一种新型的结核分枝杆菌胞外核酸酶及其用途

摘要

本发明公开了一种新型的结核分枝杆菌胞外核酸酶及其用途。本发明证实了Rv0888是结核分枝杆菌的一个胞外核酸酶。基于序列分析，Rv0888核酸酶与已知的胞外核酸酶没有同源性，表明Rv0888是一个新型的胞外核酸酶。Rv0888蛋白的活性发挥需要二价离子的辅助，其最佳的温度和pH分别为41℃和6.5。本发明还提出了橄榄苦苷，6-姜酚，补骨脂乙素以及类叶升麻苷这四种中药单体在抑制该核酸酶中的用途。定点突变研究显示H353,D387和D438残基对Rv0888的活性起着催化作用。体内感染试验证实了重组耻垢构分枝杆菌Rv0888NS/MS和Rv0888S/MS在小鼠肺中的持留能力明显高于pMV262/MS，并且Rv0888NS/MS和Rv0888S/MS在小鼠的肺中能产生明显的病理变化，表明Rv0888是分枝杆菌感染和致病性所必须的。

说明书

技术领域

本发明涉及一种胞外核酸酶及其用途，特别涉及一种新型的结核分枝杆菌胞外核酸酶及其用途，本发明属于生物技术领域。

背景技术

许多种细菌能产生胞外核酸酶，胞外核酸酶对于细菌的毒力、生物被膜的形成、利用胞外DNA获取营养和降解胞外诱捕网(NETs)中的DNA中起着重要作用。比如希瓦氏菌、沙雷氏菌、金黄色葡萄球菌的胞外核酸酶能够降解胞外的DNA以获取其基本的营养成分-磷源，碳源和氮源。Seper的最近研究表明野生型的霍乱弧菌能通过其本身的两种胞外核酸酶(Dns和Xds)降解NETs中的DNA成分。金黄色葡萄球菌的胞外核酸酶也能降解NETs，进而引发半胱天冬酶-3介导的免疫细胞死亡。然而无乳链球菌的胞外核酸酶(Gbs0661)能够攻击NETs并且是细菌毒力所必须的。(NETs-中性粒细胞胞外诱捕网是宿主的防御反应中一个重要组成部分，能够固定微生物随后并清楚)。在葡萄糖缺乏的培养基中，枯草芽孢杆菌168的孢子形成阶段释放的脱氧核糖核酸酶(NucB)能够降解生物被膜的重要核酸为自身利用。

结核分枝杆菌(M.tuberculosis)是革兰氏阳性细菌，是引起结核病的病原菌。结核病一直是世界上死亡率最高的疾病之一。2013年，大约有900万人感染结核病，约有150万人死于这种疾病，其中36万人是HIV阳性。结核分枝杆菌进入肺之后，被巨噬细胞和树突状细胞所吞噬，然而结核分枝杆菌能够在这些免疫细胞中扩散，甚至逃脱这些吞噬体迁移到淋巴结而扩散感染。

革兰氏阳性细菌的胞外核酸酶在细菌的毒力和降解胞外诱捕网(中性粒细胞或者巨噬细胞释放)的DNA方面起着非常重要的作用。之前有关胞外核酸酶的研究主要集中在无乳链球菌，化脓性链球菌和金黄色葡萄球菌。虽然之前报道描述过结核分枝杆菌胞内核酸酶，但是至今没有数据显示结核分枝杆菌存在胞外核酸酶。在次，本发明首次发现并证实Rv0888蛋白是结核分枝杆菌的胞外核酸酶。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种新型的结核分枝杆菌胞外核酸酶及其用途。

本发明的目的之二在于提供一种能够抑制所述结核分枝杆菌胞外核酸酶的抑制剂。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

在本发明中，我们证实了Rv0888蛋白是第一个来自于结核分枝杆菌的胞外核酸酶，属于endonuclease/exonuclease/phosphatase家族(PfamfamilyPF03372)，在结核分枝杆菌的培养滤液中能检测到鞘磷脂酶的活性。进一步的，本发明还证明了该胞外核酸酶在降解不同类型的核酸(基因组DNA，双链PCR产物，质粒DNA和面包酵母RNA)方面具有高度的活性，Rv0888发挥其核酸酶活性需要二价离子的辅助(Ca²⁺和Mn²⁺)。另外四种中药单体(6-姜酚，类叶升麻苷，橄榄苦苷，补骨脂乙素)能够抑制Rv0888的核酸酶活性。

