用于降低来自含CO气态底物发酵的生物质中硒含量的方法和培养基

摘要

一种用于使合成气和发酵培养基发酵的方法提供高乙醇生产率，同时去除以前认为必要的培养基组分。该方法有效提供至少约1克乙醇/(L·天·克细胞)的比STY，并提供退出发酵的细胞生物质中约1ppm或更小的硒含量。

说明书

本申请要求2013年7月22日提交的美国临时申请61/857,044的权益，所述申请全文通过引用结合到本文中。

本发明提供用于降低退出含CO气态底物发酵的生物质中硒含量的方法和培养基。更具体地讲，本发明提供有效降低退出发酵的细胞生物质中硒含量同时保持高水平乙醇生产率的方法和培养基。

发明背景

发酵在限定的液体培养基中进行。这些培养基一般包括对提高发酵性能重要的各种大量营养物和微量营养物源。与不常见底物例如气态底物相关使用的培养基需要明确限定的培养基以优化性能。厌氧发酵也需要明确限定的培养基。

厌氧微生物可从一氧化碳(CO)通过气态底物发酵产生乙醇。用厌氧微生物从梭菌属(Clostridium)发酵产生乙醇和其它有用产物。例如，美国专利5,173,429描述杨氏梭菌(Clostridiumljungdahlii)ATCCNo.49587，一种从合成气产生乙醇和乙酸盐的厌氧微生物。美国专利5,807,722描述用杨氏梭菌(Clostridiumljungdahlii)ATCCNo.55380使废气转化成有机酸和醇的方法和装置。美国专利6,136,577描述用杨氏梭菌(Clostridiumljungdahlii)ATCCNo.55988和55989使废气转化成乙醇的方法和装置。

美国专利7,285,402描述已知用于气态底物厌氧发酵产生乙醇的培养基。培养基中的各种组分和组分浓度有效提供高水平乙醇生产率。去除某些组分并降低其它组分所需的浓度水平同时保持乙醇生产率可提供显著成本节省，尤其在工业规模发酵。

Wood-Ljungdahl途径在本领域熟知，且包括可分离成两个分支的反应：(1)甲基分支和(2)羰基分支。甲基分支使合成气转化成甲基-四氢叶酸酯(甲基-THF)，而羰基分支使甲基-THF转化成乙酰辅酶A。然后可使乙酰辅酶A转化成乙醇。酶催化Wood-Ljundahl途径中的反应，那些酶需要各种元素用于最佳功能性。例如，甲酸脱氢酶，Wood-Ljundahl途径中的一种重要的酶，需要硒用于最佳活性。

发明概述

一种用于使合成气和发酵培养基发酵的方法提供高乙醇生产率，同时去除以前认为必要的培养基组分。去除某些培养基组分并降低其它培养基组分浓度在工业规模提供显著的操作成本节省。

降低来自含CO气态底物发酵的细胞生物质中硒含量的方法包括使含CO气态底物在发酵培养基中发酵。该方法有效提供至少约1克乙醇/(L·天·克细胞)的比STY，并提供退出发酵的细胞生物质中约1ppm或更小的硒含量。

使含CO气态底物发酵的方法包括使含CO气态底物在具有小于约1ppm硒的发酵培养基中发酵。该方法有效提供至少约1克乙醇/(L·天·克细胞)的比STY。

发酵培养基包含至少约112mg氮/克细胞、至少约10.5mg磷/克细胞或至少约26mg钾/克细胞。发酵培养基具有小于约1.04ppm硼、小于约0.16ppm锰、小于约0.26ppm钼、小于约1ppm硒或小于约0.16ppm铜。

