灵杆菌胞外核酸酶在短短芽孢杆菌中的高效表达

摘要

利用短短芽孢杆菌(Brevibacillus choshinensis)原核表达系统对灵杆菌胞外核酸酶(Serratia marcescens non-specific nuclease,SMNE)进行重组表达,以期获得高产量重组SMNE.利用大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭载体构建SMNE重组质粒,实现其在B.choshinensis HD31-SP3菌株中的表达.通过粗酶活检测验证其活性后,首先对温度、甘油和发酵时长等发酵条件进行优化,随后将获得的重组SMNE经亲和层析、凝胶阻滞层析分离纯化后进行酶活性质表征检测.经B.choshinensis HD31-SP3菌株重组表达的SMNE,初测胞外酶活为4.07×106 U/L.经发酵条件的优化测试,最终在培养基中加入终体积分数5％甘油,于30℃下摇瓶培养56 h,获得的发酵上清胞外酶活可达2.6×107 U/L,是未优化条件的6倍;经蛋白质纯化条件筛选,最终经一步亲和纯化后SMNE回收产量即达30～40 mg/dL,比活力为1.3×107 U/mg,为商业化对照的2～3倍.通过对该酶的酶学性质鉴定后发现:该酶最适反应条件为37～45℃,pH 8～9;在不存在Mg2+/Mn2+的情况下仍保持47％的活性,且在300 mmol/L Na+/K+条件下可保持35％～45％的活性.