在此基础上，本发明提出了一种新型的结核分枝杆菌胞外核酸酶，命名为Rv0888，其氨基酸序列如SEQIDNO.1、SEQIDNO.3或SEQIDNO.5所示。

进一步的，本发明还提出了编码所述的结核分枝杆菌胞外核酸酶的核苷酸序列。优选的，所述的核苷酸序列如SEQIDNO.2、SEQIDNO.4或SEQIDNO.6所示。

含有所述的核苷酸序列的表达载体以及含有该表达载体的宿主细胞也自然落在本发明的保护范围之内。

再进一步的，本发明还提出了所述的结核分枝杆菌胞外核酸酶在降解核酸中的用途。

其中，优选的，所述的核酸包括线性双链DNA，环状质粒DNA，染色体DNA或者RNA。

更进一步的，本发明提出了橄榄苦苷，6-姜酚，补骨脂乙素或类叶升麻苷在抑制所述的结核分枝杆菌胞外核酸酶中的用途。

Rv0888核酸酶活性显示在33℃-51℃的温度范围内，最佳的温度是41℃。这个温度与人和动物在感染结核分枝杆菌后体温升高是一致的，表明Rv0888也许与结核分枝杆菌的毒力有关。与其他的脱氧核糖酸酶/核酸酶相似，Rv0888核酸酶发挥活性也需要二价离子。最佳的二价离子是Mn²⁺以及Ca²⁺，其他的二价离子(Mg²⁺,Ba²⁺,Ni²⁺)也有不同程度的促进作用(表1)。这些结果表明与之前报道的大肠杆菌核酸酶一样，Rv0888的催化活性位点与二价离子的直径没有关系，而是这些离子结合在不同的氨基酸维持其活性。金属螯合剂EDTA对Rv0888的活性起着很强的抑制效果，表明金属离子对于核酸活性是必须的，并且在酶结构稳定性方面起着非常重要的作用。

氨基酸置换研究表明D438位氨基酸在Rv0888核酸酶活性方面起着关键的作用，H353和D387在Rv0888活性方面也起着比较积极的作用。与其他的含有保守基序的DRGH的肺炎链球菌胞外核酸酶EndA22和DKGH的无乳链球菌的胞外核酸酶Gbs06616相比，这些重要的氨基酸残基与他们是不同的。Rv0888蛋白与其他已知的核酸酶没有任何同源性(图9)，因此我们的数据表明Rv0888是一个非特异性核酸酶家族成员之一。

由于肺结核与HIV共感染和新出现的无法治疗的或者广泛耐药的结核分枝杆菌，使得肺结核很难控制。迫切需要研发新的药物和更有效的疫苗。因此需要在遗传基础上理解结核分枝杆菌的毒力和致病性。有趣的是四种中药单体(橄榄苦苷，类叶升麻苷，6-姜酚，补骨脂乙素)能够抑制Rv0888活性。之前有关抑制剂的研究主要集中在小分子抑制剂，主要是蛋白和病原体生物合成相关的因子：例如，结构同源物ML141阻止金黄色葡萄球菌进入内皮细胞；半胱氨酸蛋白酶抑制剂K11777阻塞冠状病毒和线状病毒进入宿主细胞；在金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的ItaS表达过程中，化合物1771能阻塞磷脂酰甘油-LtaS的结合和抑制LTA的合成；使用BAS00127538抑制鲍曼不动杆菌LipidII(一个细胞壁生物合成的前体)通过。随后的药物研究转移到细胞壁蛋白和蛋白酶上：分选酶抑制剂能够用于治疗医院内感染的金黄色葡萄球菌的感染而没有标准抗生素的副作用；结核分枝杆菌磷脂酶/硫酯酶(Rv3802c)抑制剂奥利司他；通过有机催化获得的肺结核的一个毒力因子mPTPB的抑制剂；六种小分子被证实能够抑制肺炎链球菌表面核酸酶EndA31；重要的是，我们首次报道了中药单体能有效的抑制细菌的核酸酶。现在对于广泛耐药的病原体，新药研究逐渐转向中药。因此验证新的毒力因子并且筛选中药抑制剂，也许有利于我们发现新的治疗结核病的药物。

