金属离子为桥接剂的18β-甘草次酸分子印迹聚合物和整体柱

摘要

本发明涉及一种金属离子为桥接剂的18β-甘草次酸分子印迹聚合物和整体柱。该聚合物用于固相萃取的吸附剂，分离甘草次酸差向异构体。原料组成是18β-甘草次酸1.55–4.12%，乙酸钴0.82-2.18%，4-乙烯基吡啶2.73-2.80%，偶氮二异丁腈0.26-0.32%，二甲基丙烯酸乙二醇酯15.63-31.25%，1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐43.28-43.80%，N,N-二甲基甲酰胺3.18–3.59%，二甲基亚砜18.47-20.01%。该方法合成的聚合物和不加金属离子印迹聚合物相比，印迹因子提高近3倍。此外，将聚合物干燥、研磨、过筛（74μm）后作为吸附剂装填在SPE柱中，对甘草次酸粗提物中的18β-甘草次酸进行分离富集。获得样品的回收率为91.1%，纯度为93.8%。由此可见，该聚合物可用于甘草次酸粗提物的分离提纯及富集。

说明书

技术领域

本发明涉及一种金属离子为桥接剂的18β-甘草次酸分子印迹聚合物和整体柱。

背景技术

甘草是一种传统的中草药，性味甘平，有清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛等功效。甘草中主要活性成分是甘草酸，但由于18位手性碳原子的构型不同，产生一对差向异构体18α-甘草酸和18β-甘草酸，二者经酸式水解后，生成18α-甘草次酸和18β-甘草次酸。β-甘草次酸在抗病毒方面要强于β-甘草酸。此外，孙浩洋等[孙浩洋，李清，陈威，等.甘草次酸差向异构体单独给药和联合给药后在大鼠体内的药动学研究[J].药学学报，2012.]通过甘草次酸差向异构体在大鼠体内药动学研究证实甘草次酸差向异构体的拆分研究就有实际意义。

高效液相色谱法已经广泛地应用于甘草中甘草酸含量测定和甘草酸差向异构体的分离分析中。但是关于甘草次酸拆分和测定的文献报道却不是很多。Zou等[Zou Q，WeiP，Li J，et al. Simultaneous determination of 18alpha-and 18beta-glycyrrheticacid in human[J]. Biomed Chromatogr，2009.]用液质技术，使用ODS液相色谱柱，流动相为V(醋酸铵溶液10mmol/L)∶V( 甲醇)∶ V(乙腈)=40∶36∶24，测定人血浆中α-GA 与β-GA的含量。姚碧霞等[姚碧霞,杨新梅,郑慧敏,邓毓文,翁文. 甘草次酸差向异构体的高效液相色谱分离分析[J]. 化学试剂,2014.]应用Chromolith RP-18e整体柱色谱柱，以V（乙酸铵8mmol/l）:V(乙腈)：V（甲醇）=52:40:8为流动相，使甘草次酸差向异构体达到基线分离。

天然产物是药物开发的原料之一，其组分多样，成分复杂，且有效成分含量低难于富集。传统的提取方法如热水浸提法、溶剂回流法等都耗溶剂、耗时、耗能并且提取率较低。近年来，固相萃取（solid phase extraction,SPE）已成为药物分析的常用富集技术，是一种以色谱分离为基础的样品前处理方法，是指液体样品在一定压力作用下通过装有固体吸附剂的固相萃取装置，分析物和杂质被吸附并保留在固相萃取柱上的实验方法。固相萃取中许多商用的吸附剂，由于选择性不高，对于组分复杂的样品来说常常发生共萃取的现象。对于高选择性的SPE材料来说，可以避免这种现象，但是价格过于昂贵且性质不稳定。然而，用分子印迹聚合物作为SPE吸附剂是一种很有利的替代方法。

