一种提高禽流感灭活疫苗异源保护力的辅助制剂及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种提高禽流感灭活疫苗异源保护力的辅助制剂及其制备方法和应用，属于生物技术领域。本发明所述的辅助制剂是以杆状病毒为载体，能够在脊椎动物体内表达禽流感病毒保守抗原表位的重组杆状病毒。禽流感病毒快速变异，而现有禽流感灭活疫苗对异源毒株保护力弱，本发明将禽流感病毒高度保守、具有交叉保护作用的抗原片段HA2？76-130、3M2e、NP55-69、NP380-393的编码基因插入杆状病毒基因组，制备成经肌肉注射免疫的禽流感灭活疫苗辅助制剂，与灭活苗联合使用。该辅助制剂克服了传统禽流感灭活疫苗对异源毒株交叉保护力方面的不足，从而实现对禽流感疫情有效的防控。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种提高禽流感灭活疫苗异源保护力的辅助制剂及其制备方法和应用。

背景技术

禽流感(Avianinfluenza,AI)是由禽流感病毒(Avianinfluenzavirus,AIV)引起的呼吸道传染病，对人类健康和世界经济造成严重影响。由H5和H7亚型禽流感病毒引起的高致病性禽流感(Highlypathogenicavianinfluenza,HPAI)，一旦爆发，往往造成家禽的大量死亡。更为严重的是，随着病毒的进化，H5N1亚型禽流感病毒已经突破了禽类与哺乳动物的种间屏障，可直接感染人。从2003年开始高致病性H5N1成为主要的人兽共患病之一并且不断的衍生出新的谱系，因此有效防控H5N1亚型禽流感不仅能够挽回大量的经济损失，而且具有重要的公共卫生意义。当前H5亚型禽流感的防控主要依赖全病毒灭活苗，通过强制接种灭活苗，我国在H5N1HPAI防控方面取得了不错的效果。但是近年来H5N1AIV变异日趋频繁，灭活苗保护力特异性强，对异源毒株或者变异毒株的保护力不足，在临床上常造成免疫失败的现象，因此，需要不断地更换疫苗毒株来应对AIV的变异。近年来，中国政府陆续推出了一系列H5N1HPAI灭活疫苗，包括Re-1(clade0)，Re-4(clade7)，Re-5(clade2.3.4)，Re-6(clade2.3.2.1)，Re-7(clade7.2)，病毒变异的速度不断加快，给H5N1HPAI的防控带来了巨大压力。

研究发现流感病毒保守的抗原表位主要集中在血凝素蛋白茎区HA2、基质蛋白M2、核蛋白NP，病毒不同蛋白(HA、M、NP)多个表位(B、T细胞表位)的结合能够诱导交叉保护性免疫。Palese等证明HA2的第76-106氨基酸为单克隆抗体12D1的作用靶点，12D1可提供一定程度交叉保护，人工合成76-130位氨基酸，制成肽苗，辅以KLH佐剂，免疫后攻毒有较高异源保护；Townsend等证明NP蛋白第55-69个氨基酸为CD4辅助性T细胞表位，在所有禽流感病毒中高度保守；Arnon等发现NP第380-393氨基酸为CTL表位，人工合成基因，与鞭毛蛋白融合表达，体外制备亚单位疫苗，免疫小鼠后用高致病性H5N1禽流感病毒攻击，可提供一定程度的保护；流感病毒基质蛋白M2的氨基酸序列高度保守，其胞外域的24个氨基酸(M2e)在禽流感病毒中几乎完全相同，研究表明，M2e含有M2的主要保护性抗原决定簇，其作为抗原可以诱导免疫保护，并且具有一定程度的交叉保护力。

针对当前禽流感防控面临的问题，亟需一种提高禽流感灭火疫苗异源保护力的辅助制剂，弥补了禽流感灭活疫苗对异源毒株或变异毒株异源保护力不足的缺陷。

发明内容

为克服上述现有技术的缺点和不足，本发明的首要目的在于提供一种提高禽流感灭活疫苗异源保护力的辅助制剂。本发明的辅助制剂以杆状病毒为载体，可提高H5N1亚型灭活疫苗对异源毒株的保护力，制备简单，便于大批量生产；所述的辅助制剂提高禽流感灭活疫苗的异源保护效力，减少灭活疫苗的更换频率。