体内感染试验表明重组耻垢分支杆菌Rv0888NS/MS和Rv0888S/MS在小鼠感染17d时继续在肺中持留，组织病理学分析显示感染7d时小鼠的肺有明显的病理变化，这就意味着Rv0888也许是结核分枝杆菌的一个毒力因子，可能与结核分枝杆菌在宿主肺中的持留有关。之前研究已经报道了不同细菌核酸酶在细菌中定位：化脓性链球菌分泌到培养上清，肺炎链球菌的核酸酶定位在膜上和化脓性链球菌，猪链球菌定位在肽聚糖上。结核分枝杆菌Rv0888含有信号肽并且能分泌到培养液中。这种分泌的形式比定位在膜上的核酸酶-像肺炎链球菌EndA-对于结核分枝杆菌的致病性更有效，因为它们更容易接近它们的底物。在这项研究中Rv0888核酸酶的特性使我们更容易理解结核分枝杆菌的致病性并且也许对于我们获得新的治疗结核病的药物具有帮助作用。

附图说明

图1为重组Rv0888蛋白纯化和质谱验证；

(A)Rv0888蛋白亲和纯化的SDS-PAGE分析20mMTris-HCl-150mMNaCl-10％glycerol含有浓度梯度的咪唑洗脱Rv0888蛋白。1:500mM咪唑；2:200mM咪唑；3:100mM咪唑；4:80mM咪唑；5:70mM咪唑；6:60mM咪唑；7:40mM咪唑；8:20mM咪唑；M：蛋白分子质量Marker。(B)离子交换层析纯化Rv0888蛋白。(C)凝胶过滤层析纯化Rv0888蛋白。(D)Rv0888蛋白通过基质辅助的激光解析离子分行时间质谱肽质量指纹图谱。与Rv0888蛋白匹配一致的序列框内显示。

图2为纯化的Rv0888蛋白消化不同的核酸；

反应条件为：20mMTris-HClpH7.5and5mMMgCl237℃孵育1小时。(A)纯化的Rv0888蛋白消化不同DNA。M:DL5000DNAMarker；1:染色体DNA与20mMTris-HCl(pH7.5)；2:染色体DNA和纯化的Rv0888；3:环状质粒DNA与20mMTris-HCl(pH7.5)；4:环状质粒DNA与纯化的Rv0888；5:线性双链DNA与20mMTris-HCl(pH7.5)；6:线性双链DNA与纯化的Rv0888；(B)纯化的Rv0888蛋白消化RNA。M:DL5000DNAMarker；1:面包酵母RNA与20mMTris-HCl(pH7.5)；；2:面包酵母RNA与纯化的Rv0888；(C)脱氧核糖核酸酶活性需要阳离子。M:DL5000DNAMarker；1:环状质粒DNA与20mMTris-HCl(pH7.5)；2:环状质粒DNA与纯化的Rv0888含有5mMCaCl₂和5mMMnCl₂；3:环状质粒DNA与纯化的Rv0888含有5mMCaCl₂，5mMMnCl₂和20mMEDTA。

图3为pH或温度对Rv0888酶活性的影响；

(A)通过琼脂糖凝胶电泳分析温度对Rv0888酶活性影响。反应条件为：20mMTris-HClpH6.5,5mMCaCl₂and5mMMnCl₂孵育1h。M:DL5000DNAMarker；1:环状质粒DNA；2-11:环状质粒DNA和Rv0888蛋白，温度范围33℃-51℃，间隔2℃。(B)分光光度法定量脱氧核糖核酸酶活性，误差线代表标准差。(C)通过琼脂糖凝胶电泳分析pH对Rv0888酶活性影响。反应条件为：20mMTris-HCl,5mMCaCl₂and5mMMnCl₂37℃孵育1h。M:DL5000DNAMarker；1,3,5,7,9:环状质粒DNA–pH6.0-pH8.0,间隔0.5；2,4,6,8,10:环状质粒DNA与Rv0888蛋白–pH6.0-pH8.0,间隔0.5。(D)分光光度法定量脱氧核糖核酸酶活性，误差线代表标准差。