附图简述

由以下附图，本方法的以上和其它方面、数个方面的特征和其它优点将更显而易见。

图1图示说明来自不含硒培养基中杨氏梭菌(Clostridiumljungdahlii)C-01接种的气体转化率和细胞密度。

图2图示说明来自含硒培养基中杨氏梭菌(Clostridiumljungdahlii)C-01接种的气体转化率和细胞密度。

图3显示利用具有和不具有硒的培养基在培养管中生长的自产乙醇梭菌(C.autoethanogenum)培养物之间生长曲线的比较。

发明详述

以下描述不应以限制意义理解，而只为了描述示例性方面的一般原理而作出。本发明的范围应参考权利要求确定。

本发明提供一种方法和培养基组合物，它们令人惊讶且意外地提供高水平乙醇生产率，即使在去除或降低以前认为必要或需要处于一定浓度水平的硒浓度后。

本文所述利用培养基和产乙酸菌在生物反应器中进行的合成气发酵有效用于使合成气中的CO转化成醇和其它产物。在此方面，生产率可表示为STY(空时产率，表示为g总醇/(L·天))。在此方面，所述方法有效用于提供至少约10g或更大总醇/(L·天)的STY(空时产率)。可能的STY值包括约10g总醇/(L·天)至约200g总醇/(L·天)，在另一个方面，约10g总醇/(L·天)至约160g总醇/(L·天)，在另一个方面，约10g总醇/(L·天)至约120g总醇/(L·天)，在另一个方面，约10g总醇/(L·天)至约80g总醇/(L·天)，在另一个方面，约20g总醇/(L·天)至约140g总醇/(L·天)，在另一个方面，约20g总醇/(L·天)至约100g总醇/(L·天)，在另一个方面，约40g总醇/(L·天)至约140g总醇/(L·天)，在另一个方面，约40g总醇/(L·天)至约100g总醇/(L·天)。

定义

除非另外定义，在整个本说明书关于本公开使用的以下术语限定如下，且可包括以下限定定义的单数或复数形式：

修饰任何量的术语“约”是指在真实世界条件遇到的该量的变化，例如，在实验室、中试装置或生产设施。例如，在由“约”修饰时，在混合物或量中利用的成分或测量的量包括在生产设备或实验室内在试验条件测量中通常利用的变化和关注程度。例如，在由“约”修饰时，产物的组分的量包括在设备或实验室在多个试验中批料之间的变化，和在分析方法中固有的变化。无论是否由“约”修饰，所述量包括这些量的等效量。本文所述和由“约”修饰的任何量也可作为未由“约”修饰的量用于本公开。

本文使用术语“气态底物”以在非限制意义上包括含一种或多种气体或从一种或多种气体得到的底物。

术语“合成气”或“合成气体”是指合成气体，它是对包含不同量一氧化碳和氢的气体混合物给予的名称。制备方法的实例包括天然气或烃蒸汽重整产氢，煤的气化，和一些类型的废物-能量气化设备。这一名称来自其用作产生合成天然气(SNG)和制备氨或甲醇的中间体。合成气易燃，且通常用作燃料源或用作中间体制备其它化学品。

术语“发酵器”包括由一个或多个容器和/或塔或管布置组成的发酵装置，包括连续搅拌釜反应器(CSTR)、固定细胞反应器(ICR)、滴流床反应器(TBR)、移动床生物膜反应器(MBBR)、泡罩塔、气升发酵器、膜反应器(例如，中空纤维膜生物反应器(HFMBR))、静态混合器或适用于气体-液体接触的其它容器或其它装置。

术语“发酵”、“发酵过程”或“发酵反应”等旨在包括过程的生长阶段和产物生物合成阶段二者。在一个方面，发酵指CO转化成醇。

术语“细胞密度”指微生物细胞质量/发酵液单位体积，例如克/升。

在与发酵过程相关使用时，术语“提高效率”、“提高的效率”等包括提高以下一个或多个：发酵中微生物生长速率、消耗的每体积或质量底物(例如，一氧化碳)产生的所需产物(例如，醇)的体积或质量、所需产物的生产速率或生产水平和与其它发酵副产物比较产生的所需产物的相对比例。

本文所用“总醇”包括乙醇、丁醇、丙醇和甲醇。在一个方面，总醇可包含至少约75%重量或更多乙醇，在另一个方面，约80%重量或更多乙醇，在另一个方面，约85%重量或更多乙醇，在另一个方面，约90%重量或更多乙醇，在另一个方面，约95%重量或更多乙醇。在另一个方面，总醇可包含约25%重量或更少丁醇。

术语“比CO摄入”指微生物细胞单位质量(g)消耗的CO的量(mmol)/单位时间(分钟)，即，mmol/克/分钟。

含CO底物

含CO底物可包括包括CO的任何气体。在该方面，含有CO的气体可包括合成气、工业用气和它们的混合物。

合成气可由任何已知的来源提供。在一方面，合成气可源自碳质材料的气化。气化涉及在限制供应的氧中部分燃烧生物质。所得到的气体主要包括CO和H₂。在该方面，合成气将含有至少约10mol%CO，在一方面，至少约20mol%，在一方面，约10-约100mol%，在另一方面，约20-约100mol%CO，在另一方面，约30-约90mol%CO，在另一方面，约40-约80mol%CO，和在另一方面，约50-约70mol%CO。合适的气化方法和设备的一些实例在均在2011年4月6日提交的美国序列号61/516,667、61/516,704和61/516,646和均在2012年3月22日提交的美国序列号13/427,144、13/427,193和13/427,247中提供，均通过引用结合到本文中。

