔAh^-1mL^-1被认为是有蛋白酶活性的。每次试验进行两次，取平均值。耐热 性的计算方法是，将热处理后样品的蛋白酶活性值除以未经热处理的样品的 蛋白酶活性值，得到的残留酶活性百分比作为耐热性值。测得的蛋白酶活性 及耐热性结果如表3所示：

表3

胞外蛋白酶活力在40℃条件下以偶氮酪蛋白为底物测得，实验结果为两 次实验的平均偏差。由表3可见，菌株N97的胞外蛋白酶不具有耐热性，菌 株D62、D72、D81、D104、D15、D19、D44、J435、J436和J737的胞外 蛋白酶的耐热性相互之间具有一定差异，菌株D21、D22、D46、D84、D105、 J935、J225和N71的上清液在热处理之前胞外蛋白酶活性均小于0.3ΔAh^-1mL^-1，可以认为不具有胞外蛋白酶活性。

实施例4嗜冷菌胞外蛋白酶酪蛋白水解活性及耐热性的检测

(1)将4株嗜冷假单胞菌菌株N96、D11、D13和M13从-20℃冰箱中取 出置于冰盒上，以2％体积比的接种量接种到含1mLMPC培养基的EP管 中，30℃培养箱培养24h，得复壮培养菌液；取复壮培养菌液100μL转接 至含1mL灭菌脱脂乳的EP管中30℃150rpm振荡培养48h，将培养好的菌 液25℃12000rpm离心15min得上清液；

(2)取步骤(1)100μL上清液于金属浴中95℃加热3min，4℃冷却30s； 另取步骤(1)100μL上清液不经过加热备用；

(3)将步骤(2)经过加热与未经加热的上清液分别与反应缓冲液100μL 混合，45℃反应2h，所述反应缓冲液的组分为2g/L偶氮酪蛋白、25mMMOPS 和3mM氯化钙。两组样品均用20μL3M的三氟乙酸终止反应，25℃10000 rpm离心15min；取步骤(2)离心后的150μL上清至96孔孔细胞培养板 中，加37.5μL1M氢氧化钠溶液，立即用酶标仪测450nm的吸光值。

(4)将步骤(3)所得450纳米吸光值吸光值减去同一空白样品(菌液上 清由去离子水替代)的吸光值得到吸光值增值(DA)。450nm处每毫升样品 每小时的吸光值增值为蛋白酶活性(ΔAh^-1mL^-1)。菌株的蛋白酶活性大于0.3 ΔAh^-1mL^-1被认为是有蛋白酶活性的。每次试验进行两次，取平均值。耐热 性的计算方法是，将热处理后样品的蛋白酶活性值除以未经热处理的样品的 蛋白酶活性值，得到的残留酶活性百分比作为耐热性值。测得的蛋白酶活性 及耐热性结果如表4所示：

表4

胞外蛋白酶活力在40℃条件下以偶氮酪蛋白为底物测得，实验结果为两 次实验的平均偏差。由表4可见，菌株N96、D11和D13均不具有耐热性。

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发 明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。