图4为Rv0888的脱氧核糖核酸酶(A)和核糖核酸酶(B)活性的米氏动力学试验；

反应条件为：20mMTris-HClpH6.5,5mMCaCl₂and5mMMnCl₂41℃孵育1h。对DNA和RNA的K_m值分别为：0.306±0.04mg/mL和0.012±0.01mg/mL；脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶的V_max值分别为：600.56U/mg/minand241.11U/mg/min。

图5为橄榄苦苷，6-姜酚，类叶升麻苷，补骨脂乙素抑制Rv0888降解环状质粒DNA；

反应条件为：20mMTris-HClpH6.5,5mMCaCl₂and5mMMnCl₂41℃孵育1h。(A)M:DL5000DNAMarker；1:环状质粒DNA；2:环状质粒DNA与Rv0888；3:环状质粒DNA与Rv0888含有50％乙醇；4:环状质粒DNA与Rv0888含有50％DMSO；5-7:环状质粒DNA，Rv0888与橄榄苦苷(分别为0.5mM,1mM,2mM)；8-10:环状质粒DNA，Rv0888与6-姜酚(分别为0.5mM,1mM,2mM)；11-13:环状质粒DNA，Rv0888与补骨脂乙素(分别为0.5mM,1mM,2mM)；14-16:环状质粒DNA，Rv0888与类叶升麻苷(分别为0.5mM,1mM,2mM)(B)分光光度法定量脱氧核糖核酸酶活性，误差线代表标准差。

图6为Rv0888定点突变；

通过对基因的定点突变10个氨基酸残基被替代：N131A,E267A,G303A,H353A,D387A,N389A,D438A,D472A,H473A,D472A-H473A。(A)Rv0888蛋白与endonuclease/exonuclease/phosphatase家族的其他成员的多序列比对。Query:Rv0888；#:保守残基。(B)10个蛋白突变体与Rv0888蛋白的相对活性。试验反应条件为：20mMTris-HClpH6.5,5mMCaCl₂and5mMMnCl₂41℃孵育1h。误差线代表标准差。

图7为重组耻垢分枝杆菌在小鼠肺脏的持留；

重组耻垢分支杆菌pMV262/MS,Rv0888NS/MS和Rv0888S/MS滴鼻感染BALB/c小鼠，在感染4h,24h,4d,7d,和17d时肺中细菌的载量。

图8为小鼠肺脏的组织病理学分析；

重组耻垢分支杆菌pMV262/MS,Rv0888NS/MS和Rv0888S/MS滴鼻感染BALB/c小鼠7d，PBS作为阴性对照。(A)PBS对照；无任何病理变化。(B)Pmv262/MS；无病理变化。(C)Rv0888NS/MS；轻度的肺泡上皮细胞增生。(D)Rv0888S/MS；轻度出血和肺泡上皮细胞增生。

图9为Rv0888与其他细菌胞外核酸酶的多序列比对。

Rv0888,S.pyogenesSda1(AAS09918),L.lactisYbfB(YP_001031529),S.pneumoniaeEndA(CAA38134),S.agalactiaeNucA(NP_735111)的序列通过MultAlin软件比对分析。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1结核分枝杆菌胞外核酸酶Rv0888的克隆及效果验证

一、材料与方法

1.1动物，菌株和生长条件

小鼠购自北京维通利华，试验用的所有动物都遵循中华人民共和国黑龙江省科技厅黑龙江省动物伦理委员会的动物福利和伦理，并且受哈尔滨兽医研究所动物福利委员会的认可和监督。所有的试验尽可能的使用最少数量的小鼠，并且尽最大可能的减少动物的痛苦。

耻垢分支杆菌(M.smegmatis)在含有10％OADC(oleicacid/albumin/catalaseenrichment，BDBiosciences)，0.05％Tween-80(Amresco),以及0.2％甘油(Sigma-Aldrich)的Middlebrook7H9(BDBiosciences)培养中培养。E.coliDH5α菌株用于质粒的准备，E.coliRosetta2菌株用于蛋白的表达。所有的大肠杆菌(E.coli)都在LB培养中培养。