在另一方面，所述方法适用于支持由气态底物(例如高体积含有CO的工业烟道气)生产醇。在一些方面，包括CO的气体源自含碳废物(例如，工业废气)或源自其它废物的气化。因此，所述方法代表用于捕集原本排放至环境的碳的有效方法。工业烟道气的实例包括在黑色金属产品制造、有色金属产品制造、石油精炼过程、煤的气化、生物质气化、电力生产、炭黑生产、氨生产、甲醇生产和焦炭制造期间产生的气体。

取决于含CO底物的组成，含CO底物可直接提供至发酵过程或可进一步改性以包括合适的H₂:CO摩尔比。在一方面，提供至发酵器的含CO底物的H₂:CO摩尔比为约0.2或更多，在另一方面，约0.25或更多，和在另一方面，约0.5或更多。在另一方面，提供至发酵器的含CO底物可包括约40摩尔%或更多的CO加上H₂和约30摩尔%或更少的CO，在另一方面，约50摩尔%或更多的CO加上H₂和约35摩尔%或更少的CO，和在另一方面，约80摩尔%或更多的CO加上H₂和约20摩尔%或更少的CO。

在一方面，含CO底物主要包括CO和H₂。在该方面，含CO底物将含有至少约10mol%CO，在一方面，至少约20mol%，在一方面，约10-约100mol%，在另一方面，约20-约100mol%CO，在另一方面，约30-约90mol%CO，在另一方面，约40-约80mol%CO，和在另一方面，约50-约70mol%CO。含CO底物的CO/CO₂比率为至少约0.75，在另一方面，至少约1.0，和在另一方面，至少约1.5。

在一方面，气体分离器设置以基本上分离至少一部分气体流，其中该部分包括一种或多种组分。例如，气体分离器可由包含以下组分CO、CO₂、H₂的气体流分离CO₂，其中可将CO₂通向CO₂去除器，剩余的气体流(包含CO和H₂)可通向生物反应器。可利用本领域已知的任何气体分离器。在该方面，提供至发酵器的合成气将具有约10mol%或更少的CO₂，在另一方面，约1mol%或更少的CO₂，和在另一方面，约0.1mol%或更少的CO₂。

某些气体流可包括高浓度的CO和低浓度的H₂。在一方面，可期望优化底物流的组成，以实现较高效率的醇生产和/或总体碳捕集。例如，在将流通向生物反应器之前可提高底物流中H₂的浓度。

根据本发明的具体的方面，可将来自两个或更多个来源的流合并和/或共混，以产生期望的和/或优化的底物流。例如，包含高浓度的CO的流(例如来自轧钢机转化炉的排气)可与包含高浓度的H₂的流(例如来自轧钢机焦炭炉的尾气)合并。

取决于含有CO的气态底物的组成，还可期望在将其引入到发酵之前进行处理以除去任何不期望的杂质，例如灰尘颗粒。例如，可利用已知的方法过滤或洗涤气态底物。

生物反应器设计和操作

发酵器设计的说明描述于均在2012年5月15日提交的美国序列号13/471,827和13/471,858和2012年5月16日提交的美国序列号13/473,167，均通过引用结合到本文中。

根据一方面，通过向反应器容器加入培养基，开始发酵过程。培养基组成的一些实例描述于2012年5月22日提交的美国序列号61/650,098和61/650,093和2001年7月23日提交的美国专利7,285,402，均通过引用结合到本文中。可将培养基灭菌以除去不期望的微生物，并且反应器用期望的微生物接种。可能不总是需要灭菌。