分子印迹聚合物(Molecular imprinting polymers, MIPs)具有特异性和亲和性，制备过程简单，操作方便，用作固相萃取剂，可克服生物、天然产物或是环境样品体系复杂、预处理手续繁杂等不利因素。基于MIPs对模板分子具有高选择性和特异识别性，对复杂样品中目标分子的采集、富集和分析提供了极大的便利。将分子印迹技术和固相萃取技术相结合即分子印迹固相萃取（MISPE）应用于天然产物的分离、富集和纯化中具有很强的实际意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种金属离子为桥接剂的18β-甘草次酸分子印迹聚合物和整体柱。以乙酸钴作为金属离子桥接剂，以离子液体1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐，N,N-二甲基甲酰胺和二甲基亚砜作为三元致孔剂，合成具有预定选择性的18β-甘草次酸印迹聚合物。该制备方法容易操作，制备过程简单，并通过调整模板单体比例，交联剂含量等获得具有明显印迹效果的聚合物（印迹因子为3.50），和不加金属离子的印迹聚合物做对比，印迹因子提高了近3倍。将合成好的分子印迹聚合物干燥、研磨、过筛（74μm）后作为吸附剂装填在聚丙烯固相萃取柱中，通过分子印迹固相萃取技术，对甘草次酸粗提物中的18β-甘草次酸进行分离富集。获得样品的回收率为91.1%，样品的纯度为93.8%。本发明可应用于18β-甘草次酸的分离和富集。

利用分子印迹固相萃取技术对甘草次酸差向异构体进行分离研究。采用金属离子乙酸钴作为桥接剂，18β-甘草次酸为模板分子合成分子印迹聚合物。金属离子加入印迹体系中，可作为枢纽，分别与模板和功能单体作用，以较强的金属配位键作用力取代模板和功能单体之间较弱氢键等作用力，进而增强印迹空穴的识别能力，提高印迹效果[Bai L H,Chen X X, Huang Y P, et al. Chiral separation of racemic mandelic acids byuse of an ionic liquid-mediated imprinted monolith with a metal ion as self-assembly pivot[J]. Analytical Bioanalytical Chemistry, 2013, 405(27):8935-8943.]。该方法合成的聚合物对18β-甘草次酸的印迹因子（IF）为3.50。

本发明提供的金属离子为桥接剂的18β-甘草次酸分子印迹聚合物的原料质量组成为：

18β-甘草次酸 1.55 – 4.12 %

乙酸钴 0.82 – 2.18 %

4-乙烯基吡啶 2.73 - 2.80 %

偶氮二异丁腈 0.26 - 0.32 %

二甲基丙烯酸乙二醇酯 15.63 – 31.25 %

1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐43.38 - 43.80 %

N,N-二甲基甲酰胺 3.18 – 3.59 %

二甲基亚砜 18.47 - 20.01 %

上述的各原料的质量组成之和为100 %。其中18β-甘草次酸为模板分子，乙酸钴为金属桥接剂，18β-甘草次酸与乙酸钴的摩尔比为1:1。

本发明提供所述的一种以金属离子为桥接剂的18β-甘草次酸分子印迹聚合物和整体柱的制备方法，具体包括下列步骤：

按计量将模板分子18β-甘草次酸，金属桥接剂乙酸钴，功能单体4-乙烯基吡啶，引发剂偶氮二异丁腈，交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯，溶于致孔剂为离子液体1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜的混合致孔剂溶液中；超声溶解25-30 min，使之溶解、澄清，除去液体中氧气，将预聚合物注入密封容器中，于50-60 ℃水浴中反应16-18h，得到金属离子为桥接剂的18β-甘草次酸分子印迹聚合物。

或再将预聚合物注入不锈钢柱 (100 × 4.6 mm I.D.) 中，将两端封住，于50-60℃水浴中反应16-18 h；将反应好的柱子连于HPLC的高压泵上，先用乙腈冲洗，除去整体柱中残留的致孔剂及可溶性物质，流速由0.1 mL/min逐渐升至0.5 mL/min，冲够100 mL后换成甲醇/乙酸 (v/v, 7/3) 混合溶液150 mL冲洗除去模板分子，得到金属离子为桥接剂的18β-甘草次酸分子印迹聚合物整体柱。