本发明的另一目的在于提供上述辅助制剂的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述辅助制剂的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种提高禽流感灭活疫苗异源保护力的辅助制剂，包括重组修饰的昆虫杆状病毒，所述的昆虫杆状病毒能够表达禽流感病毒保守抗原表位。

所述的禽流感病毒保守抗原表位包括禽流感病毒血凝素蛋白茎区HA2的76-130位氨基酸(HA276-130)，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。

所述的禽流感病毒保守抗原表位包括禽流感病毒基质蛋白M2胞外域(M2e)的24个氨基酸残基，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。

所述的禽流感病毒保守抗原表位包括禽流感病毒核蛋白NP的第55-69(NP55-69)位氨基酸残基，其氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。

所述的禽流感病毒保守抗原表位包括禽流感病毒核蛋白NP的第380-393(NP380-393)位氨基酸残基，其氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。

所述的禽流感病毒基质蛋白M2胞外域(M2e)24个氨基酸残基优选为具有三个拷贝的串联重复。

所述的禽流感病毒保守抗原分子还包括柔性连接分子linker，所述的柔性连接分子实现对HA276-130、3M2e、NP55-69、NP380-393氨基酸残基的连接，所述的柔性连接分子的氨基酸序列如SEQIDNO:5所示。

所述的禽流感病毒保守抗原的核苷酸序列如SEQIDNO:6所示。

所述的重组修饰的昆虫杆状病毒的基因组中插入增强型双启动子基因盒，所述双启动子基因盒自上游至下游包括如下组件：多角体蛋白(Polyhedron,PH)启动子，巨细胞病毒早期增强子(thecytomegalovirusearlyenhancer)，血凝素蛋白茎区HA2的76-130位氨基酸编码基因，3个拷贝的M2e编码基因，核蛋白NP的第55-69位氨基酸编码基因，核蛋白NP的第380-393位氨基酸编码基因。

所述的重组修饰的昆虫杆状病毒的构建所用的出发载体为pFastBac^TMDual-WPRE，所述出发载体的PH启动子下游含有土拨鼠肝炎病毒转录后调控原件(Woodchuckhepatitisvirusposttranscriptionalregulatoryelement,WPRE)。

所述的杆状病毒为苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)。

所述的重组修饰的昆虫杆状病毒命名为重组杆状病毒BV-HMNN。

上述的以杆状病毒为载体的禽流感疫苗辅助制剂的制备方法，包括以下步骤：首先通过人工合成HA276-130、3M2e、NP55-69、NP380-393氨基酸残基通过linker连接的编码基因(核苷酸序列信息如SEQIDNO:6所示)，插入pcDNA3.1(+)的CMV启动子后，获得重组质粒pcDNA-HMNN；然后将包含CMV-HMNN的基因片段插入到Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统改造的pFastBac^TMDual-WPRE转移质粒的PH启动子后面，构建重组转移质粒pFast-CMV-HMNN-WPRE；将重组转移质粒转化DH10Bac大肠杆菌，通过转座重组，获得重组杆状病毒质粒Bacmid-HMNN-WPRE；最后用脂质体法将Bacmid-HMNN-WPRE转染sf9昆虫细胞从而获得重组杆状病毒BV-HMNN，即获得以杆状病毒为载体的禽流感灭活疫苗辅助制剂。

上述的辅助制剂在制备禽流感灭活疫苗中应用。

本发明所述的提高禽流感灭活疫苗异源保护力的辅助制剂以杆状病毒为载体，表达了4个H5N1AIV高度保守的且能诱导交叉保护力的抗原表位，即血凝素蛋白茎区HA2的76-130位氨基酸编码基因，3个拷贝的M2e编码基因，核蛋白NP的第55-69位氨基酸编码基因，核蛋白NP的第380-393位氨基酸编码基因，配合禽流感灭活疫苗使用，可以减少攻毒后鸡群的排毒量，提高存活率，抵抗异源毒株的攻击，弥补了禽流感灭活疫苗对异源毒株或变异毒株异源保护力不足的缺陷。以上内容为研制禽流感灭活疫苗辅助制剂的研究提供了新的思路。