在一个方面，所用微生物包括产乙酸菌。可用产乙酸菌的实例包括梭菌属(Clostridium)产乙酸菌，例如杨氏梭菌(lostridiumljungdahlii)菌株，包括WO2000/68407、EP117309、美国专利5,173,429、5,593,886和6,368,819、WO1998/00558和WO2002/08438中所述的那些菌株；自产乙醇梭菌(Clostridiumautoethanogenum)(DSMZ的DSM10061和DSM19630,德国)菌株，包括WO2007/117157和WO2009/151342中所述的那些菌株；和拉格利梭菌(Clostridiumragsdali)(P11,ATCCBAA-622)及巴奇嗜碱菌(Alkalibaculumbacchi)(CP11,ATCCBAA-1772)，包括分别描述于美国专利7,704,723和“BiofuelsandBioproductsfromBiomass-GeneratedSynthesisGas”(来自生物质产生的合成气的生物燃料和生物产物),HasanAtiyeh,提出于OklahomaEPSCoRAnnualStateConference,2010年4月29日的那些菌株；及食羧基梭菌(Clostridiumcarboxidivorans)(ATCCPTA-7827)，描述于美国专利申请2007/0276447。其它适用的微生物包括穆尔菌(Moorella)属，包括穆尔菌种(Moorellasp.)HUC22-1；和羧基嗜热菌(Carboxydothermus)属。这些文献分别通过引用结合到本文中。可使用两种或更多种微生物的混合培养物。

有用的细菌的一些实例包括凯伍产醋菌(Acetogeniumkivui)、潮湿厌氧醋菌(Acetoanaerobiumnoterae)、伍氏醋酸杆菌(Acetobacteriumwoodii)、巴奇嗜碱菌(Alkalibaculumbacchi)CP11(ATCCBAA-1772)、产生性布洛提菌(Blautiaproducta)、嗜甲基丁酸杆菌(Butyribacteriummethylotrophicum)、地下嗜热厌氧菌(Caldanaerobactersubterraneous)、太平洋地下嗜热厌氧菌(Caldanaerobactersubterraneouspacificus)、产氢羧基嗜热菌(Carboxydothermushydrogenoformans)、醋酸杆菌(Clostridiumaceticum)、丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)P262(德国DSMZ之DSM19630)、自产乙醇梭菌(Clostridiumautoethanogenum)(德国DSMZ之DSM19630)、自产乙醇梭菌(Clostridiumautoethanogenum)(德国DSMZ之DSM10061)、自产乙醇梭菌(Clostridiumautoethanogenum)(德国DSMZ之DSM23693)、自产乙醇梭菌(Clostridiumautoethanogenum)(德国DSMZ之DSM24138)、食羧基梭菌(Clostridiumcarboxidivorans)P7(ATCCPTA-7827)、克氏梭菌(Clostridiumcoskatii)(ATCCPTA-10522)、德可氏梭菌(Clostridiumdrakei)、杨氏梭菌(Clostridiumljungdahlii)PETC(ATCC49587)、杨氏梭菌(Clostridiumljungdahlii)ERI2(ATCC55380)、杨氏梭菌(Clostridiumljungdahlii)C-01(ATCC55988)、杨氏梭菌(Clostridiumljungdahlii)O-52(ATCC55889)、大梭菌(Clostridiummagnum)、巴氏梭菌(Clostridiumpasteurianum(德国DSMZ之DSM525)、拉格利梭菌(Clostridiumragsdali)P11(ATCCBAA-622)、粪味梭菌(Clostridiumscatologenes)、热醋酸梭状芽胞杆菌(Clostridiumthermoaceticum)、突那梭菌(Clostridiumultunense)、库氏脱硫肠状菌(Desulfotomaculumkuznetsovii)、粘液真杆菌(Eubacteriumlimosum)、硫还原地杆菌(Geobactersulfurreducens)、噬乙酸甲烷八叠球菌(Methanosarcinaacetivorans)、巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcinabarkeri)、热乙酸穆尔氏菌(Morrellathermoacetica)、热自养穆尔氏菌(Morrellathermoautotrophica)、芬妮产醋杆菌(Oxobacterpfennigii)、产生消化链球菌(Peptostreptococcusproductus)、产生瘤胃球菌(Ruminococcusproductus)、凯伍嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacterkivui)及它们的混合物。