1.2克隆与表达

Rv0888的氨基酸序列(SEQIDNO.1所示)用在线服务SignalP4.0server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测其信号肽序列，以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板，使用表1中的引物扩增rv0888(SEQIDNO.6所示),rv0888NS(不含有信号肽，SEQIDNO.4所示)以及rv0888S基因(含有信号肽，SEQIDNO.2所示)。PrimeSTARMaxDNA(TaKaRaBio)聚合酶用于PCR扩增。

表1结核分枝杆菌Rv0888基因使用的引物

rv0888扩增子连接pET-22b载体(Novagen)，在C端含有6个组氨酸标签，随后重组质粒pET-22b-Rv0888转化Rosetta2(DE3)E.coli。Rv0888蛋白以包涵体的形式表达。重组的Rosetta2(DE3)E.coli在LB培养基(含有200μg/mL的氨苄和34μg/mL的氯霉素)中37℃培养OD600至0.6-1.0，然后加入1mM的IPTG在37℃条件下诱导4h。rv0888NS和rv0888S扩增子连接pMV262载体，重组质粒pMV262-Rv0888NS和pMV262-Rv0888S电转入耻垢分支杆菌(M.smegmatismc²155)。重组耻垢分枝菌(rMS)在37℃、7H9培养基(含有0.05％Tween-80,0.2％甘油,10％OADC,50μg/mL卡那霉素)中培养至OD600至0.8-1.0。蛋白的表达情况通过SDS-PAGE进行分析。

1.3定点突变

以互补突变的引物(表2)，重组质粒pET-22b-Rv0888为模板，使用PrimeSTARMaxDNA聚合酶((TaKaRaBio))进行PCR扩增，产生10个突变体(N131A,E267A,G303A,H353A,D387A,N389A,D438A,D472A,H473A,D472A-H473A)。PCR产物用DpnⅠ酶切，破坏甲基化的DNA。突变的质粒转化DH5α感受态细胞。所有的突变体通过测序验证其正确性。

表2本文中使用的互补突变核苷酸

1.4Rv0888蛋白纯化

收集4L含有pET-22b-Rv0888的Rosetta2(DE3)E.coli细菌培养物，菌体沉淀用200mLbufferA(20mMTris-HCl,150mMNaCl,10％glycerol,pH8.0)重悬，用高压破碎机(ConstantsystemUSA,30kpsi)在4℃条件进行压力破碎，4℃1500rpm离心30min收集沉淀。沉淀用bufferA重悬超声(350W,3s/3s,4℃)10min，4℃1500rpm离心30min收集沉淀。沉淀再用80mL2M尿素重悬，于4℃搅拌4h，4℃1500rpm离心30min在收集沉淀。沉淀用80mLbufferB(20mMTris-HCl,150mMNaCl,6Murea,20％glycerol,pH8.0)重悬，于4℃条件下溶解过夜，4℃1500rpm离心30min，弃沉淀留上清。

上清用2LbufferC(20mMTris-HCl,150mMNaCl,5Murea,20％glycerol,pH8.0)透析，每隔12h换一次透析液，尿素下降1M，其他成分不变，直到无尿素。透析后的蛋白于4℃条件下15000rpm离心30min。上清过NiSepharose6FastFlowresin(GEHealthcare)纯化柱，用60mLbufferE(20mMTris-HCl,500mMNaCl,10％glycerol,20mMimidazole,pH8.0),60mLbufferF(20mMTris-HCl,500mMNaCl,10％glycerol,40mMimidazole,pH8.0)和100mLbufferG(20mMTris-HCl,1MNaCl,pH8.0)洗去未结合的蛋白。用5mLbufferH(20mMTris-HCl,150mMNaCl,10％glycerol300mMimidazole,pH8.0)和5mLbufferI(20mMTris-HCl,150mMNaCl,10％glycerol,500mMimidazole,pH8.0)洗脱目的蛋白。收集的蛋白用SDS-PAGE验证纯化效果。

亲和层析纯化的蛋白的用30kDa的超滤管(Millipore)浓缩至2mL，浓缩的蛋白过预先用bufferJ(20mMTris-HCl,pH8.0)平衡的HiLoad16/600Superdex200pg柱(GEHealthcare)，收集所有峰下的蛋白，用SDS-PAGE进行分析验证。验证的蛋白在浓缩至2mL过预先用bufferJ平衡的ResourceS5mL柱(GEHealthcare)。目标蛋白用0M-2M的NaCl线性洗脱。收集的蛋白用SDS-PAGE进行分析验证。

