一种提高禽流感灭活疫苗异源保护力的辅助制剂研究

摘要

H5N1高致病性禽流感病毒（H5N1 highly pathogenicavianinfluenzavirus，HPAIV）严重危害禽类养殖业以及人类健康。疫苗接种是防控禽流感的有效策略，当前使用的全病毒灭活苗主要通过血凝素蛋白（HA）诱导特异性中和抗体的产生，而HA变异频繁，造成疫苗对异源毒株的保护力不足。过去几年，中国政府陆续推出了一系列来自H5 HA不同进化分支的灭活疫苗来控制H5N1禽流感病毒，但始终不能跟上病毒变异的节奏。因此，亟需一种提高禽流感灭活疫苗异源保护力的辅助制剂，弥补禽流感灭活疫苗对异源毒株保护力不足的缺陷。
　　研究已证实流感病毒多个保守B、T淋巴细胞表位的结合能够同时刺激体液和细胞免疫反应。研究表明H5N1 AIV血凝素茎区（HA2）76-130位氨基酸高度保守，人工合成的HA276-130多肽免疫小鼠后能够对多个亚型流感病毒的攻击提供保护。A型流感病毒基质蛋白M2胞外区（M2e），同样也是高度保守的抗原，已经被广泛用于通用疫苗的研究。此外，核蛋白（nucleoprotein，NP）第55-69和380-393位氨基酸能够分别刺激辅助型T细胞、细胞毒性T细胞，对流感病毒的交叉保护具有重要作用。尽管表位疫苗能够引起广泛的免疫反应，单独依靠抗原表位难以抵抗H5N1 HPAIV的攻击，基于以上原因，将表位抗原作为一种辅助制剂，与H5N1灭活苗联合使用，也许是一种可行的策略。
　　本研究选取了H5N1 AIV4个高度保守的抗原表位包括HA276-130、3M2e、NP55-69以及NP380-393(HMNN)。含柔性连接序列（linker）的基因片段HMNN由公司合成，克隆至杆状病毒转移载体 pFastBac-VSV-G多角体蛋白启动子下游获得 pFast-G-HMNN。按照 Bac-to-Bac杆状病毒表达系统操作手册获得重组杆状病毒BV-HMNN。
　　为了评价重组杆状病毒与灭活苗联合使用对异源H5N1病毒的保护效力，本研究以SPF鸡作为动物模型，肌肉注射免疫0.1 mL（1010 pfu/mL）BV-HMNN和0.3 mL对应2.3.2.1分支的Re-6灭活苗（Re-6+BV-HMNN），同时设杆状病毒野毒与Re-6灭活苗联合免疫组（Re-6+BV-WT）、Re-6灭活苗单独免疫组（Re-6）以及 PBS对照组（Mock）。单次免疫后3周，用2.3.4.4分支的禽流感病毒A/goose/guangdong/14079/2013（GD/14079，H5N1）进行攻毒保护试验。实验结果表明，当与 Re-6灭活苗联合免疫时，BV-HMNN不会影响灭活苗的HI效价却能显著增加 M2e特异性 IgG抗体滴度。在应对致死剂量的异源 GD/14079病毒攻击时，Re-6+BV-HMNN免疫组保护率为100％，而Re-6免疫组仅获得了50%的保护。在排毒检测方面，Re-6+BV-HMNN组在攻毒后3、5、7天都没有从口咽和泄殖腔拭子中分离到病毒，而Re-6组在攻毒后第5天检测到1只鸡排毒，攻毒后第7天检测到3只鸡排毒。PBS对照组在攻毒后第3天检测到排毒，第5天达排毒高峰，第7天全部死亡。Re-6+BV-WT免疫组的保护效果也优于Re-6单独免疫组，主要表现为鸡的存活率更高、拭子的病毒滴度更低。
　　综上所述，将重组杆状病毒 BV-HMNN作为一种辅助制剂，与 H5N1灭活苗联合使用，能够增强灭活苗的异源保护力，在应对H5N1禽流感病毒的变异以及流感大流行方面具有重要意义。

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1 前言

1.1 流感病毒

1.2 禽流感疫苗的研究进展

1.3 昆虫杆状病毒表达系统

1.4 研究目的和意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 方法

3 结果与分析

3.1 抗原表位氨基酸序列

3.2 重组质粒pcDNA3.1-HMNN的鉴定

3.3 重组转移质粒pFast-G-CMV-HMNN的鉴定

3.4 重组穿梭载体Bacmid-G-HMNN的鉴定

3.5 重组杆状病毒BV-HMNN的获得

3.6 重组杆状病毒结构示意图

3.7 重组杆状病毒BV-HMNN转导CEF细胞

3.8 HI抗体和M2e抗体检测

3.9 保护率

3.10 排毒情况

4 讨论与结论

全 文 总 结

致谢

参考文献

附录ApcDNA3.1 (+)表达载体图谱

附录B pFastBacTM Dual 表达载体图谱

附录C 硕士期间发表文章