该组的所有菌株具有约4.2MBp基因组大小(Kopke等人,2010)和约32%molGC组成(Abrini等人,1994;Kopke等人,2010;Tanner等人,1993)(WO2008/028055;美国专利2011/0229947)及关于Wood-Ljungdahl途径酶(一氧化碳脱氢酶、甲酰四氢叶酸合成酶、亚甲基四氢叶酸脱氢酶、甲酰四氢叶酸环化水解酶、亚甲基四氢叶酸还原酶和一氧化碳脱氢酶/乙酰辅酶A合酶)、氢化酶、甲酸脱氢酶、Rnf复合体(rnfCDGEAB)、丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、醛:铁氧还蛋白氧化还原酶(Kopke等人,2010,2011)编码的保守必需关键基因操纵子。已发现负责气体摄入的Wood-Ljungdahl途径基因的组合和数目在所有物种中相同，尽管有核酸和氨基酸序列差异(Kopke等人,2011)。

这些株均具有相似形态和大小(对数生长细胞在0.5-0.7×3-5μm之间)，嗜温(最佳生长温度在30-37℃之间)，且严格厌氧(Abrini等人,1994;Tanner等人,1993)(WO2008/028055)。另外，它们均共有相同的主要系统发育特征，例如，相同pH范围(pH4-7.5，最佳初始pH5.5-6)、对含CO气体具有类似生长速率的强自养培育生长及利用在某些条件下生成的少量2,3-丁二醇和乳酸以乙醇和乙酸作为主要发酵最终产物的代谢型(Abrini等人,1994;Kopke等人,2011;Tanner等人,1993)(WO2008/028055)。已对所有物种观察吲哚生产。然而，这些物种的区别在于不同糖(例如，鼠李糖、阿拉伯糖)、酸(例如，葡糖酸盐、柠檬酸盐)、氨基酸(例如，精氨酸、组氨酸)或其它底物(例如，甜菜碱、丁醇)的底物利用率。已发现一些物种对某些维生素(例如，硫胺素、生物素)为营养缺陷体，而另一些不是。

因此，所述特征不针对一种生物体，例如自产乙醇梭菌(C.autoethanogenum)或杨氏梭菌(C.ljungdahlii)，而是对一氧化碳营养型乙醇合成梭菌的一般特征。因此，可预料本发明跨这些株有效，虽然可能有性能差异。

发酵应期望在发生期望的发酵(例如，CO至乙醇)的适当的条件下进行。应考虑的反应条件包括压力、温度、气体流速、液体流速、培养基pH、培养基氧化还原电位、搅拌速率(如果利用连续搅拌槽反应器)、接种物水平、最大气体底物浓度，以确保液相中的CO不会变为限制性，且确保最大产物浓度以避免产物抑制。

本发明的方法可用于维持微生物培养物的生存能力，其中微生物培养物为CO受限，使得CO传递到溶液中的速率低于培养物的吸收速率。当包含CO的底物不能连续提供至微生物培养物时，可出现这种情况；传质速率低；或在底物流中存在不足够的CO以在优化的温度下维持培养物活力。在这样的实施方式中，微生物培养物将快速耗尽在液体营养培养基中溶解的CO，并且由于其它底物不能足够快速提供而变得底物受限。

启动：在接种后，建立有效供应初始微生物群落的初始进料气体供应速率。分析流出物气体，以测定流出物气体的含量。气体分析的结果用于控制进料气体速率。在该方面，所述方法提供约0.5-约0.9的计算CO浓度:初始细胞密度比率，在另一方面，约0.6-约0.8，在另一方面，约0.5-约0.7，和在另一方面，约0.5-约0.6。

在另一方面，发酵方法包括向发酵培养基提供合成气，其量有效提供在发酵培养基中约0.15mM-约0.70mM的初始计算CO浓度，在另一方面，约0.15mM-约0.50mM，在另一方面，约0.15mM-约0.35mM，在另一方面，约0.20mM-约0.30mM，和在另一方面，约0.23mM-约0.27mM。与起始细胞密度相比，所述方法有效提高细胞密度。

启动后：在达到期望的水平后，从反应器取出液相和细胞材料并且补充培养基。所述方法有效提高细胞密度至约2.0克/升或更多，在另一方面，约2-约30克/升，在另一方面，约2-约25克/升，在另一方面，约2-约20克/升，在另一方面，约2-约10克/升，在另一方面，约2-约8克/升，在另一方面，约3-约30克/升，在另一方面，约3-约6克/升，和在另一方面，约4-约5克/升。

培养基组合物

在一个方面，培养基包含至少一种或多种氮源、至少一种或多种磷源和至少一种或多种钾源。培养基可包含这三种任何之一、这三种的任何组合，在一个重要方面，包含所有这三种。氮源可包括选自氯化铵、氢氧化铵、磷酸铵、硫酸铵、硝酸铵及其混合物的氮源。磷源可包括选自磷酸、磷酸铵、磷酸钾及其混合物的磷源。钾源可包括选自氯化钾、磷酸钾、硝酸钾、硫酸钾及其混合物的钾源。