将上述冲洗好除去模板分子的分子印迹聚合物干燥，研磨，过74μm筛后，装入固相萃取柱中，其两端放置以聚丙烯为材料的防止颗粒渗漏的塞片，可制成用于18β-甘草次酸的分离和富集得固相萃取柱。

非印迹聚合物的合成除不加模板分子18β-甘草次酸外，其余步骤同上。

本发明得到的以金属离子为桥接剂的18β-甘草次酸分子印迹聚合物和整体柱可应用于18β-甘草次酸的分离和富集。

本发明以金属离子作为金属桥接剂制备18β-甘草次酸分子印迹聚合物，具体的是以乙酸钴作为金属离子桥接剂，以离子液体1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐，N,N-二甲基甲酰胺和二甲基亚砜作为三元致孔剂，合成具有预定选择性的18β-甘草次酸印迹聚合物。该制备方法容易操作，制备过程简单，并通过调整模板单体比例，交联剂含量等获得具有明显印迹效果的聚合物（印迹因子为3.50），和不加金属离子的印迹聚合物做对比，印迹因子提高了近3倍。此外，将合成好的聚合物干燥、研磨、过筛（74μm）后作为吸附剂装填在聚丙烯固相萃取柱中，通过分子印迹固相萃取技术，对甘草次酸粗提物中的18β-甘草次酸进行分离富集。通过对淋洗溶剂和洗脱溶剂的考察，建立较好的分离富集甘草次酸提取液中18β-甘草次酸的方法。本发明中选用乙腈：水=5:5（v/v）作为淋洗溶剂，纯甲醇作为洗脱溶剂，得到样品回收率为91.1%，获得样品的纯度为93.8%。

附图说明

图1为本发明制备的含有金属离子及不含有金属离子的容量因子（k）和印迹因子(IF)对比图。

图2为本发明含金属离子印迹聚合物和非印迹聚合物的氮吸附测试图。

图 3 为本发明固相萃取中淋洗溶剂的选择。

图4为本发明制备的以金属离子作为桥接剂的分子印迹聚合物作为固相萃取吸附剂，甘草次酸提取液经SPE吸附后的HPLC色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步详细阐述本发明。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件；所用的通用设备、材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

以金属离子作为桥接剂和不含金属离子的18β-甘草次酸为模板的分子印迹整体柱的制备及其印迹因子的对比。具体步骤如下：

原位聚合法制备18β-甘草次酸印迹整体柱：

a. 将质量百分数模板18β-甘草次酸3.09 %，桥接剂乙酸钴1.64 %，功能单体4-乙烯基吡啶2.76 %，引发剂偶氮二异丁腈0.29 %，交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯26.04 %，溶于致孔剂为1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐43.59 %、N,N-二甲基甲酰胺3.32 %，二甲基亚砜19.27 % 的混合致孔剂溶液中；超声溶解30 min，使之溶解、澄清，之后通入氮气，除去预聚合混合液中的氧气，再将预聚合混合液注入不锈钢柱 (100 × 4.6 mm I.D.) 中，将两端封住，于50-60 ℃水浴中反应16-18 h。

（将上述预聚合混合液注入密封容器中，于50-60 ℃水浴中反应16-18 h，得到金属离子为桥接剂的18β-甘草次酸分子印迹聚合物）。

b. 将反应好的柱子连于HPLC的高压泵上，先用乙腈冲洗，除去整体柱中残留的致孔剂及可溶性物质，流速由0.1 mL/min逐渐升至0.5 mL/min，冲够100 mL后换成甲醇/乙酸(v/v, 7/3) 混合溶液150 mL冲洗除去模板分子。最后使用流动相将系统平衡至基线水平。

不含有金属离子的18β-甘草次酸分子印迹整体柱制备，除了不加乙酸钴外，其余步骤同上。

18β-甘草次酸分子印迹整体柱色谱条件：

将合成的整体柱连于CoM6000高效液相色谱仪上，以乙酸/乙酸钠缓冲盐（70/30, v/v,pH = 5.0, 50 mmol L^-1）为流动相，流速>-1，柱温>