本发明与现有技术相比具有如下的优点：

本发明针对现有技术中传统禽流感灭活苗在应对异源保护方面的不足，提供一种提高禽流感灭活疫苗异源保护力的辅助制剂，所述的辅助制剂以杆状病毒为载体的禽流感灭活疫苗辅助制剂，本发明的疫苗辅助制剂可提高H5N1禽流感灭活疫苗对异源毒株的保护力，制备简单，便于大批量生产。本发明选择禽流感病毒高度保守的表位作为抗原，以昆虫杆状病毒作为载体，制备了经肌肉注射免疫的禽流感灭活疫苗辅助制剂，该辅助制剂具有以下特点：(1)能够进入动物细胞介导抗原表达，具有核酸疫苗的特点；(2)与禽流感灭活疫苗联合使用后，在应对异源毒株的攻击时，能够减少排毒；(3)可提高H5N1亚型禽流感灭活疫苗对异源毒株的异源保护力；(4)重组杆状病毒制备简单，便于大规模生产。

通过实验证实，本发明的辅助制剂具体的优点体现在：1)重组杆状病毒辅助制剂BV-HMNN经肌肉注射免疫不会影响Re6灭活苗的HI效价。2)重组杆状病毒辅助制剂BV-HMNN经肌肉注射免疫可以能诱导特异性M2e-IgG抗体产生。3)重组杆状病毒辅助制剂与BV-HMNN与Re6灭活苗联合应用时，在应对异源clade2.3.4.4毒株攻击时可以减少排毒。4)重组杆状病毒辅助制剂与BV-HMNN与Re6灭活苗联合应用时，在应对异源clade2.3.4.4毒株攻击时能获得100％的保护率，而单独Re6灭活苗只能获得50％的保护率。

附图说明

图1为重组质粒pcDNA3.1-HMNN的鉴定结果图，其中M为DNAMarker(DL10000Marker)；1为以质粒pcDNA3.1-HMNN为模板扩增HMNN片段；2为以ddH₂O为模板的阴性对照；3为NheI、BamHI双酶切质粒pcDNA3.1-HMNN获得的DNA片段；

图2为重组质粒pFast-CMV-HMNN-WPRE的鉴定结果图，其中M为DNAMarker(DL10000Marker)；1为以质粒pFast-CMV-HMNN-WPRE为模板扩增CMV-HMNN片段；2为以ddH₂O为模板的阴性对照；3为SalI、HindIII双酶切质粒pFast-CMV-HMNN-WPRE获得的DNA片段；

图3为重组杆状病毒质粒Bacmid-HMNN-WPRE的鉴定结果图，其中M为DNAmaker(DL10000Marker)；1为以重组杆状病毒质粒Bacmid-HMNN-WPRE为模板扩增外源基因；2为以ddH₂O为模板的阴性对照；

图4为免疫后鸡HI抗体水平的检测结果图，其中A图为对同源病毒A/duck/guangdong/383/2008(H5N1)的HI抗体水平；B图为对异源病毒A/goose/guangdong/14079/2013(H5N1)的HI抗体水平；

图5为免疫后鸡血清M2e-IgG抗体水平的检测结果图；

图6为攻毒后鸡拭子排毒的检测结果图，其中A图为攻毒后第3天咽喉、泄殖腔拭子排毒；B图为攻毒后第5天咽喉、泄殖腔拭子排毒；C图为攻毒后第7天咽喉、泄殖腔拭子排毒；

图7为攻毒后鸡的存活率结果图。

具体实施方式

本发明的实施方案通过下列实施例举例说明，所述实施例是为了举例说明本发明，而本发明的实施方案不限于实施例的特定细节。本发明的范围由附属的权利要求限定。

下述实施例中的试验材料，若无特别说明，均是来源于商业途径。所述的试验方法，若无特别说明，均为常规试验方法。

实施例1：重组杆状病毒质粒(Bacmid)的构建与鉴定

(1)重组质粒pcDNA3.1-HMNN的构建与鉴定

含linker序列的HA276-130、3M2e、NP55-69、NP380-393基因片段构成的HMNN重组基因由苏州金唯智合成(其核苷酸序列信息如SEQIDNO:6所示)，并插入pUC57载体(金唯智公司提供)，以pUC57-HMNN为模板利用引物P1、P2扩增HMNN基因，并在上下游引入NheI、BamHI酶切位点，引物序列如下：

P1：5'-CTAGCTAGCATGAGGATCGAGAACC-3'