在一个方面，培养基可包含铁、钨、镍、钴、镁、硫和硫胺素中的一个或多个。培养基可包含这些组分任何之一、任何组合，在一个重要方面，包含所有这些组分。铁可包括选自氯化亚铁、硫酸亚铁及其混合物的铁源。钨源可包括选自钨酸钠、钨酸钙、钨酸钾及其混合物的钨源。镍源可包括选自氯化镍、硫酸镍、硝酸镍及其混合物的镍源。钴源可包括选自氯化钴、氟化钴、溴化钴、碘化钴及其混合物的钴源。镁源可包括选自氯化镁、硫酸镁、磷酸镁及其混合物的镁源。硫源可包括半胱氨酸、硫化钠及其混合物。

不同组分的浓度如下：

过程操作保持约4.2至约4.8的pH。培养基包含小于约0.01g/L酵母提取物和小于约0.01g/L碳水化合物。

在此方面，培养基可具有包含B、Mn、Mo和Cu的一种或多种营养物的降低浓度水平。培养基中营养物浓度可如下：

B：小于约1.04ppmB，在另一个方面，小于约1.0ppmB，在另一个方面，小于约0.75ppmB，在另一个方面，小于约0.5ppmB，在另一个方面，小于约0.025ppmB；

Mn：小于约0.16ppmMn，在另一个方面，小于约0.15ppmMn，在另一个方面，小于约0.10ppmMn，在另一个方面，小于约0.05ppmMn，在另一个方面，小于约0.0025ppmMn；

Mo：小于约0.26ppmMo，在另一个方面，小于约0.25ppmMo，在另一个方面，小于约0.20ppmMo，在另一个方面，小于约0.10ppmMo，在另一个方面，小于约0.001ppmMo；或

Cu：小于约0.16ppmCu，在另一个方面，小于约0.15ppmCu，在另一个方面，小于约0.10ppmCu，在另一个方面，小于约0.05ppmCu，在另一个方面，小于约0.01ppmCu；

在另一个方面，重量比可如下：

NH₄⁺:B：约625:1或更大，在另一个方面，约650:1或更大，在另一个方面，约675:1或更大，在另一个方面，约700:1或更大，在另一个方面，约750:1或更大，在另一个方面，约800:1或更大；或

NH₄⁺:Mn：约4050:1或更大，在另一个方面，约4100:1或更大，在另一个方面，约4200:1或更大，在另一个方面，约4300:1或更大，在另一个方面，约4400:1或更大，在另一个方面，约4500:1或更大；或

NH₄⁺:Mo：约2500:1或更大，在另一个方面，约2600:1或更大，在另一个方面，约2700:1或更大，在另一个方面，约2800:1或更大，在另一个方面，约2900:1或更大，在另一个方面，约3000:1或更大；或

NH₄⁺:Cu：约4050:1或更大，在另一个方面，约4100:1或更大，在另一个方面，约4200:1或更大，在另一个方面，约4300:1或更大，在另一个方面，约4400:1或更大，在另一个方面，约4500:1或更大；或

P:B：约30:1或更大，在另一个方面，约35:1或更大，在另一个方面，约40:1或更大，在另一个方面，约45:1或更大，在另一个方面，约50:1或更大，在另一个方面，约100:1或更大；或

P:Mn：约190:1或更大，在另一个方面，约200:1或更大，在另一个方面，约225:1或更大，在另一个方面，约250:1或更大，在另一个方面，约275:1或更大，在另一个方面，约300:1或更大；或

P:Mo：约120:1或更大，在另一个方面，约130:1或更大，在另一个方面，约140:1或更大，在另一个方面，约150:1或更大，在另一个方面，约175:1或更大，在另一个方面，约200:1或更大；或

P:Cu：约190:1或更大，在另一个方面，约200:1或更大，在另一个方面，约225:1或更大，在另一个方面，约250:1或更大，在另一个方面，约275:1或更大，在另一个方面，约300:1或更大；或

K:B：约35:1或更大，在另一个方面，约40:1或更大，在另一个方面，约45:1或更大，在另一个方面，约50:1或更大，在另一个方面，约75:1或更大，在另一个方面，约100:1或更大；或