1.5Rv0888蛋白的质谱分析

纯化的蛋白跑SDS-PAGE，将含有目的蛋白的胶块切下，切成1mm³左右的小块，装入离心管中，水洗一次；然后用50％(v/v)ACN/25mM碳酸氢铵(100μL，pH8.0)脱色15分钟。反复3次，直至将颜色脱尽；在用蒸馏水洗涤1次；将胶块浸入30μL100％ACN中5分钟，脱水，胶块变白，然后室温抽干；加8μLTrypsin酶液(0.1mg/ml)，37℃过夜16h左右；将0.3uL已酶解的样品加0.3uL的基质(5mg/mLα-cyano-4-hydroxycinnamic-acid(Fluka)in50％(v/v)acetonitrile(Fisher)and0.1％(w/v)trifluoroaceticacid(DIMA))点到样品板上，室温晾干，用基质辅助的激光解析离子飞行时间质谱分析。选用正离子反射模式进行质谱分析，结果用4000Series软件分析。利用以下参数：肽片段分子质量容许误差(Precursortol.)：±0.2Da；二级片段容许误差(MS/MStol)：±0.8Da；酶解片段不完全(missedcleavages)：1，搜索SwissProt同源数据库验证目的蛋白。

1.6Rv0888核酸酶底物

为了检测重组核酸酶Rv0888对底物的特异性。10μL的反应体系，反应buffer为：20mMTris-HCl,5mMMgCl₂,pH7.5，分别加入0.2μg的线性dsDNA(PCR产物)，环状质粒DNA(pGEX-6p-1质粒)，染色体DNA(大肠杆菌DNA)或者面包酵母RNA(Sigma-Aldrich)与3μg纯化的Rv0888蛋白于37℃水浴锅中反应。Buffer(20mMTris-HClpH7.5)代替Rv0888蛋白作为阴性对照。60min之后，10μL的反应溶液加入1μL的10xloadingbuffer跑1％的核酸胶电泳进行分析。所有的试验重复三次。

1.7二价离子和金属螯合剂对Rv0888活性的影响

二价离子通常是脱氧核糖核酸酶或者是核酸酶所必须的。二价离子对核酸酶活性的影响测定方法如下：Rv0888蛋白与5mM的不同二价离子盐(CaCl₂,MgCl₂,MnCl₂,BaCl₂,NiCl₂)和不同的二价离子盐组合(CaCl₂+MgCl₂,CaCl₂+MnCl₂,MgCl₂+MnCl₂)在37℃条件下反应1h。结果通过1％的核酸凝胶电泳进行分析。所有试验重复三次。

1.8温度和pH对Rv0888活性的影响

使用最佳的二价离子和20mMTris-HCl缓冲液(pH6.0-pH8.0，间隔0.5)，37℃条件下反应1h检测不同pH对Rv0888活性的影响。使用最佳的二价离子和最佳的pH在33℃-51℃(间隔2℃)的温度范围内检测不同温度对Rv0888活性的影响。所有的结果都通过1％核酸凝胶电泳分析验证。Rv0888的活性用之前报道的分光光度的方法进行定量。200μL的反应体系：20μL10x反应buffer(100mMTris-HCl,50mMCaCl₂,50mMMnCl₂,pH7.5)；20μL环状质粒DNA(100ng/μLpGEX-6p-1)；10μLRv0888蛋白(1mg/mL)；150μL灭菌水。于37℃反应1h，加入8μL0.5MEDTA以终止反应。反应混合物用灭菌水稀释至2mL，用Nanophotometer^TMPealUltramicroUV-Visspectrophotometer测定260nm。在41℃条件下，每分钟降解底物的产物使260nm处吸光值增加0.001所需要的酶量定义为一个酶活力单位(U)。