P2：5'-CGCGGATCCTTAGGTACCGGAAGATCTGCG-3'

引物P1/P2的扩增条件为：94℃预变性5min后进入循环；循环参数为：94℃45s，56℃45s，72℃1min；30个循环后72℃终延伸10min。将PCR产物回收并用NheI和BamHI双酶切后，插入到载体pcDNA3.1(+)的CMV启动子后面NheI和BamHI位点，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，获得载体pcDNA-HMNN。用NheI和BamHI对获得的质粒进行酶切鉴定(见图1)，并对该质粒进行测序，结果正确。

(2)重组质粒pFast-CMV-HMNN-WPRE的构建与鉴定

以重组质粒pcDNA3.1-HMNN为模板，利用引物P3、P4扩增CMV-HMNN基因，并在上下游引入SalI、HindIII酶切位点，引物序列如下：

P3：5'-ACGCGTCGACGTTGACATTGATTATTGAC-3'

P4：5'-CCCAAGCTTTTAGGTACCGGAAGATCTGCG-3'

引物P3/P4的扩增条件均为：94℃预变性5min后进入循环；循环参数为：94℃45s，56℃45s，72℃1.5min；30个循环后72℃终延伸10min。将PCR产物回收并用SalI、HindIII双酶切后，插入到转移质粒pFastBac^TMDual-WPRE的SalI和HindIII位点，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，获得载体pFast-CMV-HMNN-WPRE。用SalI和HindIII对质粒进行酶切鉴定(见图2)，并对该质粒进行测序，结果正确。

(3)重组杆状病毒质粒Bacmid-HMNN-WPRE的构建与鉴定

将供体质粒pFast-CMV-HMNN-WPRE转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，通过转座重组，获得重组杆状病毒质粒Bacmid-HMNN-WPRE，按照Invitrogen公司Bac-to-Bac杆状病毒操作手册，用M13引物扩增片段对其鉴定，结果正确(见图3)。

实施例2：重组杆状病毒BV-HMNN的获得与鉴定

(1)重组杆状病毒BV-HMNN的获得

利用脂质体介导转染法，将重组杆状病毒质粒Bacmid-HMNN-WPRE转染sf9昆虫细胞，于27℃培养；培养至72h时，细胞出现病变，收集细胞培养上清，即可获得第一代重组杆状病毒(P1)BV-HMNN。

(2)重组杆状病毒BV-HMNN转导PK15细胞及其表达能力鉴定

转导前1d，将形态良好的PK15细胞以1×10⁵个/孔的量接入6孔细胞培养板，在37℃培养箱中培养，待细胞长至70％-80％单层，去除培养基，用含钙、镁离子的PBS洗细胞。将重组杆状病毒与PBS按照1﹕4的比例混和后(总体积为1mL)，将此病毒感染液加入到PK15细胞中，室温摇床上转导6小时。然后弃去感染液，用PBS洗一遍，加入2mL的细胞维持液，37℃培养48h，每孔用PBS洗3次，4％多聚甲醛室温固定15min，PBS洗3次。在对应的细胞孔分别加入鼠抗流感病毒M2单克隆抗体(14C2)为一抗，37℃作用30min，PBS洗3次。加入FITC标记的羊抗鼠IgG为二抗，37℃作用30min，PBS洗3次。在倒置荧光显微镜下观察荧光。重组杆状病毒BV-HMNN转导的PK15细胞能产生特异性免疫荧光，说明重组杆状病毒能够转导PK15细胞，并能在CMV启动子的作用下表达外源蛋白。

实施例3：免疫原性分析

(1)重组杆状病毒的浓缩与滴定

使用蔗糖密度梯度离心法对重组杆状病毒进行超离浓缩。用Clontech公司的杆状病毒快速滴定试剂盒对超离浓缩的杆状病毒进行滴度测定，用于动物试验或置于-80℃保存备用。

(2)免疫程序

我国目前流行的H5N1禽流感病毒主要为2.3.2.1及2.3.4分支，近两年，2.3.4分支禽流感病毒流行具有上升趋势并被多次报道，2015年1月，WHO命名了一个新的H5亚型AIV进化分支clade2.3.4.4。Re6疫苗能够对2.3.2.1分支AIV产生很好的保护效果并在这几年被广泛使用，而对新流行2.3.4.4分支AIV不能产生完全保护，本实验在Re6禽流感灭活苗的基础上，配合重组杆状病毒BV-HMNN使用，分析其对当前新流行2.3.4.4分支毒株的异源保护效率。