K:Mn：约245:1或更大，在另一个方面，约250:1或更大，在另一个方面，约260:1或更大，在另一个方面，约270:1或更大，在另一个方面，约280:1或更大，在另一个方面，约300:1或更大；或

K:Mo：约150:1或更大，在另一个方面，约250:1或更大，在另一个方面，约260:1或更大，在另一个方面，约270:1或更大，在另一个方面，约280:1或更大，在另一个方面，约300:1或更大；或

K:Cu：约245:1或更大，在另一个方面，约250:1或更大，在另一个方面，约260:1或更大，在另一个方面，约270:1或更大，在另一个方面，约280:1或更大，在另一个方面，约300:1或更大。

在另一个方面，方法和培养基有效提供至少约5%至约99%的CO转化率，在另一个方面，约10%至约90%，在另一个方面，约20%至约80%，在另一个方面，约30%至约70%，在另一个方面，约40%至约90%。

在另一个方面，方法和培养基有效提供退出发酵的生物质中约1ppm或更小的Se含量。在另一个方面，约0.75ppm或更小，在另一个方面，约0.5ppm或更小，均以干重计。在另一个方面，退出发酵的生物质中的Se含量可以为约0.01至约1ppm，在另一个方面，约0.01至约0.9ppm，在另一个方面，约0.01至约0.75ppm，在另一个方面，约0.01至约0.5ppm，在另一个方面，约0.01至约0.25ppm，在另一个方面，约0.025至约0.1ppm，在另一个方面，约0.025至约0.9ppm，在另一个方面，约0.025至约0.75ppm，在另一个方面，约0.025至约0.5ppm，在另一个方面，约0.5至约1ppm，在另一个方面，约0.5至约0.9ppm，在另一个方面，约0.5至约0.75ppm。在一个方面，Se可包括其它形式的硒，包括-2、+2、+4和+6氧化态，并且可包括例如亚硒酸盐和硒酸盐。指示范围指Se当量。

实施例

实施例1：评价在具有亚硒酸钠的培养基中的培养物生长

制备培养基：培养基如下制备：

*维生素溶液：生物素，0.04g/L；盐酸硫胺素，0.1g/L；和d-泛酸钙，0.0505g/L

反应器接种和维持：装配BioFlo310系列反应器(NewBrunswick)用于厌氧发酵，包括气体管线(包括输入和输出二者)、培养物清洗、进料管线和细胞循环系统(包括渗透物抽吸)。接种前，用2L培养基填充反应器，并用合成气清洗至少2小时，使温度升高到38℃，并用0.5MNH₄OH使pH达到并保持在4.4和4.7之间。使氢硫化钠(0.2%体积)与反应器培养基混合，达到9×10^-4%体积最终浓度。试验期间，保持搅拌在800rpm。

反应器用来自母反应器的指数生长细胞接种，以达到0.3g/L(细胞干重)初始细胞浓度。以15mL/min合成气气体流速开始(30%CO,15%H₂,10%CO₂)，每小时一次进行10%气体流速提高，以支持细胞生长并保持H₂和CO转化率分别>25%和>80%，通过气相色谱(GC,SRI8610C)测定。在整个试验中，保持气体流速在250-300mL/min之间。调节培养基流速，以达到18-24小时液体保留时间，并用基于中空纤维的细胞循环系统控制细胞密度。使氢硫化钠(0.2%体积)直接与反应器培养基以0.2mL/min恒定速率连续混合。一旦培养物达到2.5至3g/L细胞干重的细胞密度(通过OD₅₈₀确定)，就关闭细胞循环系统，且反应器作为一次通过系统运行。为了分析产物形成，每4小时取液体样品，并用LiquidGC,ShimadzuGC-2014分析。保持反应器处于稳态至少5天。

下表总结在含硒(Se(+))培养基中的稳态发酵性能，图1图示说明随时间的细胞生长和气体转化率。

实施例2评价在没有亚硒酸钠的培养基中的培养物生长

制备培养基：如实施例1中制备硒(-)培养基，但从配方省略亚硒酸钠。

反应器接种和维持：如实施例1中所述使用装配。

下表总结在无硒(Se(-))培养基中的发酵性能，图2图示说明随时间的细胞生长和气体转化率。

实施例3：细胞团中Se的定量

在反应器关闭时，移出200mL培养物，并在Allegra25R离心机(BeckmanCoulter)中在4,000rpm在4℃离心5min。然后洗涤粒料，并用冰冷的50mL0.8%NaCl溶液再次悬浮，并再一次离心。在-80℃储存所得团块，直至处理。并行地，对于Se的存在，用标准电感耦合等离子体分析(ICP)法分析培养基样品，如‘StandardMethodsfortheExaminationofWaterandWastewater”(水和废水的标准检验方法)第19版,A.D.Eaton,L.S.Clesceri和A.E.Greenberg,1995,3-34页3120B章中所述。