1.9Rv0888核酸酶活性的动力学研究

以小牛胸腺DNA和面包酵母RNA为底物，使用分光光度法测定Rv0888核酸酶米氏动力学的参数。在41℃和pH6.5条件下，10μg纯化的Rv0888蛋白与不同浓度的小牛胸腺DNA(0.00625mg/mL,0.0125mg/mL,0.025mg/mL,0.05mg/mL,0.1mg/mL,0.2mg/mL,0.4mg/mL,0.6mg/mL,0.8mg/mL；RNA:0.00625mg/mL,0.0125mg/mL,0.025mg/mL,0.05mg/mL,0.1mg/mL)共同孵育。20mMTris-HCl(pH6.5)代替Rv0888蛋白作为阴性对照。反应1h后，加入终浓度5％冰的高氯乙酸，然后用灭菌水稀释至2mL。稀释后的溶液用Nanophotometer^TMPealUltramicroUV-Visspectrophotometer测定260nm。所有试验重复三次。

1.10Rv0888抑制剂筛选

使用以下中药单体筛选Rv0888的抑制剂：丹参素钠，天麻素，盐酸益母草碱，红景天苷溶于水；橄榄苦苷，绿原酸，刺五加苷，6-姜酚，西红花苷，姜黄素，白藜芦醇，类叶升麻苷，虎杖苷，松果菊苷，香叶木素，芦丁，根皮苷，黄芩苷，柚皮苷，杨梅素，水飞蓟素，蛇床子素，藤黄素，新藤黄酸，大黄酸，葛根素溶于50％乙醇；野漆树苷，补骨脂乙素，剑叶龙血素C，甲氧醉椒素，格列喹酮，紫檀芪，姜黄醇，菊苣酸，龙血素B，盐酸罗格列酮，左旋紫草溶于50％DMSO；α-倒捻子素，哈巴俄苷，阿魏酸松柏酯溶于50％甲醇。3μg纯化Rv0888蛋白预先37℃条件下与0.3mM不同中药单体孵育。对照用灭菌水，50％DMSO，50％甲醇，或者50％乙醇。活性参照以上所使用的测定方法。

1.11肺部感染

肺部感染试验使用5-6周龄SPF雌性BALB/c小鼠(北京维通利华)。7H9培养基培养分别含有pMV262、无信号肽Rv0888NS-pMV262或有信号肽Rv0888S-pMV262的重组耻垢分支杆菌，收集对数生长期的菌体，用2mLPBS洗两次备用。小鼠随机分成4组，每组15只，在感染之前用乙醚麻醉小鼠。50μLPBS重悬2×10⁷cfu重组耻垢分支杆菌滴鼻感染小鼠，PBS作为阴性对照。在感染4h，24h,4d,7d,和17d之后，每组处死3只小鼠。在无菌条件下取出肺脏，左肺研磨后涂于含有50μg/mL的卡那霉素LB固体平板上，37℃培养3-4天用于菌落计数。大约右肺的1/3固定于10％福尔马林中用于组织病理学分析。

每个实验都重复三次。利用Prism软件(version5.0；GraphPad,SanDiego,CA,USA)分析数据，A双侧检验用于统计数据的显著性。AP<0.05认为是显著的(***P<0.001)。

二结果

2.1Rv0888表达与纯化

SignalP服务预测结果显示Rv0888的1-31位氨基酸为其信号肽序列，利用H37Rv基因组为模板克隆不带信号肽序列的rv0888基因片段。为了便于纯化在大肠杆菌中表达了带有6xHis-tagged的重组蛋白，首先通过亲和层析纯化(图1A)。洗脱的Rv0888蛋白过离子交换柱(图1B)，最后过凝胶过滤层析柱，获得超过98％纯度的蛋白(图1C)。

2.2Rv0888蛋白质谱验证

纯化的Rv0888蛋白通过质谱分析并且肽质量指纹图谱结果提交Mascot，搜索SwissProt数据库。返回10个结果，其中得分78的是来自于结核分枝杆菌Rv0888蛋白(GeneBankAccessionNo.NP_215403.1)(见图1D)。

2.3Rv0888核酸酶活性的特异性

为了证实Rv0888的核酸酶的活性，纯化的蛋白与不同的核酸共同孵育(线性双链DNA(PCR产物)，环状质粒DNA(pGEX-6p-1载体)，染色体DNA(大肠杆菌DNA)或者面包酵母RNA)。结果显示Rv0888蛋白能降解所有的核酸底物(图2A和2B)。这些结果显示Rv0888是一个非特异性的核酸酶。