3周龄SPF鸡随机分为3组并标记，每组12只，免疫分组：第一组为PBS对照组(Mock)，肌肉注射PBS500uL/只；第二组为Re6灭活苗组(Re6)，皮下注射300uL/只；第三组为Re6灭活苗加上重组杆状病毒免疫组(Re6+BV-HMNN)，Re6灭活苗，皮下注射300uL，重组杆状病毒BV-HMNN，肌肉注射500uL(10⁹pfu/只)，免疫后3周翅静脉采血检测HI抗体和M2e-IgG抗体。

(3)血清HI抗体检测结果

血凝板加入25uLPBS，取25uL血清连续倍比稀释，加入等量甲醛灭活的4单位同源抗原A/duck/guangdong/383/2008(H5N1)或异源抗原A/goose/guangdong/14079/2013(H5N1)(本实验室分离保存)，混匀室温静置30分钟，加入等量1％鸡红细胞，室温放置30分钟后观察结果，能完全抑制红细胞凝集的血清最高稀释度为被检血清的HI效价。

无论是对同源病毒还是异源病毒，Re6组与Re6+BV-HMNN组HI都无显著差异(见图4)，发现，BV-HMNN辅助制剂的使用不会影响灭活苗的HI效价。

(4)血清M2e特异性IgG抗体

采用终点稀释ELISA方法检测血清中M2e-IgG抗体水平，具体操作如下：将化学合成的M2e多肽稀释至5ug/ml，100ul/孔包被酶标板，置4℃过夜；洗涤3次，每孔加5％BSA封闭液150ul，37℃封闭30min；倍比稀释的血清100ul/孔，37℃孵育2h；HRP标记的兔抗鸡IgG100ul/孔，37℃孵育30min；加入TMB显色液100ul/孔，室温避光静置15min；最后加入终止液100ul/孔终止反应，用酶标仪在450nm波长下测定OD值；免疫组与PBS对照组OD值比值大于或等于2.1的血清最高稀释倍数即为该血清的效价。

Re6组与Re6+BV-HMNN组显著极差异(见图5)，说明BV-HMNN在免疫鸡体内能诱导特异性M2e-IgG抗体产生。

实施例4：攻毒保护实验研究

(1)攻毒后拭子排毒检测

免疫后3周，滴鼻攻毒10⁶EID₅₀/100uLclade2.3.4.4A/goose/guangdong/14079/2013(H5N1)，攻毒后3、5、7天采集口咽和泄殖腔拭子，10倍连续稀释的上清液接种9-11日龄鸡胚尿囊腔，检测HA活性，使用Reed-Muench方法表示成EID₅₀/mL。

第3天仅PBS免疫对照组检测到5只排毒鸡，Re6与Re6+BV-HMNN组没有检测到排毒鸡。第5天PBS免疫对照组剩下的3只鸡全部检测到排毒，Re6组一只鸡检测到排毒，Re6+BV-HMNN组没有检测到拭子排毒，差异极显著(P<0.001)，第7天PBS组全部死亡，Re6组检测3只鸡排毒，Re6+BV-HMNN组始终没有检测到排毒，差异极显著(P<0.001)，结果如图6所示。

(2)攻毒后鸡的存活率

攻毒后连续14天观察鸡的死亡情况，PBS免疫对照组第6天全部死亡，Re6组死亡6只，保护率为50％，Re6+BV-HMNN组没有鸡死亡，保护率为100％，如图7所示。

上述所有实验结果表明：1)重组杆状病毒辅助制剂BV-HMNN经肌肉注射免疫不会影响Re6灭活苗的HI效价。2)重组杆状病毒辅助制剂BV-HMNN经肌肉注射免疫可以能诱导特异性M2e-IgG抗体产生。3)重组杆状病毒辅助制剂与BV-HMNN与Re6灭活苗联合应用时，在应对异源clade2.3.4.4毒株攻击时可以减少排毒。4)重组杆状病毒辅助制剂与BV-HMNN与Re6灭活苗联合应用时，在应对异源clade2.3.4.4毒株攻击时能获得100％的保护率，而单独Re6灭活苗只能获得50％的保护率。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。