结果表明，在该流动相下，使用步骤a 合成的金属桥接的18β-甘草次酸分子印迹整体柱具有明显印迹效果，印迹因子为3.50；不含有金属离子的18β-甘草次酸分子印迹整体柱的印迹因子为1.52。（图1）

实施例 2

为了表征以金属离子为桥接剂的18β-甘草次酸分子印迹聚合物的形态学特征，制备了以18β-甘草次酸分子印迹聚合物MIP和无18β-甘草次酸非分子印迹聚合物NIP，并对两种聚合物进行了氮吸附-解吸附分析，具体操作步骤如下：

a.聚合物的制备：同上述方法（实施例1）将制备好的聚合物干燥，在研钵中研细。

b.氮吸附测试：将研磨好的18β-甘草次酸分子印迹聚合物MIP和无18β-甘草次酸非分子印迹聚合物NIP置60 ºC真空除气(10^{−3>Torr) 4小时，取干燥好的颗粒置ASAP-2020微粒表面积和孔隙度分析仪中进行，对所得数据进行处理得到18β-甘草次酸分子印迹聚合物氮吸附-解吸附等温线和比表面积。}

通过氮吸附测试结果表明，分子印迹聚合物MIP相对NIP具有较大的比表面积，Brunauer-Emmett-Teller (BET)比表面积为27.1>2/g，吸附量（STP）为47.1>3/g，非印迹聚合物的比表面积为25.9>2/g，吸附量（STP）为25.8>3/g（图>

实施例3

在固相萃取过程中，目标化合物的吸附要通过吸附剂活化、上样、淋洗、洗脱四个步骤，其中淋洗最为重要。淋洗的目的是为了是目标分子的非特异性吸附转变成特异性吸附，同时洗去杂质而保留目标分子。淋洗溶剂的选择原则是既能保留目标分子又能洗脱掉杂质分子。本发明对淋洗溶剂进行了筛选，具体步骤如下：

a.聚合物的制备：同上述方法（实施例1）将制备好的聚合物干燥，在研钵中研细,过筛（74μm）。

b.淋洗过程：将1g步骤a中的聚合物装填在规格为3mL的固相萃取柱中，SPE（SolidPhase Extraction）柱经活化和2mg粗提物上样后，进行淋洗操作。实验中选用的淋洗溶剂有水、甲醇、乙腈、乙腈/水（v/v,7/3,5/5,3/7）。淋洗体积从1mL到5mL，以1mL为单位接取流出液体，之后用HPLC进行含量测定，计算每毫升淋洗液所洗脱18β-甘草次酸的质量百分含量。实验结果表明，淋洗溶剂为乙腈/水（v/v,5:5）时，目标分子18β-甘草次酸损失最小。（图3）

实施例4

为了论证以金属离子为桥接剂的18β-甘草次酸分子印迹整体柱对模板分子18β-甘草次酸具有特异识别能力，本发明应用固相萃取技术对甘草次酸的粗提物进行分离纯化实验，具体操作步骤如下：

a. 同上述方法（实施例1）合成以金属离子为桥接剂的18β-甘草次酸分子印迹聚合物，将洗脱好模板的聚合物放于干燥器中干燥，之后于研钵中研细，过筛（74μm）。

b. 称取步骤a中的聚合物1g，装入3mL的聚丙烯SPE柱中，SPE柱两端分别垫有塞片（该塞片可以用聚丙烯为材料制成），以防止颗粒渗漏。首先用5 mL甲醇和5 mL纯化水对MIP-SPE进行淋洗及活化，之后将甘草次酸溶于70%乙醇溶液中，取5 mL样品溶液上样至固相萃取柱上，充分吸附后，用乙腈/水=5:5 （v/v）6 mL作为淋洗溶剂对固相萃取柱进行淋洗，之后用8 mL纯甲醇溶剂将吸附于小柱上的18β-甘草次酸洗脱下来，收集流出液。待收集的样品挥干后，将其溶于1 mL的流动相中，进行HPLC分析。

根据分子印迹原理，MIP对18β-甘草次酸具有特异识别能力，甘草次酸粗提物经过固相萃取之后，纯度由80%提高到了93.8%，回收率为91.1%。（图4）。