细胞分析：用电感耦合等离子体分析(ICP)分析测定细胞的硒含量。样品最初用硝酸(5%体积)和H₂O₂(10%体积)在120℃消化2小时，以使细胞溶解(‘StandardMethodsfortheExaminationofWaterandWastewater”(水和废水的标准检验方法)第19版,A.D.Eaton,L.S.Clesceri和A.E.Greenberg,1995,3-5页,3030E章)，使所得消化物经受ICP。

结果：评价培养基中的硒含量。下表总结试验中所用Se(+)和无Se培养基中的金属含量。注意到，无Se培养基中的Se含量为使用标准ICP分析的检测限，即0.03ppm(*)。

结果：评价细胞中的硒含量。细胞中Se的分析显示，与硒盐存在下生长细胞中的34ppm比较，在亚硒酸钠不存在下生长的细胞具有484ppb(~0.5ppm)Se含量。这使细胞Se含量减小98.5%。

实施例4：用培养管在无Se培养基中的自产乙醇梭菌(C.autoethanogenum)细胞生长速率的评价

用以下培养基(1%MES)在培养管中生长。

1.无机盐储备溶液(NaCl80,g/L;NH₄Cl,100g/L;KCl,10g/L;KH₂PO₄,10g/L;MgSO₄·7H₂O,20g/L;CaCl₂·H₂O,4g/L)

2.刃天青溶液(1g/L刃天青钠盐)。

用自产乙醇梭菌(C.autoethanogenum)(DSM#10061)的冷冻储备接种用4mL适合培养基填充的培养管，并用合成气加压到4psig。为了制备菌种培养物，管每日用合成气充气，直至培养物达到1.2的OD₅₈₀。将4ml1%MES+Se和/或1%MES-Se用活细胞接种，并用合成气加压。首先在3,000rpm离心接种物，以使细胞在厌氧条件粒化。随后，使粒料重新悬浮于新鲜Se(+)或Se(-)培养基，并用其以OD₅₈₀=0.3的目标接种新培养管。然后使培养物在37℃振荡培养箱中在70rpm生长。随时间监测在Se(+)或Se(-)1%MES培养基中以初始OD₅₈₀=0.3用自产乙醇梭菌(C.autoethanogenum)接种的培养管。在接种后立即测定各管的光密度，并在随后每天一次。如图3中所见，在两种培养基中的细胞生长到OD₅₈₀>1。在指数期，两种培养基支持相同生长速率。

实施例5：评价在生物反应器中用无Se培养基的自产乙醇梭菌(C.autoethanogenum)的发酵性能和生产率

用自产乙醇梭菌(C.autoethanogenum)培养物接种包含实验培养基的种反应器(1L反应器，SR0700ODLS搅拌釜生物反应器，DASGIP)。接种和反应器维持基本如实施例1中所述。一旦该培养物达到稳态，就用其接种包含无硒实验培养基的第二反应器。然后使子培养物达到稳态，并在那种状态持续不小于72小时。在此时间也监测母反应器，作为比较。

下表总结利用自产乙醇梭菌(C.autoethanogenum)试验的培养基组合物。

*维生素溶液：生物素，0.04g/L；盐酸硫胺素，0.1g/L；和d-泛酸钙，0.0505g/L

注意：不利用Na₂SeO₃，对试验部分制备单独MPFN，其中培养物在不含硒的培养基中繁殖。

下表总结Se(+)和Se(-)培养基中自产乙醇梭菌(C.autoethanogenum)的稳态发酵性能。在两种情况下的参数均落在预期性能范围内，在两者之间不显示显著差异。

可对各培养物生产率观察到类似趋势，如下所示。

虽然已通过具体方面、实施例及其应用描述了本文公开的本发明，但本领域的技术人员可在不脱离权利要求阐述的本发明的范围的情况下对其作出很多修改和变化。