2.4二价离子和金属离子螯合剂对Rv0888活性的影响

不同二价离子对Rv0888核酸酶活性影响试验结果表明，无二价离子存在的情况下，检测不到Rv0888的核酸酶活性。酶活性在含有5mMCaCl₂和5mMMnCl₂情况下是最好的。其他二价离子盐(CaCl₂,MgCl₂,BaCl₂andNiCl₂)也显示出对Rv0888核酸酶活性的不同的促进作用，并且20mMEDTA能完全抑制Rv0888活性(见表3；图2C)。

表3二价离子对Rv0888活性的影响(误差线代表标准误差)

ND:未检出

2.5pH和温度对Rv0888活性的影响

pH和温度对Rv0888活性(底物为环状质粒)的影响结果分别显示在图3A和3C。Rv0888在pH6.0-8.0时都有活性，其中pH6.5时活性最好(图3D)。Rv0888在一个广泛的温度测试中，41℃时Rv0888活性最高(图3B)。

2.6Rv0888核酸酶活性的动力学研究

Rv0888核酸酶的动力学参数的测定，参照以下条件：底物为小牛胸腺DNA和面包酵母RNA；在41℃，pH6.5条件下，含有5mM的二价离子盐(CaCl₂和MnCl₂)。米氏动力学试验结果显示对DNA和RNA的K_m值分别为0.306±0.04mg/mL和0.012±0.01mg/mL(图4A和B)。脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶的Vmax分别为600.56U/mg/min和241.11U/mg/min(图4A和B)。

2.7Rv0888抑制剂

抑制剂筛选结果显示四种中药单体(橄榄苦苷，6-姜酚，补骨脂乙素，和类叶升麻苷)能够抑制Rv0888核酸酶活性，抑制效果随浓度增加而增强(图5A和5B)。

2.8定点突变

Rv0888与endonuclease/exonuclease/phosphatase家族同源蛋白多序列比对显示出有9个高度保守的氨基酸(N131,E267,G303,H353,D387,N389,D438,D472和H473)(图6A)。通过定点突变试验改变具体的密码子以对应的氨基酸残基，验证Rv0888蛋白的催化活性位点。

丙氨酸代替9个保守的氨基酸，产生10个突变蛋白(N131,E267,G303,H353,D387,N389,D438,D472，D473和D472-D473)。丙氨酸常用来代替其他氨基酸，因为它缺乏体积大的侧链因此不会破坏主链构象。10种蛋白突变体与Rv0888蛋白相对活性比较结果显示，D438A损失了92％的活性，H353A损失大约50％的活性，H473A和D472A-H473A损失约30％活性。N131A,E267A,G303A,N389A,和D472A分别损失约10％,4％,6％,11％和15％的活性(图6B)。

2.9重组耻垢分枝杆菌在肺中的持留和组织病理学分析

肺脏是结核分枝杆菌感染的入口，结核分枝杆菌能够粘附和入侵肺上皮细胞。利用耻垢分枝杆菌过表达Rv0888，检测重组耻垢分杆菌在肺部的致病性和持留能力。重组耻垢分枝杆菌pMV262/MS,Rv0888NS/MS和Rv0888S/MS分别滴鼻感染小鼠。在感染4h,24h,4d,7d,和17d后检测细菌在肺部的载量(图7)。在所有的时间点，Rv0888NS/MS组和Rv0888S/MS组细菌的载量没有明显差异，然而在感染4d,7d和17d后，Rv0888NS/MS组和Rv0888S/MS组的细菌载量明显高于pMV262/MS组。更为重要的是，在感染17d后，pMV262/MS组肺中的分枝杆菌几乎完全清楚干净，而Rv0888NS/MS组和Rv0888S/MS组还有一定数量的分枝杆菌存在。

组织病理学分析结果显示小鼠感染7d后，pMV262/MS组的小鼠的肺无任何病理变化，然而Rv0888NS/MS组的小鼠的肺出现轻度的肺泡上皮细胞增生，Rv0888S/MS组的小鼠肺出现轻度的出血和肺泡上皮细胞增生(图8)。以上结果表明，核酸酶活性在分枝杆菌抵御肺部组织清除方面是必须的，并且也许与分枝杆菌的致病性是有关的。